方法論記事

のシナプス変調を分析キイロショウジョウバエ長時間の光照射後の感光体

DOI：

10.3791/55176

⸱

2017年2月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience of Disease, Center for Transdisciplinary Research, Niigata University, 2Brain Research Institute, Niigata University, 3Image and Data Analysis Facility, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 4Graduate School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology (Titech), 5Dendrite Differentiation, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、光への長期曝露後に遺伝的にコードされた分子マーカー、およびそれらの調節で強調、数およびキイロショウジョウバエ の光受容体におけるシナプスアクティブゾーンの空間分布を定量化する方法を示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経系には適応し、様々な刺激に応答する驚くべき能力を持っています。この神経調整は、主に、シナプスレベルでの可塑性によって達成されます。アクティブゾーン（AZ）は、神経伝達物質の放出を媒介し、足場タンパク質の密なコレクションで構成されているシナプス前膜の領域です。 キイロショウジョウバエ （ ショウジョウバエ ）光受容体のAZSは、自然環境光に長時間さらさ後の分子リモデリングを受けます。したがって、神経活動のレベルは、AZの分子組成を再配置し、機能出力の調節に寄与することができます。

免疫組織化学への露光セットアップの準備から出発し、このプロトコルは番号、空間分布、およびショウジョウバエの光受容体でAZSでのシナプス分子の非局在化のレベルを定量化する方法について詳しく説明します。画像解析SOFを使用してtware、GFP融合AZコンポーネントBruchpilotのクラスタは、各R8感光体（R8）軸索末端のために同定されました。検出されたBruchpilotスポットは自動的に個々のR8の軸索に割り当てられていました。軸索に沿ったスポット頻度の分布を計算するために、我々は、カスタマイズされたソフトウェアのプラグインを実装しました。各軸索の始点と終点を手動で定義し、各Bruchpilotスポットの位置は、始点と終点の間の接続線に投影されました。 Bruchpilotクラスタの数に加えて、我々はまた、クラスタ内のBruchpilot-GFPの非局在化のレベルを定量化しました。これらの測定は、具体的に刺激に異なる環境条件の下で単一ニューロンにおける空間分解シナプスのダイナミクスを反映しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シナプス機能の変調が正確に応答したり、環境刺激の変化に適応するための神経系の顕著な能力に貢献しています。前シナプス小胞の放出確率を調整すると、シナプス強度1を制御する 1つの方法です。シナプス小胞のリリースでは、アクティブゾーン（AZ）、シナプス前膜2の専門領域で起こります。 AZは、特定のタンパク質3、4のカセットことを特徴としています。 AZアセンブリに貢献し、ほとんどのタンパク質は非常に線虫、昆虫および哺乳類5に保存されています。最近の研究では、神経活動のレベルは今度は両方のin vitroおよびin vivo 6,7 における機能出力のレギュレーションに寄与するAZの分子組成を調節することを示唆しています> 8。我々は以前、感光体AZSは、自然環境光9への長期曝露後に、ショウジョウバエの分子リモデリングを受けることがわかりました。この状態で、我々はBruchpilot（BRP）陽性AZSの数は、感光体の軸索で減少したことを観察しました。

BRP / CAST / ELKSファミリータンパク質は、脊椎動物と無脊椎動物のシナプス10でAZSの基本的なビルディング・ブロックです。 ショウジョウバエのBRP変異体では、小胞の放出は11、12を抑制されている誘発。 BRPの17 C末端アミノ酸残基は、 ショウジョウバエの神経筋接合部（NMJ）13、14におけるシナプス小胞のクラスタリングのために不可欠です。これらの研究は、AZの組織と機能におけるこの分子の中心的な役割を実証しました。最近開発された遺伝的ツール、組換えとシナプスタギング（スター）、BRPと内因性発現レベルで単シナプス解像度15において、特定の細胞型にインビボで観察することができます。このツールは、それが実現可能な定量的に複雑な中枢神経系におけるシナプスの内因性のダイナミクスを評価することができます。

