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方法論記事

ヘアレスマウスの耳たぶにおける生体顕微鏡および血栓誘導

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DOI：

10.3791/55174

⸱

2017年4月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery "Otto Koerner", Rostock University Medical Center, 2Department of General, Thoracic, Vascular and Transplantation Surgery, Rostock University Medical Center, 3Institute for Experimental Surgery, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

無毛SKH1時間の時間のマウスの耳のモデルを調べ、微小血管床における従来の外科的準備なしに微小循環及び光毒性血栓誘導の生体内蛍光顕微鏡検査を可能にします。したがって、ヘアレスマウスの耳は、微小血管血栓形成、血栓の発生、及び血栓溶解の間の複雑な相互作用を研究するためのインビボモデルにおいて優れています。

要約

血管疾患の血栓性合併症は、工業国における罹患率および死亡率の1つの主要な原因です。血栓形成の間の細胞および非細胞性血液成分間の複雑な相互作用のために、生理学および血栓症の病態生理の信頼性試験は、in vivoで行うことができます。そこで、この記事では、ヘアレスマウスにおける耳のモデルを提示し、微小循環、血栓形成、および血栓進化のin vivoでの分析に焦点を当てています。生体内蛍光顕微鏡および各蛍光色素の静脈内（IV）アプリケーションを使用して、耳介における微小循環の繰り返し分析を容易に外科的準備を必要とすることなく、行うことができます。さらに、このモデルは、創傷治癒、再灌流障害、または血管新生を含む、さまざまな問題のin vivo試験のために適合させることができます。要約すると、無毛マウスの耳にVIVのための理想的なモデルであります生理学的または病態生理学的条件下で、別の全身または局所治療に対する反応の評価のための皮膚微小循環のOの研究。

概要

本資料の目的は、微小循環、血栓形成、および血栓進化の直接観察及び分析のためのヘアレスマウスの耳介に適用される生体顕微鏡の技術を記述することです。千中1の発生率では、静脈血栓症は、まだ罹患率の一般的な原因です。診断、予防戦略、および療法が近年開発されてきたが、静脈血栓症の三分の一は、肺塞栓症1として現れます。動脈血栓症は、工業国における最も一般的な死亡原因である心血管疾患において重要な役割を果たしています。アテローム性動脈硬化プラークの破裂に基づいて動脈血栓症は、心臓発作、腸間膜梗塞、および脳卒中に関与しています。すべての手術は、血液成分への内皮下の構造を公開して血流の動態を変化させ、患者を固定します。下肢のエンドプロテーゼ手術、臓器Tにransplantationとフラップ手術血栓症は、合併症の頻繁な原因です。特に、微小血管の血栓症は、頻繁に起因する臨床症状の不足のために、不可逆的な損傷を引き起こします。同様に、微小血管血栓症は、とりわけ、血栓性血小板減少性紫斑病、敗血症、播種性血管内凝固、抗リン脂質症候群、および慢性静脈不全、を含むいくつかの疾患において重要なルールを果たしています。

血栓症の治療および予防のためのいくつかの新しい薬が近年開発されたが、抗血小板薬と抗凝固薬はまだ、副作用を持っていないこと拮抗薬、および長時間の効果を備えています。これらの欠陥は、救急医療における問題につながります。このように、より多くの研究はほとんどin vitroでシミュレートすることはできない血栓症、中に発生する複雑なプロセスを解明するために必要とされます。

ヘアレスSKH1時間の時間のマウスは、ロンドンの動物園で1926年に発見されました。第14染色体上の遺伝子欠損に、動物は、生後一日の後にその毛皮を失う10.これは血管の生体顕微鏡によく血管新生した耳介にアクセスできるようになります。耳の平均厚さは300μmです。それは軟骨で区切られた真皮の2層から構成されています。軟骨の凸状の背側では、3つの維管束は、耳たぶを入力してください。アピカル血管弧と基礎シャントが3つのバンドルを接続します。細静脈は、200μmの（基礎）および10μM（頂端）との間の直径を有します。クローズ噛み合っ毛細血管は、空の毛包2を囲みます。ヘアレスSKH1-HRの時間マウスの解剖学は、耳介血栓症研究のための強力かつコスト効率の高いモデルになります。

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プロトコル

全てのin vivo実験（7221.3-1-006 / 15）は、動物の保護及び実験動物の管理と使用に関するNIHガイド（実験動物資源研究所、国立研究評議会）にドイツの法律に従って行いました。

