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方法論記事

ネズミ大動脈挫傷：効率的

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DOI:

10.3791/55201

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2017年6月11日

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1Department of Surgery, Baltimore Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Surgery, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Physiology, University of Maryland School of Medicine, 4Center for Vascular and Inflammatory Diseases, University of Maryland School of Medicine

この記事について

サマリー

心血管手術（バイパス手術、血管形成術、またはステント留置）後の再狭窄は、これらの処置の耐久性を低下させる重大な問題である。理想的な療法は、平滑筋細胞（VSMC）の増殖を阻害し、内皮の再生を促進する。インビボでのVSMC増殖および内皮機能の同時評価のためのモデルを記載する。

要約

血管形成術かバイパス手術かにかかわらず、動脈再構築は、内皮破壊および血管平滑筋細胞（VSMC）増殖を引き起こす医原性外傷を伴う。一般的なマウスモデルは、頸動脈および大腿動脈などの小型血管を研究する。本明細書では、VSMC増殖および内皮バリア機能の両方を大きな血管において同時に評価することができるin vivoシステムを記載する。我々は、C57BL / 6マウスの損傷に対する腎臓下大動脈反応を研究した。大動脈は、左腎静脈から大動脈分岐部に損傷を受け、コットン先端のアプリケータを用いて5秒間30回の経壁破砕を行った。形態学的変化は、従来の組織学を用いて評価した。大動脈壁の厚さを内腔表面から外膜まで測定した。 VSMCの増殖を実証するために、DAPIおよびα-アクチンによるEdUの統合および対比染色を用いた。内膜肥厚形成の既知のモデレーターであるERK1 / 2の活性化が抑制されたウエスタンブロット分析によって採取した。炎症の影響は、B細胞、T細胞、およびマクロファージの免疫組織化学によって決定した。内皮のEnフェイス切片を走査型電子顕微鏡（SEM）で視覚化した。 Evans Blue染色で内皮バリア機能を測定した。経壁損傷により大動脈壁が肥厚した。この損傷はVSMC増殖を誘発し、損傷後3日目に最も顕著であり、ERK1 / 2の早期活性化およびp27 kip1発現の減少を引き起こした。傷害は、B細胞、T細胞、または血管壁におけるマクロファージの浸潤を増加させなかった。傷害は部分的な内皮細胞の脱落および細胞 - 細胞接触の喪失を引き起こした。傷害は、内皮バリア機能の有意な喪失をもたらし、これは7日間後にベースラインに戻った。マウス経壁鈍的大動脈傷害モデルは、大血管におけるVSMC増殖および内皮バリア機能の両方を同時に研究するための効率的なシステムを提供する。

概要

再狭窄 （バイパス手術、血管形成術、またはステント留置）後のこれらの処置の耐久性を低下させる重大な問題である。すべての血管再生手順は、再狭窄に悩まされている。再狭窄（薬物溶出ステントおよび薬物被覆バルーン）を防止するための現在の戦略は、血管平滑筋細胞（VSMC）および内皮細胞増殖（EC）の両方を阻害する。結果的に、これらの介入は、VSMC媒介性再狭窄を予防するが、内皮の再生も妨げる。損なわれていない内皮がなければ、出血合併症のリスクのある現場血栓症のリスクを低下させるために、患者は強力な抗血小板薬を必要とする。理想的な療法は、内皮の再生を促進しながらVSMCの増殖を阻害するであろう。したがって、 インビボで VSMC増殖および内皮バリア機能を同時に研究する必要がある。

現在、再狭窄のマウスモデル1 。これらのモデルには、頸動脈結紮および大腿動脈ワイヤ損傷2が含まれる 。大動脈モデルは、ステント配置3 、バルーン損傷4 、および大動脈同種移植5を含む 。現在のモデルはすべて制限されています。頸動脈結紮は、フロー媒介新生内膜病変を生じ、内皮傷害を有しない。さらに、頚動脈および大腿動脈の両方は、ヒトの血管よりも数倍少ない細胞層を有し、それらの翻訳値を制限する。直径約1.3mmのマウス大動脈は、臨床的に関連する（冠状動脈）ヒト動脈に近似する唯一の血管である（3）。

マウス大動脈モデルの翻訳能にもかかわらず、現在のモデルには限界があります。これらのモデルには、高度なマイクロサージカルスキルと、血管形成バルーンやステントなどの特殊な機器が必要です。ここでは、VSMC増殖を同時に誘導し、内皮バリア機能を破壊する新規で再現可能な技術である。

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プロトコル

倫理声明：動物の取り扱いに関するプロトコールは、メリーランド大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）（プロトコールナンバー0416009）によって承認され、AAALAC国際規格に従って実施された。