共焦点顕微鏡から得られたデータに基づいて、シナプスの定量化を含むいくつかの研究が行われています。シナプスの変化は、長さ、面積、体積、密度を測定し、洗練されたソフトウェアアプリケーションに基づいて数をカウントすることによって評価されています。例えば、フリーウェアImageJがショウジョウバエ NMJ 16における全シナプスの面積とシナプス密度を測定するための定量方法を提供します。前と後シナプスマーカーの共局在部位の数は、ImageJソフトウェア・プラットフォーム17上で利用可能なプラグイン「涙点アナライザ」を用いて定量化されています。また、マルチパーadigm数値計算環境ベースのプログラム、シナプス検出器（SYND）は、自動的に蛍光マーカーで標識されたニューロンの樹状突起をトレースし、その後細胞体18からの距離の関数としてシナプスのタンパク質レベルを定量化することができます。ソフトウェアシナプス点分析（SynPAnal）は、共焦点または蛍光顕微鏡から取得したニューロンの2D画像の迅速な分析のために設計されています。このソフトウェアの主な機能は、タンパク質涙点19の密度と強度の自動かつ迅速な定量化です。最近、自動学習ベースのシナプス検出アルゴリズムは、3D可視化支援分析（Vaa3D）ソフトウェア21を利用して、3次元20におけるシナプス数の定量のために生成されています。

商業用画像解析ソフトウェアは、シナプスの定量化のための強力なツールです。例えば、蛍光標識された神経伝達物質受容体またはシナプス前AZコンポーネントは、Cの単一シナプスの分解能で3次元で定量化されたシナプスの数百人が急速に単一のサンプル内で特徴づけることができるように、22またはショウジョウバエの嗅覚システム23、24 エレガンス 。

ここでは、カスタマイズされた画像解析ソフトウェアプラグインその数、分布との分子成分の濃縮のレベルを含む、半自動的にAZSの複数の側面を分析することを可能にするマルチパラダイム数値コンピューティング環境において実施することにより方法を提示しますAZ。したがって、この複雑な解析は、私たちは、異なる環境条件下で軸索終末におけるシナプスのコンポーネントの動態を評価することができました。私たちは、大人のハエ光受容体の出力シナプスでの露光量の影響を調べました。手順は3つのステップで行われる：1）露光量、2）切開、免疫組織化学及び共焦点イメージング、および3）画像解析のための準備。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルに記載の実験手順は、もっぱらショウジョウバエで動作することを含む、ドイツと日本の動物福祉法に供されていません。

1.露光条件

  1. 感光体R8ニューロン（R8s）にBRP-GFPを視覚化するためのsensless-フリッパーゼ （SENS-FLP）とbruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP（BRP-FSF-GFP）15を運ぶハエを準備します。細菌人工染色体（BAC）内のゲノム遺伝子座をコードするBRPは、このBRP-FSF-GFP構築物を作製するために変更されました。この修正されたBACを運ぶハエではBRP-GFPの発現は、内因性調節配列の制御下にあるが、FRT-STOP-FRTカセット15のsensless-フリッパーゼ媒介除去後R8の光受容体に限定されます。 SENS-FLPはほとんどR7sでフリッパーゼを発現しないことに注意してください。
  2. 12時間の李にハエを保ちます幼虫の段階から羽化（ 図1A）まで25℃でGHT / 12時間暗サイクル（LD）。
  3. 羽化後6時間とフライ食品を含む新しいバイアルに入れます - ハエに0を収集します。
  4. 3段階（41センチメートルの高さは21センチベース、4センチメートルの厚さと各ステップ13センチ高さ）（ 図1B）とアクリル樹脂製の透明ラックにバイアルを設定します。
  5. デジタル露出計（ 図1C）を使用して、千ルクスの平均強度で照明を提供するために、ラックとLEDパネル間の距離を調整します。
  6. 小さなインキュベータ（ 図1（a）に25℃で12時間明/ 12時間暗サイクル（LD）、または一定の光（LL）、一定の暗闇（DD）：次のいずれかの条件の下で3日間- 1のためのハエを保ちますおよび1C）。