動物の1.一般キーピング

  1. 4〜6週齢のオスSKH1時間の時間のマウスを用いた実験を行います。 20〜25 gの体重を有する動物を使用します。
  2. 水と食料を自由摂取への安定したアクセスを、病原体のない施設で、24〜26°Cと約60％の相対湿度の標準化された条件の下で動物を保管してください。
  3. 1つのケージに5匹の雄動物に追いつきます。彼らの幸福のための動物の筐体の間に寝具や濃縮材料を提供します。

動物の2.前準備

  1. マウスの重量を測定し、それぞれの薬剤（ 例えば、カンナビノイド、5メートルをロードインスリン注射器にG / kg体重（BW））。血栓誘導する前に、薬剤30分を管理します。
  2. 親指と人​​差し指と小指を有するマウスの尾の間のマウスの首を保持することによって、動物を伸ばし、腹部の左下の象限に薬物を腹腔内（IP）を注射します。 15分間ケージに戻って動物を置きます。
  3. ケタミン（90ミリグラム/ kg体重）およびキシラジン（25ミリグラム/ kg体重）で麻酔を準備します。血栓誘導の15分前に、マウスを麻酔。 、ケージにマウスを入れて少し尾を引いて、インスリン注射器で麻酔薬のIPを注入。
  4. 麻酔の発症まで戻ってケージにマウスを置きます。十分な麻酔を確認するには、鉗子で尾をつまみます。
  5. インスリン注射器に、（5％、150 kDaのFITC-デキストラン）解凍フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランの負荷0.05ミリリットル。注射器を充填しつつ、小さなintravenouslので、全く気泡が残っていないことを確認Yは、式（IV）-administered気泡が動物のために致命的であることができます。
  6. フェイスダウン位置にある加熱板上で麻酔マウスを置き。 37°Cまで加熱プレートを調整します。
  7. マウスの角膜に眼軟膏を入れてください。皮膚を消毒し、滅菌器を使用しています。
  8. 右耳の頭側及び尾側縁にポリプロピレン7/0の2本の縫合糸ステッチ。エッジに近く、できるだけ基部（ 図1B）の近位としてステッチを配置します。
  9. 背の位置にマウスを移動します。接着剤ストリップを使用してacrylglassプラットフォームに、すべての足を固定してください。前歯下で縫合糸をフックし、接着剤ストリップでacrylglassに縫合糸を貼り合わせて背屈にヘッドを位置付けます。
  10. 操作実体顕微鏡下のプラットフォーム上で動物を移動さ。 16X倍率を使用してください。

左頸静脈およびFITCデキストランの注射の調製

注意：マイクについて右耳のroscopy、左頸静脈を準備します。

  1. メスを用いて、頭尾方向に首の左側の皮膚に5mmの切開を作成します。マイクロピンセットやmicroscissorsと皮下組織を解剖。ポリエステル8/0縫合糸を持つか、電気凝固とのライゲーション交差船のどちらか。
  2. 容器に触れることなくマイクロピンセットとmicroscissorsを使用して、その外膜からの静脈を解放します。
  3. 蛍光色素の注射用に調製インスリン注射器を使用してください。慎重に静脈を穿孔することなく、マイクロピンセットで血管壁をつかみます。シリンジで膨張した血管壁を貫通し、FITCデキストランを静脈注射します。
  4. 綿棒を使って注射器を引き抜く後に出血を止めます。血を避け、耳の汚染を染めます。

生体内蛍光顕微鏡のための右耳の4ポジショニング

  1. acrylglass cに加熱板上に動物を転送します加熱プレート用スロットと耳を位置決め0.5 CM-高い平面とonstruction。
  2. 接着ストリップを使用して、加熱板上で動物の顔を下に固定します。耳の先端部分が平面上に平らに配置することができるように、耳（ 図1B）0.5 CM-高い平面の横耳の基部に比較的強い凸軟骨を置きます。
  3. 耳を位置決めするためにacrylglass面に常温の一滴の0.9％NaClを加えます。その凹面の腹側に事前に決められた縫合糸は、0.9％のNaClの降下に、下方に向けて、右耳を置きます。綿棒を使用して、塩化ナトリウムの低下を吸収し、毛管力がacrylglassに耳面を添付してみましょう。
  4. 耳の位置を固定するacrylglassに縫合糸をテープで固定します。
  5. 耳の凸状の背側に、0.9％の室温のNaClの一滴を加えます。慎重に目に入るの基礎血管を圧迫することなく、耳に1つのカバースリップ（直径0.5cm）を置きます電子耳。綿棒を使用して、カバースリップと耳のターゲット容器間の距離を最小化するために、カバースリップの下からできるだけ多くのNaClを除去します。