1.外科手術

  1. 麻酔技術
    1. 生存手術に使用されたすべての器具を121℃で30分間蒸気滅菌して滅菌する。
    2. 精密気化器を介して送達された100％O 2および2.5％イソフルランを有する誘導タンクを介して麻酔を誘導する。誘導後、イソフルランを中止し、チャンバをO 2でフラッシュする。フェイスマスクを介して1.5-2％のイソフルランおよび吸入により 1L /分のO 2で麻酔を維持する。
    3. 人員を保護するために、誘導チャンバとフェイスマスクの両方を排ガス吸着用の木炭スカベンジャーに取り付けます。デモで適切な麻酔面を確保する有害な刺激（トウピンチ）に対する反応がないことを前提としている。
    4. 手術中に熱的サポートを提供するために等温パッドを備えた外科用トレイからなる手術野を作成する。追加の等温パッドは、回復ケージ内の動物に熱的な支持を提供する。
  2. 動物の準備
    1. 10〜12週齢の雄C57BL / 6マウスについて以下の調査を行う。
    2. 動物の腹部の腹面の毛を胸骨から鼠径部に脱毛剤または40番刃の電気クリッパーで除去する。
      1. 除毛剤の場合、この化合物を外科領域に2〜3分間塗布し、次いでそれを綿で取り除く。市販の水酸化カルシウムと水酸化ナトリウムの化合物を使用します。
    3. 70％のアルコールで肩の上の領域を準備し、25ゲージまたはより小さい穴の針を用いてcarprofen（5mg / kg）を皮下注射する。この治療は動物の術後鎮痛を提供する。
    4. 動物を手術野に移し、背臥位に置く。
    5. 清潔な綿アプリケータまたは綿のガーゼで8-12％のプロビドン - ヨウ素を擦って手術部位を準備する。その後、70％アルコールで皮膚を2回すすいでください。
    6. 角膜乾燥の発生を減少させるために眼の潤滑剤を両眼に置く。手術部位を滅菌ドレープで覆う。
  3. 手術技法
    1. 剣状突起をすぐに尾側から骨盤に向かって伸びるようにして、メスを長さ約2〜2.5cmの中央腹部開腹切開にする。
    2. 小腸と十二指腸を動員し、横方向に右に反射する。滅菌した綿のストリップを巻き上げ、注射のために滅菌生理食塩水を浸して、臓器を包み込み、暴露を改善する。
    3. 小腸の右側に動員された小腸腹部を切開し、後腹膜を露出させ、左腎静脈から大動脈分岐部に腹部大動脈を露出させる（ 図1 ）。
    4. 滅菌済みのコットンチップ付きアプリケータでは、5秒間に30回の連続破砕を行います。
    5. パッキングを取り外し、内臓が元の位置に戻るようにします。
    6. 実行中の4-0吸収性モノフィラメント縫合糸（ポリジオキサノン）で筋膜を閉鎖する。皮膚は、実行中の6-0非吸収性モノフィラメント縫合糸（ナイロン）で閉鎖される。
  4. 回復および手技後のケア
    1. 処置の後、等温パッド上に清潔な寝具を備えた回復ケージに動物を入れ、動物が正常に歩行できるようになるまで熱的支持を継続する。胸骨の臥位を維持する能力を証明するまで動物を放置しないでください。
    2. 手術後最初の4時間は毎時動物を監視する。一旦動物が普通に戻ってくると、割り当てられた畜舎に割り当てます。それが完全に回復するまで、動物は別の動物の会社に収容されません。
    3. 手術後最初の72時間、その後は週に少なくとも3回、動物を毎日2回監視する。監視には、週に3回動物の体重を測定することが含まれます。
    4. 手術後最初の72時間、carpofen（5mg / kg）を1日2回皮下投与する。

2.組織の調達

  1. 安楽死の方法
    1. 所定の時点で動物を安楽死させる。
    2. 精密気化器を介して送達された100％O 2および2.5％イソフルランを有する誘導タンクを介して麻酔を誘導する。
      1. 内皮の完全性を研究するために、エバンスブルー染料を動物に投与する。
        注：エバンスブルーは、アルブミンに対して高い結合親和性を有する負に帯電したアゾ染料であり、無傷の内皮の不存在下でのみ血管を染色することができるs = "xref"> 6。
      2. 内皮完全性試験のために、安楽死の時点で、5mLの0.3％エバンスブルー染料で5mLのPBS、続いて5mLのPBSを生理的圧力で5分間灌流する。動物は、灌流処置の間に、麻酔の外科手術平面内に維持される。
    3. 深い麻酔の面を達成した後、胸骨切開術で胸を開きます。右心房からの血液の排出を可能にするために右心房に裂傷を作り、左心室にアクセスし、21G針でアクセスし、右心房からの流出液が透明になるまでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を注入する。
    4. PBSで灌流した後、正中線切開により腹部に入れます。
    5. もう一度、小腸を動かして腹部大動脈を露出させる腹部の右側に、隣接する組織から大動脈を鋭く切開し、左腎静脈から大動脈分岐部まで切除する。
    6. 切除された大動脈を4％パラホルムアルデヒド組織処理が起こるまでの間、
      1. 内皮完全性試験のために、大動脈を縦に開き、管腔表面全体を露出させるワックスシートにピン止めする。エバンスブルー染料6による染色の程度によって、内皮の完全性の定性的評価を行う。
      2. 他の組織学的検査では、大動脈を横断し、使用する組織学的方法によって決定されるように最適切断温度（OCT）化合物に埋め込む。7 。