2.解剖、免疫組織化学およびイメージング

  1. FO 4％で固定し、鉗子でハエの脳を解剖Chaoptinに対する一次抗体（1：50）と、前の実験手順25に基づいて、光受容体の可視化のための第二の抗体とrmaldehydeと免疫染色。簡単に言えば：
    1. PBS中の0.1％トリトンX-100（0.1％PBT）を準備します。この溶液を、抗体、組織浸透を改善するために使用されます。
    2. 、CO 2パッドの上にハエを麻酔正しい遺伝子型を分類し、0.1％のPBTで満たされたペトリ皿に移します。
    3. 口先の下に鉗子を固執し、他の鉗子でそれぞれ左右の眼をやってのけます。
    4. 口先と脳に取り付けられた気管を削除します。
    5. RTで0.1％PBTの150μLを含む1.5 mLのチューブに鉗子で脳を転送します。
    6. 2.1.3 10分間の反復内 - 2.1.5、できるだけ多くの脳を得ました。
    7. チューブに16％ホルムアルデヒドの50μLを加え、ピペッティングにより混合します。
    8. 部屋で固定液に脳をインキュベート50分間温度。
    9. チューブで脳を残すように注意を払って、マイクロピペットで0.1％PBTの200μLで3回洗浄します。
    10. 最後の洗浄後、0.1％のPBTを削除して、一次抗体溶液を追加し、以下のように調製：0.3％PBT（PBS中0.3％トリトンX-100）抗Chaoptin抗体の4μL（最終希釈1の196μLに追加：光受容体の可視化のための50）。
    11. 4°CO / Nで一次抗体溶液中で脳をインキュベートします。
    12. マイクロピペットで0.1％のPBTの200μLで洗浄3倍。
    13. 最後の洗浄後、0.1％のPBTを削除し、二次抗体を含む0.3％PBTの200μLを追加します。
    14. 4°CO / Nで暗所でそれをインキュベートします。
    15. マイクロピペットで0.1％PBTの200μLで3回洗浄します。
  2. 取り付けのために、約2センチDISTAで顕微鏡スライドの中央にマイクロピペットでマウンティング培地（2μLずつ）二つの小さな滴を入れて互いにNCE。
  3. 2カバースリップ、各液滴の上に1を置き、約0.2ミリメートルのカバースリップとの間の狭い隙間を残します。
  4. カバースリップの上に取り付けメディアの15μLを置き、マウンティング培地中にマイクロピペットで脳を追加します。
  5. 解剖顕微鏡下では、最大2つのカバースリップ（ 図2）との間の狭い隙間に腹側と脳を配置。
  6. 上にカバースリップを置き、試料（ 図2）を固定するための明確なマニキュアを使用してカバースリップの端をシールします。
  7. 共焦点顕微鏡を用いて脳の画像を得ます。 63X油浸対物レンズ（1.4 NA）と2.6倍デジタルズームを使用してください。 0.5μmのステップサイズを有する第2の視神経節髄質の20以上の光学切片を生成します。