5.生体内蛍光顕微鏡と右耳の血栓誘導

  1. （ - ; 510; LP：520 FT 490から450nm）FITC-デキストラン可視化のための生体蛍光顕微鏡を調整します。光源として可変100-W水銀ランプを使用します。 DVDレコーダに高解像度、白黒CCDカメラを接続します。
  2. 生体蛍光顕微鏡のデスクに固定された誘拐耳有する加熱プレートを含むacrylglassに動物を転送します。
  3. 直径400の順行性血流と60μmの - - 600ミクロン/ sの20X倍率（20X / 0.95開口数）と20％の光強度を用いて、静脈血管50を検索します。
  4. 63X magnificatioの浸水のためにカバースリップに室温の水の一滴を追加します。n個の目的（63X / 0.95開口数）。 1mmの直径のカニューレを有する注射器を使用して、顕微鏡の対物レンズのドロップを置きます。水滴とカバースリップと客観的に連絡するだけの十分な水を追加します。
  5. すぐに水滴を適用した後、直径及び血流のオフライン測定のために20％の光強度で20秒間容器を記録し始めます。
  6. FITCデキストランの注入後の血栓誘導5分を開始します。この目的のために、100％に光の強度を上げます。
  7. 血栓誘導の間、血流をチェックするために、30秒の期間内に2秒間顕微鏡の開口部を閉じます。血流が持続する場合には、再び開口部を開きます。停止血流の場合には、30秒間容器を観察します。
    注：フローが30秒以上または血液が逆行性に流れた場合、まだ立っている場合、血管が閉塞として分類されています。 orthograde血流が再開した場合、完全に絞りとCONTINを開きます上述したように血管閉塞が起こるまで血栓誘導UE。早期の血栓誘導の間に、開口部が血液の流れを確認するために閉鎖された時間は、ほぼ連続落射照明を維持するために、可能な限り短くしていることを確認してください。後、血栓成長の間、容器をより少ない蛍光色素で灌流されるので、連続的に観察することができます。
  8. 選択し、耳あたり5本の血管を閉塞します。 FITC-デキストランの注射後、約1時間に顕微鏡下で血栓誘導の時間を制限します。

6.フォローアップ活動

  1. 経皮ポリプロピレンに6/0縫合糸を使用して首の創傷閉鎖を実行します。
  2. 麻酔からの回復時には、ケージに戻ってマウスを置くと、赤外光を用いて動物を温めます。
  3. 血管や血流の速度の直径の測定を可能にするソフトウェアへのDVDレコーダーから記録されたデータを転送します。
左耳の_title "> 7。審査

  1. 動物が回復し、48時間、すべての注入されたFITCデキストランを排除しましょう。
  2. 右頸静脈及び左耳の調製、この時間を上記の手順を再実行します。

8.組織Asservation

  1. 左耳の生体蛍光顕微鏡検査後、試料0.5mlを眼の眼球後静脈叢からの血液のガラスキャピラリーを用いました。静脈血、毛細管を通って流れるまで慎重にねじ込み運動と内側眼瞼角を貫通しています。エチレンジアミン四酢酸（EDTA）血液チューブにプローブを収集します。
  2. 採血後、尾静脈内に500ミリグラム/ kg体重ケタミンを注射することによって動物を犠牲。
  3. 白血球、赤血球、血小板、ヘモグロビン、およびヘマトクリット値の定量的評価のための血液分析器を用いて血液細胞を数えます。
  4. 遠心分離機10メートルのために2,500×gで、室温で、残りのEDTA血。ピペットで、さらなる調査のための血漿を凍結します。
  5. はさみを使って、耳介をカットし、組織学的検査のために4％ホルムアルデヒド中でそれらを修正。

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結果

血栓形成のカンナビノイドの治療の効果

FITC-デキストランの0.05ミリリットルの注射の際に、光毒性血栓誘導は、内皮病変と頭頂血小板プラグ（ 図2及び3）の形成をもたらします。本研究では、カンナビノイド（5ミリグラム/ kg体重）またはビヒクルの腹腔内注射後に血栓誘導は全て細静脈（ 図4）における血栓性血管閉塞をもたらしました。ビヒクル処置動物において、血栓形成までの時間は430秒（：、：637個の75 パーセンタイル 330 S 25 パーセンタイル ）でした。どちらのカンナビジオール（CBD）もWIN55,212-2（WIN）投与は、血管閉塞時間に関連する影響を示しました。 240：しかし、内因性カンナビノイドのアナンダミドは大幅に270秒（25 パーセンタイルに血栓形成に必要な時間と血...

