ホスト表現型の検討で<em&gt;カダヤシアフィニス</em&gt;続き抗生物質治療

サマリー

この研究は、抗生物質により、皮膚や腸のmicrobiomeコミュニティ組成の変化を以下のモデル魚のホストへの影響を明らかにするためのメソッドが含まれます。

要約

医学における抗生物質の使用の共通性は、宿主に対する結果を理解することが重要であることを意味します。抗生物質は、宿主のマイクロバイオームコミュニティの多様性を低下させ、微生物コミュニティの構成を変化させることがよくあります。抗生物質関連腸炎、炎症性腸疾患、代謝障害などの多くの疾患は、微生物叢の破壊に関連しています。宿主、マイクロバイオーム、抗生物質の複雑な相互作用には、宿主とマイクロバイオームの相互作用を研究するための扱いやすいモデルが必要です。私たちの淡水脊椎動物の魚は、粘膜マイクロバイオームの構造と機能の普遍的な側面を調査し、微生物群集の変化による宿主の影響を分析するための有用なモデルとして機能します。方法には、既知の魚病原体による感染、糞便または土壌微生物への曝露、浸透圧ストレス、硝酸塩毒性、成長分析、腸の運動性の測定などの宿主の課題が含まれます。これらの技術は、宿主の表現型を迅速に決定するための柔軟で有用なモデルシステムを実証しています。

概要

抗生物質が微生物群集の不均衡を意味し、腸内毒素症につながる人間microbiomeを混乱させることができることが確立されています。抗生物質治療後の細菌叢の組成の変化は、特に腸管^1、2に、地域社会の多様性を下げる主要メンバーを削減し、地域社会の代謝を変化させることが示されています。腸microbiomeの抗生物質の乱れがクロストリジウム・ディフィシレ ^3,4及びサルモネラ ⁵にコロニー形成抵抗を低減することができます。

さらに、微生物の破壊は、多くの症候群およびヒトにおける疾患の発症に関連している（ 例えば、抗生物質に関連する腸炎、炎症性腸疾患、代謝障害、 など ）。抗生物質も広くにおける成長促進剤として農業に実装されています家畜や家禽の生産^6。これらの強力なツールの使用方法は、抗生物質耐性の急速な上昇に明らかである、担保の効果がないわけではないだけでなく、破壊されたmicrobiomeの効果は、その生息ホストとされています。多くの研究は、広域スペクトル抗生物質の使用量は細菌叢の構造と機能に長期的な影響を持っていることが示されている、まだ抗生物質破壊microbiome影響を与えるホスト生理学から副作用がサポートされるには至っていない唯一の憶測です。

ホスト、微生物、および抗生物質間の相互作用ははるかに簡潔な方法で理解されているからです。したがって、簡単かつより扱いやすいモデルは、非常に複雑な哺乳動物系に光を流すことが有利です。腸を含むヒトで粘膜表面も、最高密度や微生物の多様性、および最も親密な微生物宿主相互作用を抱きます。魚の粘膜皮膚microbiomeがsを提供していますモデル系としてeveral利点。 真骨類 （硬骨魚）は、硬骨魚類は、先天性および共生細菌群集⁷との関係共進化してきた免疫系を獲得したの両方を持っていることを意味する脊椎動物の中に発散する最古の系統の一つです。魚皮共有生理機能、免疫コンポーネント、および粘液産生細胞⁸の配置のような哺乳動物の1型粘膜表面と多くの特徴。魚皮粘膜表面の外部の場所は、実験的に操作が容易とサンプルmicrobiomeを提供しています。

西カダヤシ、 カダヤシのアフィニス（G. アフィニス）は 、交配および毒物学^{9、10、11を}研究するために過去に使用されてきたモデルの魚です。外来種として野生の小さなサイズ、人口豊かさを考えると、メートル inimalケアコスト、および丈夫な性質は、我々は、粘膜microbiomeモデルとしてG.アフィニスを開発しました。さらに、 カダヤシは、魚種では珍しいです胎生哺乳類、若い生きるために出産の生理を共有しています。私たちは、 カダヤシ ¹²とプロファイリング16Sを使用して、魚の皮膚の正常細菌叢の時点で最も広範な研究を完了しました。さらなる研究は、皮膚や腸の微生物叢の破壊広域スペクトル¹³抗生物質を使用して、次のホスト上の3つの負の効果を実証しました。

