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方法論記事

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

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DOI:

10.3791/55205

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2017年2月6日

 ,  , 
1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

この記事について

サマリー

環境硬質表面上のノロウイルスの検出と定量のために、マクロフォームベースのサンプリング方法が開発され、評価されました。

要約

人間のノロウイルスは、世界的流行と散発的な胃腸炎の主要な原因です。ほとんどの感染はいずれかの環境表面や食品を介して間接的に個人対個人の経路を介して直接広がったりしているため、汚染された媒介物と無生物表面は、ノロウイルスの集団感染時のウイルスの拡散のための重要な媒体です。

私たちは、硬質表面からのヒトノロウイルスの検出およびタイピングのためのマクロフォームスワブを使用してプロトコルを開発し、評価しました。繊維が先端に付いた綿棒や帯電防止ワイプと比較すると、マクロフォームスワブは、最大700 cm 2の便座表面からのウイルス回収（範囲1.2から33.6パーセント）を許可します。プロトコルは、スピンカラムを用いてウイルスRNAのスワブからウイルスを抽出し、さらに濃縮するためのステップを含みます。ノロウイルス胃腸炎がされていたクルーズ船や介護施設での表面から収集された217スワブサンプルの合計で、127（58.5パーセント）RT-qPCRによりGIIのノロウイルス検査で陽性と報告しました。これらの29（22.8％）のうち、正常遺伝子型を決定することができました。結論として、私たちが開発したプロトコルを使用して、環境面でのノロウイルスの検出は、臨床試料が入手できないときに大流行中の環境汚染のレベルだけでなく、ウイルスの検出を判断する際に役立つかもしれ。それはまた、改善戦略の有効性の監視を容易にすることができます。

概要

人間のノロウイルスは、世界的流行と散発的な急性胃腸炎の主要な原因1、2、3です。ウイルスは非常に伝染性であり、送信は、人との対話にまたは間接的に汚染された食物、水や環境表面との接触を介して直接人を介して行われます。ノロウイルスは、長時間流すことができ、環境表面上のウイルスの生存期間の延長は1、2、3に記載されています。ピークの排出時には、ウイルス粒子の数十億は糞便1g当たり放出される、および嘔吐はまた、感染4を引き起こすウイルス粒子の十分な数が含まれている5、6、7、8、EF "> 9、10。また、無生物表面と人間の皮膚との間のウイルスの移動が容易に発生する可能性があります2、11、12。したがって、環境汚染のモニタリングがアウトブレイク調査を支援し、クリーンアップの有効性を評価する際にすることができ、消毒手順。

いくつかの環境サンプリングプロトコルは、ロタウイルスの検出のために記載されており、大腸菌ファージMS2、ネコカリシウイルス（FCV）、及びバクテリオファージP22 13、14、15、16。しかし、高速乾燥（<1時間）と小さい表面領域（25×100 cm 2）を含む、これらの研究に記載の検証条件は、適切にフィールドの設定を表していない場合があります。また、エンバイロの低い汚染レベルを期待nmental表面は、非常に少数のウイルス粒子を検出することができるプロトコルを必要とします。

私たちは、ノロウイルスの検出とタイピングのためのマクロフォームベースの表面サンプリング法を開発しました。この方法は、いくつかのノロウイルス集団発生時に検証されています。プロトコルは、1）（2）どのように最善の研究室に収集・輸送中のサンプルの完全性を維持するために、およびノロウイルスの3）実験室での試験とタイピング環境表面からスワブサンプルを収集する方法。

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プロトコル

フィールド1.スワブサンプリング

  1. 手袋のきれいなペアを着用してください。
  2. 測定テープや定規を用いて表面に触れることなくサンプリング領域のサイズを測定します。できるだけ正確に面積を推定し、報告書（補足表1）を記入してみてください。
  3. 可能な漏れやラベルサンプル輸送バッグや綿棒キット用綿棒キットを確認してください。
  4. 水平方向に1ストローク、垂直方向に1ストローク、および斜め方向の1ストロークを次のようにサンプリングエリア全体に綿棒を移動します。 700センチメートル2よりも大きな表面積を綿棒ないでください。
  5. チューブに各綿棒を置き、しっかりとキャップを締めます。

研究室への綿棒の2貯蔵および輸送

  1. 最大48時間、4℃で綿棒を保管してください。長期間保管が必要な場合は、-20℃でスワブを格納する（または-70°C）。
  2. すなわち、（0-4℃でチューブを保ちます。 、コレクションの24〜48時間以内に研究室や船への輸送の間に断熱容器に）コールドパックを使用します。

3.ウイルス濃度、ウイルスRNA抽出および精製

注：特に明記しない限り、すべての遠心分離工程は、室温で5分間、5000×gでテーブルトップ遠心機を使用しています。ユニバーサル核酸抽出（UNEX）緩衝液を用いて作業する場合、余分な注意が必要です。ゴーグルまたはフェイスシールドを着用してください。

