方法論記事

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

DOI：

10.3791/55199

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2017年3月10日

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1Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Molecular Biology Program, Université de Montréal

この記事について

サマリー

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私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。

要約

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ハイスループットスクリーニング（HTS）は、現在、生化学的反応または細胞プロセスを調節することができる化学物質を同定するための主力です。バイオテクノロジーの進歩と小分子の高い翻訳電位を、薬物発見における革新的なアプローチの数はHTSの使用で復活関心を説明している、進化してきました。癌領域は、移植関連合併症または自己免疫疾患を標的とする新たな免疫調節化合物の同定のために作られていない大きな突破口と、現在、薬物スクリーニングのための最も活発な研究領域です。ここでは、簡単に新しい免疫調節化合物の同定のために適合さビトロネズミ蛍光ベースのリンパ球アッセイで小説を提示します。このアッセイは、Nur77プロモーターはT-又はB-細胞受容体刺激によりGFPの発現を駆動するトランスジェニックマウス由来のTまたはB細胞を使用します。 GFP強度が反映されるように標的細胞の活性化/転写活性は、我々のアッセイは、細胞/生物学的応答に与えられた化合物（複数可）の効果を研究するための新たなツールを定義します。例えば、一次スクリーニングは、免疫調節活性を表示160の潜在的なヒットの同定につながった「標的仮説」の非存在下で4,398の化合物を用いて行きました。したがって、このアッセイの使用は、インビトロ / インビボ検証研究を進める前に、大きな化学ライブラリーを探索する創薬プログラムに適しています。

概要

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ハイスループットスクリーニング（HTS）が広く新しい治療分子の同定のため、または新しい医学的適応症におけるFDA承認薬物の再配置のために採用実績のある戦略です。 1はこれまでのところ、達成HTSの成功は、以前に発見された薬の茄多によって測定することができます。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブは、乳癌、シタグリプチンの治療のために使用されます。ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）阻害剤、抗高血糖薬として使用され、慢性骨髄性白血病の治療のために使用される経口BCR-ABLチロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブは、もともとによって発見され承認された薬物の長いリストのいくつかの例を表していますHTS。製薬業界の生産は最近、新しい化学物質の発見で不足に苦しんできたが2、成功した薬剤の発見の可能性が前臨床カンジダの数の増加によって改善することができます調節生物学/生化学的特性を表示するTES。したがって、表現型スクリーニングのために適合新しいHTSアッセイの開発は、新薬のヒットの発見のために重要な薬理学的なツールを提供する可能性を提供することができます。 3、4、5、6はまた、HTSは....

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プロトコル

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全ての動物プロトコルはモントリオール大学の動物実験委員会によって承認されました。何のバイタルサインが頸椎脱臼に続いて観察されなくなるまで、マウスをCO 2の緩やかな吸入によって安楽死させました。手順は、動物を人道的方法で安楽死させ、動物ケアに関するカナダ評議会の勧告に従ってたことを確認するために、認定者によって行われました。

脾細胞中およびフローサイトメトリーバッファーの調製

  1. 70％エタノール洗浄生物学的フードの下にあるすべての手順を実行します。
  2. 予め温めロズウェルパーク記念研究所の70ミリリットル（RPMI）滅菌チューブ中（市販およびフィルタリング500ミリリットル容量の滅菌ボトルで供給）と場所1640 1xの媒体を削除します。削除培地は、プロトコルの後半で使用されます。
  3. 50mlで残りの430 mLのRPMI 1640 1Xを補う不活性化ウシ胎児血清（FBS）、5mLのペニシリン/ストレプトマイシン、5mLのHEPES 5mlの非必須アミノ酸、5 mLのピルビン酸ナトリウム、濾過0.05mLの（1M）の2-メルカプトエタノール。
    注：熱衝撃的な細胞を避けるために、37ºCに設定された水浴を使用して、事前暖かい脾媒体。これは、細胞のアポトーシスの誘導を回避することが重要です。
  4. フローサイトメトリーバッファーを調製するために、98ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（P....

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結果

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HTSアッセイの設計

本明細書中で蛍光アッセイを設計するときに、2つの重要な要素は、考慮されました。まず、T-またはB細胞の活性化は、病気（ 例えば 、移植片対宿主病）を表すことになるで生理学的状態を再現する必要がありました。第二に、細胞活性化の評価は、高感度で定量的な方法を用いて行うべきです。それはこれらのニーズに対応するように蛍光は、今日HTS読みアウトするための主要な選択肢の一つです。 10、16 堅牢なGFP読み出しがNur77 GFPを以下に得ることができるように、in vitroまたはin vivoの両方で TまたはB細胞刺激由来<.......