ファイブ異なる効果は、抗生物質曝露後の魚で調べました。 microbiomeの最もよく確立されたホストの利点は、病原体の競合的排除です。魚の病原体エドワードictaluriは、市販のナマズの農場¹⁴で腸溶性敗血症の発生を引き起こすことが知られています。 E. ictaluriはまた、致死的にゼブラフィッシュに感染することが示されていますクラス= "外部参照"> ^15、16、 カダヤシ ^17。水柱からこの病原体でのチャレンジは、除外の尺度として役立つことができます。個々の病原体に対する感受性と比較するように、混合した有機体の高密度化への暴露時に生存も行いました。糞便や有機物に富む土壌は微生物群集のよく遭遇源として使用しました。

細菌性腸コミュニティが行うもう一つの確立された役割は、このように、ホストの全体的な栄養摂取に影響を与える、栄養処理とエネルギーの収穫です。栄養の肉眼的測定としては、魚の体重は標準食を与えたことの1ヶ月前後で比較しました。平均的に制御魚は月の上に体重が増えた一方で、平均のような抗生物質で処理した魚は重量を失いました。体重増加の欠如のためのメカニズムは不明です。一つの可能​​性のある要因には、腸内の食物の通過時間です。 GIモティリティメソッドは通過時間を決定するためにゼブラフィッシュ（アダム・リッチ、SUNYブロックポート、私信）から適合させました。抗生物質処理した魚は、変更された通過時間を有する場合には、まだ決定されていません。

すべての生物が自然環境の中で経験した共通の課題、特に魚は、浸透圧ストレスです。 カダヤシは急性塩分¹⁸の高濃度で強調したときに迅速に対応することが示されています。驚くべきことに、展示抗生物質に変化したmicrobiomeと魚は高い塩ストレスに生存率を低下させました。この小説の表現型のメカニズムは調査中です。特に水槽内の水生動物、上の別の一般的なストレスは、有毒な窒素の形態（アンモニア、硝酸、亜硝酸）です。硝酸塩に対する生存率は、抗生物質処置群および対照魚の間で有意差はなかったです。この原稿に提示される方法は、 カダヤシや、ゼブラと同様の魚のモデル生物で使用することができます魚やメダカは、実験操作以下の魚における表現型を測定します。

プロトコル

全ての動物実験は、IACUCプロトコルの承認の下で行われ、14-05-05-1018-3-01 13-04-29-1018-3-01、および14-04-17-1018-3-01の番号を付けました。

1.動物コレクション、取り扱い、および倫理的ケア

1. 19 Lのバケットに小さなディップネットと場所を使用して、現場（http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htmで識別ガイド）からカダヤシアフィを収集します。種を同定するために目視検査を使用してください。
2. 池の水とバケツで2日間 - 1のための休憩魚。その後、バブリングAIRSTONEを通気、25℃で半分の池の水/半水道水で満たされた76または189 L水槽タンクの中に魚を移します。魚を扱うときに最低限彼らの皮膚のmicrobiomeを乱すような小さなディップネットを使用してください。
   注：魚の密度は、水槽の水の20魚/ 38 Lよりも高くてはなりません。魚は、実験前に少なくとも5日間水槽に順応しています。
3. 魚ごとのフレークフードの5 mgを毎日投与計画で魚を養います。ホー12時間明/ 12時間暗サイクルでのld魚。

すべての実験のため2​​.初期抗生物質暴露

1. 19 Lバケットに同じ水槽から各実験からすべての魚を描画、2つのグループ（未露光：抗生物質＆コントロールにさらさ処理したもの）に置きます。収集した以前のデータは、同じ水槽内の魚はコミュニティ組成にほとんど変動が皮膚microbiomesを均質化していることを示しています。 ¹²
2. 実験中、人工池の水2Lで魚を保つ（APW; 0.33グラム/ LのCaCl _2、0.33グラム/ LのMgSO _4、0.19グラム/ LのNaHCO _3）使用前にオートクレーブで滅菌します。
3. ジメチルスルホキシド（DMSO）中に50mg / mLで添加することによって、リファンピシン抗生物質のストック溶液を調製します。リファンピシンは、魚に対して非毒性である代表的な広域スペクトルの抗生物質です。ヒトおよびマウスでは、組織にうまく分配します。
4. リファンピシンストックから最終の管理3日間処理した魚の群の抗生物質曝露のためのAPWの2 Lで25μgの/ mLの濃度。 3日後、培養可能な皮膚細菌数は、前処理した魚の皮のそれと類似返すことに注意してください。
5. 並行して、APWで未処理の魚のグループを維持し、対照群として作用する水塔にDMSOの等量（APWのL当たり0.5ミリリットル）を得ました。
6. 実験は2Lでバケットに三日間の抗生物質曝露（または制御）の期間、転送魚以下、抗生物質自体から直接の影響を回避するために、魚の表現型の抗生物質改変microbiomeの効果を測定することを意図しています新鮮APW。
   1. 抗生物質は、魚の体によって除去されるように、10時間の休息期間を使用してください。ベース魚は3日間の抗生物質25μgの/ mLに暴露した実験で、この除去時間。組織グラインダーを使用して体全体を均質化、その後、ピッシングが続く脊髄をつむことにより、魚を安楽死させます。
   2. 寒天ペトリ皿の中央に0.2μmのフィルタリングの後、この懸濁液50μLを配置することにより、抗生物質の存在を決定します。小さなプラグを削除寒天、中に逆さまに無菌200μLピペットチップを押すと、このサスペンション用の穴を作ります。
   3. 栄養寒天20mLの測定量で寒天プレートを使用し、リファンピシンに感受性である指標生物、 枯草菌 、と綿棒を使用して均一に広げます。 25°CO / Nでインキュベートし、コロニーを得るために、綿棒を使用して、栄養寒天から枯草菌を得ます。 25℃で一晩インキュベートした後、阻害ゾーンを観察すると、魚の組織中の抗生物質の存在を示します。