  1. 1 15 mLチューブと各サンプルに対して1つのRNA Midiカラムにラベルを付けます。各実験における負の抽出制御が含まれます。
  2. 10スワブのための溶解液を調製し、PBSTの25ミリリットル（PBS pH7.2の0.02％のTween-80を含む）でUNEXバッファの25ミリリットルを混ぜます。
  3. 溶解液の50 mLに大腸菌ファージMS2懸濁液（10 6 PFU /μL）の50μLを追加します。
  4. 15 mLチューブに綿棒を置き、5ミリリットル溶解液を追加します。混合し、室温で10分間インキュベートします。
  5. 10秒のための各チューブ、ボルテックスに5ミリリットルの100％エタノールを追加します。
  6. 慎重に余分な液体を除去した後、綿棒を破棄するために、チューブの側面に軽く押す（これはUNEXのバッファが含まれている）15 mLチューブから綿棒を削除します。残りのボリュームは9-10 mLの間であるべきです。

4. Midiカラムウイルス核酸の抽出

  1. 慎重ミディカラム、遠心分離器の上にステップ3.6から4.5 mLのUNEX /エタノール混合物を転送し、ろ液を捨てます。
  2. 同じ混合物から別の4.5 mLを同じ列、遠心分離機にロードし、ろ液を捨てます。
  3. 最初の洗浄のための、ミディカラムに70％エタノールの3.5ミリリットルを追加し、遠心分離し、ろ液を捨てます。
  4. 第二の洗浄のために、ミディカラムに70％エタノールの別の3.5ミリリットルを追加します。ろ液を遠心分離し、廃棄します。
  5. ドライスピンのために、（マイナスのウイルスRNAの回収率に影響を与える可能性がある）エタノールのすべての痕跡を除去するために、ミディカラムを遠心してください。
  6. 新しい15ミリリットルの遠心分離管にMidiカラムを配置します。 Midiカラムに250μlの溶出バッファーを追加します。最高のウイルスRNAの回収率を得るために、遠心分離前に1分間待ちます。
  7. -70℃で抽出された核酸を保存するか、手順5に即座に進みます。

RNAクリーンとコンセントレータキットを使用したウイルス核酸の5濃度

  1. 上記のステップ4.7で溶出したRNAと10秒間渦の250μLに結合バッファーRNAの500μLを追加します。
  2. 750μLを10秒間100％エタノールと渦を追加します。
  3. 各サンプルのスピンカラムにラベルを付けます。スピンカラムに750μLのサンプルをロードします。
  4. 1分間12,000×gでスピンカラムを遠心します。フロースルーを捨てます。
  5. 1分間12,000×gでスピンカラムと遠心上に残りの750μLをロードします。
  6. 予備洗浄のために、1分間12,000×gで各スピンカラムや遠心に400μLRNAプレップバッファを追加します。フロースルーを捨てます。
  7. 最初の洗浄のために、1分間12,000×gで各スピンカラムや遠心に800μLのRNA洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。
  8. 第二の洗浄のために、1分間12,000×gで列や遠心分離機を回転するように400μLRNA洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。
  9. ドライスピンのために、2分間12,000×gで、洗浄緩衝液のすべての痕跡を除去するために、スピンカラムを遠心してください。
  10. 注意深く新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムを移します。
  11. スピンカラムに25μlの溶出緩衝液を加え、室温で1分間インキュベートします。これは、カラムからのウイルスRNAの回収率を増加させます。
  12. 1分間万×gでスピンカラムを遠心分離することにより、RNAを収集します。
  13. どちらか-70℃でRT-qPCRを（ステップ6）、またはストアRNAに直接進みます。

6. Genogroup IのMutiplex RT-qPCRの検出、およびIIノロウイルス、およびコリファージMS 2（補足表2）

  1. クリーンな作業面、pipettES、および汚染の可能性を低減するためのRNase汚染除去溶液で遠心分離機。
  2. 氷の上でRT-qPCRの試薬を解凍します。 （別の領域/客室内に）氷上で解凍RNA。
  3. 反応の数を決定し、それらの少なくとも10％以上を追加（10の反応が必要な場合など 、11のためのマスターミックスを作ります）。
  4. 5秒間の25倍RT-qPCRの酵素を除き、渦個々のマスターミックスコンポーネント、。慎重に指でチューブをフリックすることにより酵素を混ぜます。
  5. 5秒間簡単に言えば遠心マスターミックスコンポーネント。
  6. キットの説明書に従って、ノロウイルスGIとGIIのリアルタイムRT-PCR検出のためのマスターミックスを調製し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（補足表3）でノロウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを追加します。
  7. 上下に5〜10回ピペッティングすることによりマスターミックスをミックス（ボルテックスは推奨されません）。リアルタイムPCR 96ウェルプレートの各ウェル内のマスターミックスのアリコートを22μL。
  8. 渦サンプルRNA5秒間、および簡単な（5秒）遠心分離によって収集します。
  9. RT-qPCRのプレート（ 表2からテンプレートに従ってください）に試料RNAとGIとGII陽性対照の3μLを追加します。無テンプレート対照（NTC）をウェルにヌクレアーゼ-Freewaterのの3μLを追加します。
  10. 光学接着フィルム付きリアルタイムプレートをシール。
  11. 注意深くウェル中に存在し得る気泡又は液滴を除去するために1分間、1300×gでリアルタイムプレートを遠心。
  12. 10分間1）RTステップ：リアルタイムPCR装置とセットアップ以下の熱サイクル条件を設定します。 Taqポリメラーゼの45℃（2）活性化、10分間。 95℃、（3）95℃で15秒の45サイクル、および60℃で60秒で。