スポット、Surfaceオブジェクト、開始点と終了点の3世代

  1. 、競合製品の数を定量化するために、ibutionとBRP-GFPの涙点の非局在化レベルは、画像解析ソフトウェアで、共焦点顕微鏡により得られた積層体を開き、3D画像（ 図3A）を再構成します。この研究におけるステップはIMARISで行われたことに注意してください。
  2. 各R8の軸索末端のためのスポット検出モジュールによってBRP-GFPの斑点を特定します。
    1. 「新しいスポットを追加します」を選択します。
    2. アルゴリズムの設定で「利息のセグメント領域のみ」を選択します。手動髄質におけるR8の軸索末端を選択します。
    3. BRP-GFP信号のソースチャンネルを選択します。
      注：R7およびR8光受容体の軸索は、抗Chaoptin（ 図3A）で免疫標識しました。唯一のR8は、しかし、BRP-GFPの斑点が含まれているので、簡単に（ 図3A）区別することができました。さらに、R8のエンドポイントは、M3の髄質層へのエントリポイントで抗Chaoptin陽性軸索の間伐によって同定することができました。
    4. 推定XY径トンを設定します。スポット検出中のO 0.35ミクロンとオフチェック「バックグラウンド減算」。
    5. フィルタタイプに「品質」を選択し、自動的にフィルタリングします。 [完了]をクリックします。
    6. 他のR軸索（ 図3B）のために3.2.1 T-3.2.5から繰り返します。
  3. R8の軸索にBRP-GFPの非局在化のレベルを測定するために、各軸索のための「表面」機能（ 図3C）で表面オブジェクトを生成します。
    1. 「新しいサーフェスを追加」を選択します。
    2. アルゴリズムの設定で「利息のセグメント領域のみ」を選択します。その後、手動で髄質にR8の軸索終末を選択します。
    3. 光受容体のソースチャンネルを選択します。
    4. 「スムーズ」をオフを確認してください。
    5. しきい値に「絶対強度」を選択します。
    6. チェック「有効にします」。 「シードポイントの直径は「0.5μmです。
    7. フィルタタイプ「品質」と「ボクセルの数」を選択し、電話交換をフィルタリング的。
    8. 「編集」に移動し、他の非興味深い軸索上に生成表面の部分を削除します。
    9. 他のR軸索（ 図3C）のために3.3.8 - 3.3.1から繰り返します。 （注）一部の表面オブジェクトがあるため薄さとM2層における光受容体で弱い信号の中断されたが、それらはまだ開始されてからエンドポイントへの単一のオブジェクトとして考えられました。
  4. 延髄の神経網内の各ニューロンに沿っBRP-GFPの涙点の分布を特定するために、測定ポイント機能（ 図3D）との始点と終点を定義します。
    1. 「新しい測定ポイントを追加」を選択します。次に、「編集」を選択し、表面オブジェクトの上部と交差するように、「物体の表面 "を選択します。
    2. ために、M1層におけるR軸索の表面オブジェクトの上に測定点を置きます。これらは、現在の開始点（ 図3D）として定義されています。
    3. 「新しい測定ポイントを追加」を選択します。次に、「編集」を選択し、表面オブジェクトの底部と交差するように、「物体の表面 "を選択します。
    4. ために、M3層におけるR軸索の表面オブジェクトの底に測定点を置きます。これらは現在、エンドポイント（ 図3D）のように定義されます。
  5. GFPチャネルからのバックグラウンド信号を減算するには、M6層（ 図3E）における二つのR軸索のための表面オブジェクト、スポット、開始点と終了点を生成。
    1. 「新しいサーフェスを追加」を選択します。
    2. アルゴリズムの設定で「利息のセグメント領域のみ」を選択します。その後、手動でM5とM6層との間にR7の軸索末端を選択します。
    3. 感光体のソースチャンネルを選択します。
    4. 「スムーズ」をオフを確認してください。
    5. しきい値に「絶対強度」を選択します。
    6. フィルタタイプ「品質」と「ボクセルの数」を選択し、自動的にフィルタリングします。
    7. 「新しいスポットを追加する」を選択;。
    8. 「手動で編集し、自動作成をスキップ」を選択します。
    9. 「オブジェクトのセンター」を選択し、3.5.1から発生する表面オブジェクトの内側の領域にスポットを追加 - 3.5.6。
    10. 別のR7の軸索端末用3.5.9 - 3.5.1から繰り返します。
    11. 「新しい測定ポイントを追加」を選択します。次に、「編集」を選択し、M6層でのR7の軸索終末の先端の2つの表面のオブジェクトの上に測定点を置きます。これらは今、スタートポイントとして定義されています。
    12. 「新しい測定ポイントを追加」を選択します。次に、「編集」を選択し、M6層でのR7の軸索終末の先端の2つの表面のオブジェクトの底に測定点を置きます。これらは現在、エンドポイント（ 図3E）として定義されます。