3. Microbiome抽出

1. 2 mLの滅菌PBST（137 mMのナトリウムで満たされた無菌の15 mLコニカルチューブに魚を置くことによって、外側の粘膜表皮から皮膚microbiomeのサンプルを抽出10秒休止刻みで1分間、10の設定ではCl、10mMのリン酸、0.1％のTween-20、pH7.4）中溶液を、ボルテックス。バッファ内の洗剤および塩は、溶液中の細菌の均一な分散を促進します。同等の結果は、0.85％の食塩水で見つかりましたが、純水で細菌数を低下させました。
2. 回復バケットにコニカルチューブから魚を移します。皮膚抽出の致死性は、典型的には10％未満です。いずれかが、すぐに抽出の際にチューブ内の細菌懸濁液を分析したり、将来の分析のために-80℃で15,000×gで、店舗で室温で遠心機で2分間のスピンによって細菌をペレット化。
   注：すべての文化や生化学的分析は即時です。 DNAやタンパク質の抽出は、凍結試料から得ることができます。
3. 腸microbiomeのサンプルを入手するには、最初の滅菌ペトリ皿に魚を置きます。ピッシング続いて、手術用ハサミで頭の後ろに直接頸髄を切断することによって魚を安楽死させます、その後外部70％エタノールワイプで体を消毒。
4. 解剖後、食道後肛門前に切断することにより、全体の腸を削除します。
5. 長さは2ミリメートルと円錐管で2 mLのPBST溶液に、すべてのセクションを配置 - 小1のセクションに腸をカット。 1分間ボルテックスした後、別のきれいなチューブ（腸のセクションを描画しないように注意を取る）に上清を除去します。
   注：上清は、直接分析に使用したり、皮膚試料について述べた従来の方法によりペレット化することができ、抽出腸内細菌が含まれています。

特定病原体の4感染モデルの準備とバース

1. エドワードictaluri（E. ictaluri）の感染株を取得し、-80℃で保存された文化を保ちます。ひずみ93 - 感染ナマズから分離されたこの研究で使用さ146は、マーク・ローレンス、獣医学の大学、ミシシッピ州立大学から入手しました。
2. STRE細菌を培養する¹⁹寒天E. ictaluriメディア（EIM）と呼ばれる選択＆差動メディアとは、27℃で2日間インキュベート上にAK E. ictaluri株。
3. 培養物から純粋分離されたコロニーを移し、栄養ブロス（NB; 5グラム/ Lペプトン、4グラム/ Lの牛肉エキス）の40 mLを含む150 mLのフラスコに接種。 27℃で2日間150rpmで設定シェーカーフラスコを置きます。
4. インキュベーションの後、所望の感染用量ボリュームのE. ictaluri文化を校正するために650nmで0.2 ODの分光計の読みにPBST中での培養のサンプルを希釈します。
5. 次の魚の組織からの薬物クリアランスのために約10時間130新鮮な人工池の水のミリリットル、またはAPWを含む個々のプラスチックカップに両方の処理された（抗生物質曝露の3日後）および未処理の魚のグループを転送します。
6. そして、両グループから、クリーンAPWの130 mLを含む8オンスのプラスチックカップに再び各魚を移します。
7. 各魚にAPWにE. ictaluri文化の2.8×10 ⁶ CFU / mLの（風呂感染モデル）を含む致死量を与え、24時間27℃のインキュベーターに保ちます。
8. E. ictaluri入浴後、APWの130 mLで新しいカップに個別に魚を移します。
9. 以下の水の交換、週の期間にわたって記録魚の死亡率。魚はこのにわたって供給されていません。ナマズとは対照的に、 カダヤシは、したがって、実験的エンドポイントとして死亡率を使用することが必須であり、感染の外部徴候を示しません。