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ディスカッション

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いくつかの読み出し方法は、高感度で信頼性の高いHTSアッセイの開発のために利用されています。これらは、比色、発光または蛍光方法が挙げられます。比色法は、アップを設定するのは簡単ですが、それらは、細胞が試験されている妨害または破壊し得る化学物質の複数回添加を必要とします。薬理効果は、特定のエンドポイントで評価されるように23加えて、彼らは生物学的応答の動的な評価を許可していません。自動化されたHTSを使用する場合はさらに、この方法は、高価なロボットアームを必要とするかもしれません。これらの要因は、その面倒な要件と低感度にHTSを目的とした比色読み取りアウトはあまり互換性を持たせます。 23発光の比色アッセイの代替として提案されているが、HTSにおけるこれらの発光試験の適用は、通常により細胞溶解の必要条件に限定されます。他の非溶解プロトコルデたにもかかわらずvelopedは、生物発光信号の強度は、検出された生物発光シグナルおよび細胞活性の実際の変化との間の不一致を引き起こし、例えばルシフェリン吸収、補因子の利用可能性、pH、および培地または緩衝液.......

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開示事項

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

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この作品は、モントリオール大学が提供するメルクFrosstスタートアップ資金によってサポートされていました。我々は彼らの議論、コメントやフィードバックのための免疫学および癌における研究所でのハイスループットプラットフォームから博士ジャンDuchaineとドミニクSaloisに感謝したいと思います。 Moutih Rafeiは、フォン・ド・ラ・RECHERCHEエンサンテケベックジュニア1賞を保持しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Nur77GFPマウスジャクソン実験用マウス No. 016617インハウスコロニーを動物施設に設立しました 
96ウェル-U培養プレート、無菌VWRインターナショナル10062-902磁気ビーズ
70µを使用したT細胞活性化;m細胞ストレーナー、滅菌済みCorning Inc.352350脾細胞細胞懸濁液の生成
5 ml ポリスチレン丸底チューブ、滅菌済みCorning Inc.352058脾細胞細胞懸濁液
50 mlポリプロピレン円錐底チューブの生成、滅菌VWRインターナショナル89039-656 脾細胞細胞懸濁液の生成
針なし10mlシリンジ、滅菌済みベクトン、ディキンソン&カンパニー305482脾臓をつぶす
T-25培養フラスコGreiner Bio-One690 175活性化中にB細胞をインデュダブテする
5ml細胞培養皿、滅菌済みGreiner Bio-One627 160脾臓ペ
ニシリン-ストレプトマイシンをつぶす (10,000 U/mL)WISENT Inc.450-200-EL  脾細胞培地の成分
RPMI 1600 と重炭酸ナトリウムとL-グルタミンWISENT Inc.350-002-CL 脾細胞培地の成分
MEM非必須アミノ酸WISENT株式会社321-010-EL 脾細胞培地の成分
HEPESフリーアシッド 1 MWISENT Inc.330-050-EL 脾細胞培地の成分
ピルビン酸ナトリウム溶液 (100mM)株式会社WISENT600-110-EL 脾細胞培地の成分
ウシ胎児血清(FBS) WISENT株式会社080-910 脾細胞培地およびフローサイトメトリーバッファーの成分
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)WISENT株式会社311-010-CLフローサイトメトリーバッファーの成分
2-メルカプトエタノール (55 mM)モフィッシャーサイエンティフィック21985-023脾細胞培地の成分
T細胞単離キットStemcell Technologies19851T細胞を単離するには
B細胞単離キット B細胞単離キットStemcell Technologies19854B細胞を単離するには
マウスT-アクチベーター CD3/CD28 超常磁性ビーズサーモフィッシャーサイエンティフィック11452DT細胞を活性化するには 
細胞分離磁石Stemcell Technologies18000T細胞を分離し、磁気ビーズを除去するには 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (英語)115-006-068B細胞を刺激するために
組換えマウスIL-7Peprotech217-17 活性化中のT細胞の生存をサポートするため
組換えCD40LR&D Systems8230-CL/CFB細胞を刺激する
抗マウスCD3抗体BD Pharmingen561799フローサイトメトリー用T細胞を染色する
抗マウスCD19抗体BD Pharmingen553786フローサイトメトリー用B細胞を染色する
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A3184224時間インキュベーション後の細胞の再懸濁
Opera Phenix ハイコンテントスクリーニングシステムPerkinElmer Inc.HH14000000GFP/Hoechstシグナルの解析
サー

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S.

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T Cell IsolationB Cell IsolationNur77 GFP MouseMagnetic Bead SeparationGFP Expression AnalysisSmall Molecule ScreeningImmunomodulatory Compound IdentificationCell Culture Incubation

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