ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT のステージ固有操作を使用します。
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この記事について
サマリー
要約
再生医療の主な目的の 1 つは、生成、造血幹細胞 (造血) ひと多能性幹細胞 (hPSCs) 由来のメンテナンスです。最近まで、造血に hPSCs を区別するための努力は主に HSC 可能性を欠いて、代わりに卵黄嚢造血のような造血前駆細胞を生成しています。これらの結果の造血前駆細胞は、様々 な成人造血器疾患、リンパ系統の特にそれらの in vitro疾患モデル作製のためのユーティリティ限られている可能性があります。しかし、最近ここの概要ステージ固有分化プロトコルを使用して hPSCs からエリスロ骨髄リンパ多能決定的な造血前駆細胞を生成する方法を説明しました。基底膜マトリックス コーティング容器に hPSCs の酵素分解による胚様体 (EBs) が形成されています。EBs は、中胚葉に GSK3β 阻害剤の CHIR99021 でその後決定的な造血プログラムに指定されている組換え BMP4 によって区別されます。また、原始造血は PORCN 阻害剤の IWP2 によって指定されます。造血はさらに VEGF 組換え添加および支持造血サイトカインを介して駆動されます。このメソッドを使用して生成された結果の造血前駆細胞疾患と発達モデル、体外に使用される可能性があります。
概要
ひと多能性幹細胞 (hPSCs) ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) を包含として定義され、適切な成長条件下で自己更新を受けていない唯一のユニークな能力を持っています。また、あらゆる細胞に分化する能力が 3 つの胚葉から派生: 外胚葉、中胚葉、内胚葉の1。これらのユニークな能力のためは、hPSCs は、再生医療、疾患モデル作製、細胞ベースの治療2に偉大な約束を保持します。種類の細胞は、hPSCs から正常に分化されている、1 つの重要な課題は大人っぽい hPSC 由来造血幹細胞 (造血)、決定的な造血前駆細胞の in vitro仕様。
HPSCs から人間の HSCs の発展に 1 つの可能性があります障壁ヒト胚3で複数の造血プログラムの存在であります。現れる、「原始的な造血、」と呼ばれる最初のプログラムは胚の卵黄嚢の組織内で起きると巨核球、マクロファージ、赤芽球前駆細胞 (EryP フロン) の一時的な生産が最大の特徴です。特に、このプログラムは、造血に上昇を与えないもそれは T および B リンパ球前駆細胞に上昇を与えるが。ただし、卵黄嚢では、エリスロ骨髄前駆 (EMP4,....
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プロトコル
1 試薬
- 取得細胞ライン; hESCs または hiPSCs 1、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) 29, OP9 DL4 実質 30 ,。 31.
- 試薬調製
- PBS でゼラチンの 0.1% の w/v ソリューションを準備します。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい、早かった後 4 ° C で保管を。
- ゼラチン コーティングの容器を準備します。0.1% ゼラチン液 1.5 mL でコート 6 よく料理します。室温で 15 分間インキュベートします。使用の直前に残りのゼラチン液を吸い出しなさい 。
- 15 %v/v FBS と 1 x 抗生物質 IMDM、MEF メディアを準備します。使用する前に 2 mM L グルタミン 400 μ M monothioglycerol (MTG) と補完し、4 で保存 ° C
- は、20 %v/v ノックアウト血清交換 (KOSR) を含む DMEM/F12 のソリューションとして hPSC 培地、1 x 非必須アミノ酸 (NEAA)、1 x 抗生物質、55 μ M β-メルカプトエタノール、2....
- PBS でゼラチンの 0.1% の w/v ソリューションを準備します。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい、早かった後 4 ° C で保管を。
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結果
HPSCs からプリミティブと決定的な造血前駆細胞の誘導を描いた回路図は図 1に示します。中胚葉分化、造血前駆仕様に続いての 2 ~ 3 日中に発生するカノニカル WNT によるパターニングします。
代表フローサイトメトリーによる解析とコロニー形成 hPSC 由来造血分化文化のセルロースの試金は図 2のとおりです。IWP2 扱われる分化培養を行えば、異なる CD34+CD43−と CD34低/−CD43+人口、CHIR 扱われる分化文化が < 1 %cd43 の 8 日目で細胞の+分化 (図 2 a、B).......
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ディスカッション
このプロトコルでは、プリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の分化の急速、血清無料、実質無料のメソッドについて説明します。プリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の中胚葉性仕様は、一意にカノニカル WNT シグナルの小分子阻害剤を悪用当社のプロトコルを使用して確実に実現できます。CHIR9902133 GSK3β 阻害剤によるステージ固有 wnt シグナルの活性化を生じさせる決定的な造血中胚葉、一方 IWP234 PORCN 阻害剤による WNT 阻害は原始造血中胚葉26を指定します。注記のうち、このメソッドは確実与えない上昇 (図示せず) engraftable HSC のような人口に。ただし、この方法で生成された決定的な造血前駆細胞は、潜在的な将来の医療アプリケーションを強調表示生着の遺伝子による潜在的な35に適しています。
成功 hPSC 分化に重要な決定要因は、hPSCs から形成され.......