糞便＆土壌5.複数菌チャレンジ

1. 糞便処理
   1. 滅菌手袋、滅菌した50 mLコニカルチューブを使用して、前の2週間で抗生物質を受け取っていない健康なボランティア被験者からの新鮮なヒト糞便を取得します。
   2. コレクションの際に、無菌のビニール袋に糞便を収集した後、滅菌した15 mLのcに転送しますonicalチューブ。 800 mg / mlで - 500のストック溶液を得PBSTで糞便を懸濁することによってストック濃度を作ります。この濃厚な混合物は、1ミリリットルまたは開口部が大きくなるように滅菌ハサミで一番下に切断された、より大きなプラスチック製のピペットチップを使用して転送することが最善です。
   3. 処置群および対照未処理の魚のグループの最初の抗生物質曝露後、130mLの総容量とAPWにいずれかを15mg / mLまたは10mg / mLの最終濃度で糞便懸濁液を含む個々のプラスチックカップに分離します。 25℃のインキュベーター中でカップを持ちます。
   4. 2日間にわたる近い観察による糞便露光時のレコードの魚の死亡率。
2. 土壌処理
   1. 清潔なプラスチック容器に深さと場所さ15cmダウン - 豊富な有機表土（微生物の最高密度と多様性を含むべきである）約7の2キロ - 1を収集します。土壌は、コレクション次の2日以内に使用しなければならないことに注意してください。
   2. 悲惨なCTLY初期露光期間の後、APWの130ミリリットルの土壌の18.2グラムを含む個々のプラスチックカップに抗生物質処理および未処理魚の両方のグループに分けます。魚を追加する前に手で水井戸に土を混ぜます。微粒子のほとんどが一時停止し、カップの底に滞在していません。
   3. 25℃で3日間の期間中に魚を公開し、任意の死亡率を記録。

6.浸透圧ストレスチャレンジ

1. 上記のように10時間休止期間に続いて処理した後、APWの150ミリリットルで17.5 mg / mlで（300 mM）のでNaClを含む別々のカップに魚を個別。これは、魚を制御するために、完全に致死的ではない海水の典型的な塩分、（<50％）の半分であるが、効果的な浸透圧調節を必要とする、強いストレスが多いです。
2. 36時間の期間にわたって魚の死亡率を観察します。

7.硝酸塩毒性チャレンジ

1. 抗生物質博覧会後の10時間の期間の残りの魚URE、その後、APWの130ミリリットル中10mg / mLの（118 mM）の17.5 mg / mlで（206 mM）のいずれかの硝酸ナトリウム濃度を含有する個々のカップに魚を分けます。
2. 低用量および高用量のために1日間4日間にわたって死亡率を記録。

個別またはグループ化された魚の8成長解析

1. バケット内のグループとして完全な3日間の抗生物質曝露または制御期間。
2. 個人の場合は、150 mLのAPWそれぞれに8オンス発泡スチロールのカップを埋めるカップに個々の魚を転送し、初期評価のために全体重を記録します。
   1. 両方の処理および未処理群ではすべての魚のために繰り返します。ときに明確なカップでの魚は食べないので、代わりに透明なプラスチックコップの白い発泡スチロールのカップを使用してください。
3. 魚ごとに2つのペレットの標準食で毎日魚を養います。ペレットは、個々の質量の低分散（3.53±0.42 mgでそれぞれ、または8％の変動）、resultinを持っているので、ペレットはフレークではなく、使用されました食品の同様な量を受けた魚でグラム。視覚的に食べ残しのペレットを記録することにより、消費電力を監視します。消費率は、80％の上に、一般的でした。
4. 4週間にわたって毎週の終わりには、魚の重量を求めます。 、新鮮なAPWで新しいカップを準備バランスに置き、その後、体重を記録します。その後、元のカップからディップネットに魚を注ぎ、その後再び秤量された新しいカップ、に移します。魚はストレスを避けるために処理されません。
5. グループの場合は、19 LのバケツにAPWの2 Lを配置し、スケールを風袋引き。その後、グループ全体の重量を記録し、新しいAPWのバケットに転送するときに両方のグループで一緒に魚を保管してください。レコードの魚のグループ重量新しいバケットに転送することにより、月の時間スパンにわたって毎週。