スポットの数の4計算、カスタマイズされたイメージデータ解析ソフトウェアでスポット周波数とBRP-GFPの濃縮のレベルの分布

  1. ファイルをコピーしますIMARIS XT MathWorks社のMATLABフォルダに「XtquantifySynapseSNR.m」と「機能」のフォルダ。この研究における計算はMatlabので実装カスタマイズされたプラグインを使用して行われたことに注意してください。ウェブサイト（からプラグインをダウンロードしてくださいhttps://github.com/cmohl2013/synapse_trafo ）。
  2. n個のスポット、nは表面および2測定点オブジェクト、（ - 3.4 3.1から調製）をそれぞれ含むn個の測定点でデータセットを開きます。最初の測定ポイントオブジェクトは、すべての軸索の開始位置を定義します。第二の測定点オブジェクトは、すべての軸索の終了位置を規定します。両方の測定点オブジェクトは、測定点の数が同じ（すなわち、軸索の数である）を有する必要があります。
  3. 6対シナプス検出atsushis画像処理>> CUSTOM>を実行します。
  4. 画像解析ソフトウェアのメタデータと変更ピクセルサイズをチェックし、それが正しくない場合。
  5. perfのためのチャンネルを選択しますスポット領域および細胞質領域の強度解析（BRP-GFPを有するチャネル）のormance。
  6. 結果をエクスポートするためのファイル名を定義します。
  7. パーセントでビンと軸索の長さの数を定義します。 「10」と「100％」（ 図4Aおよび4B）などのビンの範囲としてビンの数を入力します。
  8. BRP-GFPの非局在化分析のためのスポットや他の細胞質領域の領域を定義します。スポットは、「0.35ミクロン」と「50ミクロン」として周辺エリアの幅と半径を入力します。スポット半径は（1涙点を中心に0.35μmの直径、）涙点のGFPシグナルのための領域を定義します。周辺エリアの幅は、細胞質領域（涙点を中心に直径50μm、が、唯一のR8を含む細胞質内のすべてのスポット領域を除く）（ 図4Aおよび4C）にGFPシグナルのための領域を定義します。
  9. すべてのニューロンのマスクが処理されるまで待ちますPDFファイル（ 図4Bおよび4C）と、スプレッドシートのさらなる分析のためのcsvテーブルとしてエクスポート。 CSV形式の表には、スポットの数、「細胞質領域」とすべてのR8の軸索のための各ビンに「スポット」での最大信号強度の平均信号強度を含んでいます。
  10. バックグラウンド信号の減算に3.5で調製したデータセットを開きます。
  11. 4.9から4.3から説明したように画像処理を行います。
  12. 合計数の平均とスプレッドシート（ 図4Dおよび4E）でBRP-GFPの涙点の分布を計算します。
  13. バックグラウンド信号に平均強度を差し引いた「スポット」で最大強度で割った「細胞質領域」における平均強度の比によってスプレッドシートのBRP-GFPシグナルの非局在化の平均値を計算する（ 図4F） 。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ショウジョウバエの複眼は〜780個眼、光受容体のそれぞれを含む8種類（R1-8）を含みます。 R7およびR8プロジェクト、彼らは層M6とM3、それぞれ26でシナプスを形成する第二の視神経節、髄質、への軸索。感光体R8、アクティブなゾーンの分子組成上の光への長期曝露の影響を調べるために、我々は、星の方法15を利用しました。 BRPの内因性発現レベルは、蛍光SENS-FLP由来R8光受容体で表現フリッパーゼとBRP-FSF-GFPでの終止コドンをひっくり返すことによって標識しました。 25°C（ 図1A）で同じ時間LL、LDまたはDDで羽化後3日-ハエは1のために維持しました。千ルクスの光にハエを公開するには、ハエは、アクリル樹脂ラック（ 図1B）に設定し、同じ距離に維持しました小さなインキュベーター（ 図1C）におけるLED...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、同じ光強度にハエを公開するために、光の条件を準備する方法を示しました。我々だけでなく、シナプスマーカーの涙点の数を定量化しただけでなく、空間的に軸索に沿ってシナプスの密度を解決し、細胞質領域におけるマーカータンパク質の非局在化のレベルを測定することができます。これらの三つの評価は、私たちは、異なる環境条件での単一ニューロンレベルでのシナプスダイナミクスの詳細を評価することを可能にします。我々のプロトコルは、異なるシナプスタンパク質にも点状の信号を含む任意のデータに適合させることができます。