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
この作品は、血液部門内科学、ワシントン州大学医科大学院によってサポートされています。CD は、国民の中心、肺および血の協会からの T32HL007088 によって支えられました。CMS は、血液学者賞のアメリカの社会によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Iscoveの変更されたDulbeccoの媒体(IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovineの血清(FBS)、ESの細胞評価 | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovineの血清(FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-グルタミン、200 mMの解決 | 生命技術 | 25030-081 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | 生命テクノロジー | 15070-063 | |
| 0.25% トリプシン-EDTA | ライフテクノロジー | 25200056 | |
| 0.05% トリプシン-EDTA | ライフテクノロジー | 25300054 | |
| ゼラチン、豚皮、タイプA | シグマ-アルドリッチ | G1890 | |
| アルファ-MEM | ライフテクノロジー | ズ 12000-022 | |
| DMEM-F12 | コーニング | 10-092-CV | |
| ノックアウト血清代替 | ライフテクノロジー | 10828028 | "KOSR"非 |
| 必須アミノ酸 (NEAA) | ライフテクノロジー | 11140050 | |
| b-メルカプトエタノール 55 mM 溶液 | ライフテクノロジー | 21985023 | |
| 塩酸 | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| フラクション V, ウシ血清アルブミン | フィッシャーサイエンティフィック | BP1605 | |
| ハムズ F12 | コーニング | 10-080 | |
| N2 サプリメント | ライフテクノロジー | 17502048 | |
| B27 サプリメント、ビタミンA無し | ライフテクノロジー | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | ライフテクノロジー | ズ 10639011 | 「SP34」 |
| 成長因子減少マトリゲル | コーニング | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| ヒト血清トランスフェリン | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| モノチオグリセロール(MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| コラゲナーゼ B | ロシュ | 11088831001 | |
| コラゲナーゼII | ライフテクノロジー | ズ 17101015 | |
| DNaseI | カルバイオケム | 260913 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&Dシステムズ | 233-FB | |
| BMP4 | R&Dシステム | ズ314-BP | |
| アクティビンA | のR&Dシステムズ | 338-AC | |
| VEGF | R&Dシステム | ズ293-VE | |
| SCF | R&Dシステム | ズ 255-SC | |
| IGF-1 | R&Dシステムズ | 291-G1 | |
| IL-3 | R&Dシステム | ズ203-IL | |
| IL-6 | R&Dシステムズ | 206-IL | |
| IL-7 | R&Dシステム | ズ207-IL | |
| IL-11 | R&Dシステムズ | 218-1L | |
| TPO | のR&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| FLT-3 リガンド (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | 希釈率 1:100;T細胞アッセイ |
| CD8 PE クローン RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | 希釈 1:10;T細胞アッセイ |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | 希釈 1:100;EHTアッセイ |
| CD34 PE-Cy7 クローン 8G12 | BD Biosciences | 348801 | 希釈 1:100;造血性内皮 |
| CD43 FITC クローン 1G10 | BD Biosciences | 555475 | 希釈 1:10;造血性内皮 |
| CD45 APC-Cy7 クローン 2D1 | BD Biosciences | 557833 | 希釈 1:50;T細胞アッセイ |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | 希釈 1:50;EHTアッセイ |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | 希釈 1:20;T細胞アッセイ |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | 希釈 1:50;造血性内皮 |
| CD184 APC クローン 12G5 | BD Biosciences | 555976 | 希釈 1:50;造血性内皮 |
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | 希釈率 1:10,000;T細胞アッセイ |
| OP9 DL4細胞 | Holmes、R.およびJC Zuniga-Pflucker。コールドスプリングハーブプロトック、2009年。2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q 浄水システム | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 インキュベーター | 37 °C に設定 | ||
| マルチガスインキュベーター | 37°C、5% CO2、5% O2 | ||
| 6 ウェル組織培養プレート | コーニング | 353046 | |
| 24ウェル組織培養プレート | コーニング | 353226 | |
| 6ウェル低接着組織培養プレート | コーニング | 3471 | |
| 24ウェル低接着組織培養プレート | コーニング | 3473 | |
| 35mm組織培養皿 | コーニング | 353001 | |
| ブラントエンドニードル、16ゲージ | コーニング | 305198 | |
| 3ccシリンジ | コーニング309657 | ||
| 5 mLポリプロピレン試験管 | コーニング | 352063 | |
| 5 mLポリスチレン試験管 | コーニング | 352058 | |
| 15 mLポリプロピレン円錐形 | コーニング | 430791 | |
| 50 mLポリプロピレン円錐形 | コーニング | 430921 | |
| 2 mL血清ピペット | コーニング | 357507 | |
| 5 mL血清ピペット | Corning | 4487 | |
| 10 mL 血清ピペット | Corning | 4488 | |
| 25 mL 血清ピペット | Corning | 4489 | |
| セルスクレーパー | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL クライオバイアル | Corning | 430488 | |
| 5 mL 試験管 40 & micro;M細胞ストレーナー | Corning | 352235 | |
| 40 & micro;M細胞ストレーナー | コーニング | 352340 | |
| 細胞培養遠心分離機 | |||
| バイオセーフティフード | |||
| FACS AriaIIまたは同等の | |||
| LSRiiまたは同等の | |||
| FlowJoソフトウェア | TreeStar | ||
| ウォーターバス | 37°C | ||
| で設定0.22 以上Mろ過システム | コーニング | ||
| オートクレーブ | |||
| 4C冷蔵庫 | |||
| -20C冷凍庫 | |||
| -80C冷凍庫 |
参考文献
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic developme....
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再版と許可