9.ガットトランジットタイム

1. フルオレセイン標識の70kDaのアニオン性デキストランを使用してください。デキストランが大幅に消化し、消化管の層を横切って吸収されるには大きすぎるされていない、このように通路が腸を通る通過時間を測定します。標識デキストランは魚の餌に組み込まれました。
2. 滅菌した1.7 mLチューブに、滅菌脱イオン水の360μLとゼラチンの52 mgの（13％溶液）を添加し、配置管を60℃のヒートブロック上にゼラチンが溶融するまで、完全に溶解されます。
   1. 乳鉢と乳棒を用いて微粉末に金魚食品フレークを粉砕し、魚油の20μLとともに、チューブにこの粉末を40mgを追加します。混合した後、FITCデキストランの1.6ミリグラムを追加します。
3. μLを実験台にパラフィルム上に落下20内に高温の液体混合物を分配し、それらを迅速に冷却して凝固させます。彼らは魚が食べるにはあまりにもハードになる前に、滴は、最大4日間保存することができます。ストアは、その後、加湿滴を保つ密封されたプラスチック容器、内部の滅菌水に浮かべされたペトリ皿の半分の上にパラフィルムを配置することによって冷蔵庫に低下します。
4. ただ供給する前に、四半期には、カミソリの刃を使用してセクションに落下します。 Styroに魚を順化供給なしで個別に2日間、発泡カップ（注：のみ未露光制御の魚を使用しました）。魚とカップに食品の四方を置き、彼らはそれぞれが食べる食品の何個分の30分間の魚を観察します。
5. 監視期間を開始するには、ディップネットを使用して、APW 80mlでカップに個別に魚を移します。 2時間ごとに、そっと手でAPWを旋回し、その後4℃で標識した1.7 mLチューブに1 mLのサンプルと店を取ります。 36時間のサンプルを取ります。
6. 検定終了後、同時に全ての試料の蛍光分光光度計、と録音蛍光、。キュベットに全体の1 mLのサンプルを配置し、520 nmで495 nmでの励起および発光を使用して測定された蛍光を記録します。

結果

抗生物質曝露¹³から魚ホストの影響を研究するために用いた実験装置の全体概略図を図1Aに表され、魚の皮膚（ 図1B）および腸（ 図1C）microbiomesを抽出するための技術を含みます。以前のデータは、総皮膚培養可能数は、早期治療で低下している間、それは3日後に治療前のレベルに戻っていることが明らかになったので、三日は、露光の抗生物質の期間に選ばれました。一方、コミュニティの組成物は、16Sプロファイリングによって決定されるように、強く変更されています。そのため、3日の期間は、ほぼ同じ密度の変化したコミュニティからの影響を分析するために最適であるべきです。種の数を省略することが、寒天プレート上のコロニー数を使用して、その文化の分析に注意してください。皮膚microbiome分散法の効率は（ 図1B 5 CFU / gの魚の重量）と同じサスペンション手順に...

ディスカッション

いくつかの課題は、魚組織に枯渇させる薬物のための抗生物質治療後の清潔なAPWで休止期間を必要とします。休止期間がスキップされている場合は、抗生物質の存在は、アッセイは、細菌への曝露を伴う場合は特に、結果を混乱させることができます。ホスト上の微生物の合計数に大きな変化なしに変更されたmicrobiome組成物からの影響を調べるために、抗生物質の露光中に予備実験監視microbiome組成物（16Sプロファイリングまたは全ゲノムシーケンシング）と人口密度（定量PCRを介した16S定量は）だろう必須。 3 dは、このシステムで最適であるが、ホストおよび/または抗生物質を変更すると、再キャリブレーションを必要とするであろう。

生物医学研究の代表的なマウスモデルは、一般microbiome研究に利用されています。最も一般的な魚のモデルは、ゼブラフィッシュです。粘膜がMicroBの構造と機能の普遍的な性質のより良い理解を得るためにiomesと宿主相互作用、新規および非定型モデルが必要です。私たちのWT魚のモデルは、他のモデルが原因ラボ起こし動物近親交配^24<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リファンピシン	カルバイオケム	557303-1GM
硝酸ナトリウム	シグマ アルドリッチ	S5506
フルオレセイン標識 70 kDa 陰イオン性デキストラン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1823
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 錠剤	カルバイオケム	6500-OP	錠剤を水に溶かして PBS を作り

ます