プロトコル内の重要なステップは脳の実装です。 ショウジョウバエの光受容体は、第二の視神経節髄質への軸索を投射します。取り付けられた脳を正しく顕微鏡スライド上に配置した場合は、各感光体の軸索は、直接的にスキャンすることができます。正確な実装は、画像解析softwaと光受容体の選択を行います簡単に機能を再。各感光体領域は、涙点の数と、非局在化レベルをカウントするために手動で選択する必要があります。 [スタートとエンドポイントは、手動で選択されています。 1は、定量を行う...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、原稿上の有用修正、議論とコメントのT.Stürnerに感謝しています。 SL Zipurskyフライ株式を提供します。画像処理を行うMSchölling。画像解析部は、A.柿田の研究室で行いました。この作品は、革新的な分野でのスタートアップのためのアレクサンダー・フォン・フンボルト財団と日本学術振興会親睦海外研究（AS）、JSPSフェロー（SH-S。）、グラント・イン・エイド（24800024）、（25110713）、持田によってサポートされていました武田、稲盛、第一三共、東レ財団（TS）、DZNEコア資金（GT）とDZNE光学顕微鏡施設（CM）。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バイアルハイテック、日本MKC-20
プラグサーモフィッシャーサイエティフィック、アメリカAS-275
アクリル樹脂製のカスタマイズされた透明ラック 新新株式会社高さ41cm、底面21cm、厚さ4cm、高さ13cmの各ステップで
クールインキュベーター三菱電機、日本CN-40A
LEDパネルミスミ、日本LEDXC170-W
デジタル露出計CEMDT-1301
フライパッドトッケン、日本TK-HA03-S
シャーレ(35 x 10 mm)Greiner Bio-One International, Germany627102
PBS tabletTakara, JapanT900
Triton X-100和光,日本 160-24751
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20
1.5 mL tubeSarstedt, GermanyA. 152X
Formaldehyde 16%NEM, Japan3152
ピペットマン P-200ギルソンF123601 
Pipetman P-20GilsonF123600
Pipetman P-2GilsonF144801
抗チャオプチン抗体DSHB24B10
Alexa568-conjugated anti-mouse antibodyLife TechnologiesA-11031
VECTASHIELD Mounting MediumVector Laboratories, Inc.H-1000
顕微鏡スライド (76 x 26 mm)Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany
Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm)Zeiss, Germany474030-9000-000
工業用顕微鏡Olympus, JapanSZ61-C-SET
実体顕微鏡 LightingOlympus, JapanKL 1600 LED
共焦点顕微鏡ツァイス、ドイツLSM780
イマリスビットプレーン、スイスバージョン 7.6.4 以上
MatlabThe MathWorks, Inc., USA
Excel for Mac マイクロソフト

参考文献

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