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結果

OCTに埋め込まれた横断切片の大動脈を切開し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いでVerhoeff-Van Gieson（VVG）染色でカウンター染色し、内外の弾性薄層7を同定した。クラッシュ損傷は、偽手術（開腹術および小腸の動員のみ）で処置した動物の大動脈と比較して、大動脈壁の肥厚を誘導した。外膜から内腔までの距離によって評価した壁の厚さは、損傷の3日後に最大​​であった（42.2±1.7μm対開腹術のみについて22.1±1.1μm）（ 図 2A〜B）。傷害は、より丸みのある外観および内腔表面の不規則な輪郭を有する細胞を生じた（ 図2C ）。

損傷を受けた大動脈の壁の肥厚の増加は、少なくとも部分的には、内側血管平滑筋の増殖の増加によって媒介される細胞を洗浄する。壁肥厚が細胞肥大とは対照的に増殖の増加によるものであることを証明す...

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ディスカッション

本発明者らは、内側過形成および内皮障壁機能不全を生じるマウス大動脈損傷モデルの効果を特徴付けた。大動脈内膜に沿った部分的なEC剥離は、細胞 - 細胞接触の喪失および細胞突起の増強を伴った。相応して、内皮バリア機能が有意に損なわれ、マイトジェン感受性シグナル伝達経路を刺激し、VSMCの増殖および血管壁の肥厚をもたらした。このモデルの強みは、他の大動脈モデルと比べて技術的に習得して実行することが技術的に容易であり、傷害および内皮機能に対する増殖応答の両方を同時に評価できることです。このプロトコルの重要なステップは、実際の挫傷です。圧挫傷害の程度の変動は、様々な程度の傷害をもたらし、従って、変動する量の平滑筋細胞増殖をもたらす可能性がある。私たちの研究室でこのばらつきを減らす1つのステップは、治療または実験条件が盲目になっている患者さんは、圧傷によるけがをすべて行います。

このモデルの限界は、臨床的に関連するヒト疾患プロセスに対する一般性である。このモデルでは、VSMCの初期の堅牢な増殖応答にもかかわらず、再狭窄の後期事象、すなわち新生内膜が発現しないというモデルをモデル化していない。サ...

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開示事項

この作品は退役軍人病キャリア開発賞（1IK2BX001553-01）（TSM）と血管治療EJワイリー奨学金（TSM）によって資金提供されました。

謝辞

我々は、走査型電子顕微鏡サンプルを処理する彼女の技術的支援のために、メリーランド大学医学部の電子顕微鏡検査施設からのHsia Ru-ching博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
眼用潤滑剤Dechra17033-211-38医薬品
イソフルランVetOne502017医薬品
カルプロフェンZoetis26357医薬品
精密気化器サミットメディカル10675外科用品
チャコールスカベンジャービックフォード株式会社80120外科用品
等温パッドハーバード装置50-7053-R外科用品
滅菌綿先端アプリケーターフィッシャー・サイエンティフィック23-400-124外科用品
4-0 吸収性モノフィラメント縫合糸 Ethicon、IncJ310外科用品
5-0非吸収性モノフィラメント縫合Ethicon、Inc1666用品
21ゲージ×1インチ針BDバイオサイエンス305165外科用品
25ゲージ×1インチ 針BDバイオサイエンス305125外科用品
乾燥滅菌器セルポイント 7770外科用品
ファインハサミファインサイエンスツール14058-09手術器具
アドソン鉗子ファインサイエンスツール11006-12手術器具
デュモン #5 ファインサイエンス ツール11254-20手術器具
バンナス スプリング ハサミ 3 mm 刃先ファイン サイエンス ツール15000-00手術器具
ニードルドライバーファインサイエンスツール91201-13手術器具
メスハンドル #4ファインサイエンスツール10004-13手術器具
メスブレード #10ファインサイエンスツール10010-00手術器具
PBS ロンザ17-516F組織処理用試薬
エバンス ブルーSigma-AldrichE2129組織処理用試薬
パラホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148組織処理用試薬
モデリングワックスBego40001組織処理用試薬
OCT化合物Tissue-Tek Sakura4583用試薬組織処理
マイヤーのヘマトキシリン溶液Sigma-AldrichMHS16免疫組織学的分析用試薬
エオシン Y 溶液 アルコール Sigma-AldrichHT110316免疫組織学的解析用試薬
エラスチン染色キットSigma-AldrichHT25A免疫組織学的解析用試薬
Click-it Edu Alexa-488 イメージングキットInvitrogenC10337免疫組織学的解析用試薬
抗Erk1/2抗体Cell Signaling Technology4695免疫組織学的試薬分析
抗リン酸化Erk1/2抗体細胞シグナル技術4370免疫組織学的分析用試薬
抗p27kip1抗体細胞シグナル伝達技術3698免疫組織学的分析用試薬
トリクロロ酢酸Sigma-AldrichT9159免疫組織学的分析用試薬
糸外科

参考文献

  1. Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
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