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ディスカッション

SKH1-HRの時間マウスの耳たぶに成功血栓誘導のためのいくつかの重要なステップがあります。トラブルシューティングのために、プロトコルの各ステップは、括弧内に示されています。

6週間と表皮の低角化と - 検査条件は、4歳で若い動物では理想的です。古い動物では、血管の視覚化の品質は、皮膚表面と標的血管（ステップ1.1）との間のより高い距離に悪い未満同等です。

検査領域におけるFITCデキストランの血管外漏出を防ぐために、固定縫合糸は、できるだけわずかに配置する必要があります。ステッチに近接して、蛍光色素は、滲出および血管外空間と血管との間のコントラストを減少させることができます。色素のこの溢出はゆっくりと進行します。良い、前FITC-デキストランの注射15分上記のように縫合糸が縫合されている場合生体顕微鏡の検査条件は、（ステップ2.8）を確保しています。

FITCデキストランをゆっくりと腎臓から排除されます。高分子デキストラン（150kDaの）を...

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開示事項

著者は、開示することは何もありません。

謝辞

著者は何の確認応答がありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SKH-1 / hrマウスチャールズリバー477は他のベンダーから購入できます 
標準実験用食品ssniff SpezialdiaetenV1594-0 他のベンダーから購入できます 
実体顕微鏡ライカの操作 M651/M655 他のベンダーから購入できます 
生体内顕微鏡ZeissAxiotech Vario 100 他のベンダーから購入できます 
対物レンズ (20X/0.95) ツァイス20x / 0,50 W;プラン-NEOFLUAR 他のベンダーから購入できます 
対物レンズ (63X/0.95)ツァイス63x/0.95 W;アクロプラン 他のベンダーから購入できます 
白黒CCDカメラ パイパー FK 6990 IQ-S 他のベンダーから購入できます 
DVDレコーダーパナソニックDMR-EX99V 他のベンダーから購入できます 
塩化ナトリウムブラウン5/12612055/1011他のベンダーから購入できます 
ケタミン10%ベラファームF3901-6は他のベンダーから購入することができます 
キシラジン2%バイエル6293841.00.00は、他のベンダーから購入することができます 
FITC-デキストラン 5%シグマ 46945-100MG-Fは他のベンダーから購入できます 
デキサパンテノール5%眼軟膏バイエル6029009.00.00は他のベンダーから購入することができます 
ホルムアルデヒド4%シグマHT501128-4Lは他のベンダーから購入できます 
DMSOSigma472301他のベンダーから購入できます 
カバースリップ5 x 5 x 1 mmMenzelL4339は他のベンダーから購入できます 
粘着ストリップLeukosilk4683400は、他のベンダーから購入することができます 
遠心分離機ベックマン・コールターCLGS 15は、他のベンダーから購入できます 
血球計数装置シスメックスKX-21 A6980は、他のベンダーからもご購入いただけます 
EDTA血液チューブSarstedt201,341は、他のベンダーから購入できます 
綿棒Sanyo604-A-1は、他のベンダーから購入することができます 
赤外線Beurer5/13855は、他のベンダーから購入することができます 
シングルユースシンリンジブラウン 2020-08は他のベンダーから購入できます 
インスリン注射器ブラウン9161502他のベンダーから購入できます 
使い捨て皮下注射針ブラウン465 7640は、他のベンダーから購入することができます 
エンドツーエンドのキャピラリーSarstedt19,447は、他のベンダーから購入できます 
ヒーティングプレートKlaus EffenbergOP-T 185/03は他のベンダーから購入できます 
はさみ14.5cmAesculapBC259Rは他のベンダーから購入することができます 
ニードルホルダーAesculapBM081Rは他のベンダーから購入できます 
マイクロ鉗子AesculapBD331Rは他のベンダーから購入できます 
マイクロハサミAesculapOC496Rは他のベンダーから購入できます 
メス21ルハウゼン11.000.00.511は他のベンダーから購入することができます 
Prolene 7-0EthiconXNEH7470は他のベンダーから購入できます 
プロレン6-0エチコンXN8706。P33他のベンダーから購入できます 
電気焼灼ServopraxH40140は、他のベンダーから購入することができます 
アクリルガラスパッド一体型加熱、0.5 cmハイプレーン
ははダーは

参考文献

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