スワブ試料中のノロウイルスの7.定量

  1. RT-qPCRの結果（ 補足表3）を検証するために、正と負の対照の結果を確認します。
  2. 各標準曲線は満たしているかどうかを判断許容可能な値は、補足表2に与えられ、式1を使用して標準曲線の全体的な標準偏差を計算します。
    （式1）％効率= 100×10（平均CT値-切片）/傾き 。
  3. PCRサーマルサイクラーソフトウェアは各標準曲線の傾きを計算していない場合は、（Excel など 、SPSS、またはSAS）統計ソフトウェアを使用して回帰により傾きとR 2の値を決定します。また、私は次式の標準曲線について％の効率を計算します
  4. 補足表4で指定された基準を満たす標準曲線に基づいて、すべてのテストサンプル用のサーマルサイクラーソフトウェアによって計算されたRNAコピー数を記録します。基準を満たすか、偽陽性コントロールを持っていない標準曲線tの帽子を持つ任意のサンプルを再実行します。大腸菌ファージMS2のCt値をチェックし、PCR阻害を監視するための内部対照として加えました。
  5. RNAコピーpの合計数を決定RT-qPCRの反応に使用されるRNA（3μL5）の総RNA溶出液の量（25〜50μL）の比で段階7.2で計算されたRNAコピー数を乗算することにより、ERのサンプル。代替的に、分析対象物の表面積（cm 2）を、総RNAのコピー数を割ることによってRNA濃度を算出します。

ヘミネストされた従来のPCR増幅によるリアルタイムRT-PCR陽性サンプルの8ジェノタイピング

  1. RT-PCRアッセイの各プライマーセットのためにマスターミックスの最初のラウンドを準備します（ 補足表2、および5）。
  2. マスターミックスの20μLにノロウイルス陽性のRNAの5μLを追加します。
  3. 以下の条件でRT-PCRを実行する：（1）RTが95℃で、Taqポリメラーゼの42℃（2）活性化、15分で30分間工程、及び（3）95℃で30秒の40サイクル、50℃で30秒、および72℃で60秒。 40サイクル後、72℃でさらに10分間インキュベートします。
  4. RT-PCRアッセイの各プライマーセット（ 補足表2および5）のための母校ミックスの第二ラウンドを準備します。
  5. 23μLマスターミックスを追加し、（理想的には、第一ラウンドの製品は、RNaseフリー水で1/10に希釈してください）を各チューブに（最初のラウンドから）2μL第一ラウンドのRT-PCRの製品を追加。
  6. 繰り返し手順8.3。
  7. 100ミリリットル1×トリス - 酢酸EDTA（40 mMトリス、20mMの酢酸、およびpH 8.3で1 mMのEDTA）中の2％アガロースゲルを準備します。 60〜70℃に冷却した後、混合物を調製したゲルの100ミリリットルあたりの核酸染色の10μLを追加し、電子レンジで混合物を加熱することにより、アガロース溶解した後、ゲルを注ぎ、コームを挿入します。ゲルは、少なくとも30分間沈降してみましょう。
  8. 6×ローディング色素の3μLで各RT-PCR産物の15μlのを混ぜます。負荷の各サンプル15μL、1時間、100Vでアガロースゲルを電気泳動します。
  9. ゲルANから適切なサイズの物品税の対象RT-PCR断片（GIとGIIのための341 bpのための330 bp）の商業ゲル抽出キットを用いてRNAを精製dは。精製したPCR産物は、現在サンガー配列決定のために使用することができます。

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結果

図1は、スワブサンプリングプロトコルを示すフローチャートです。このプロトコルは、4つの主要なステップで構成されています。 1）サンプル収集、2）サンプルの保管および輸送、3）ウイルスRNA精製および濃縮し、4）RT-qPCRのアッセイおよび遺伝子型決定。

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図1：ノロウイルスの環境表面サンプリングのための最終的なプロトコルのフロー・チャート この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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ディスカッション

ノロウイルスは18と10 3ウイルス粒子20との間に50％のヒト感染用量を持っています。したがって、表面のも低レベルの汚染は、公衆衛生上のリスクをもたらすことができます。 1）異なるスワブ材料、2）貯蔵条件スワブ輸送の間、3）ウイルスRNAの濃度、及び4）大腸菌ファージMS2内部抽出コントロールとして：スワブサンプリングプロトコルのいくつかの側面を含めて評価しました。

最近まで、綿、ポリエステル、ナイロンなど）ワイプ帯電防止から作られたスワブの唯一の性能が評価されたフィールドの使用13、14、15、21、22のために提案されています。これらのうち、綿棒は、ノロウイルスおよび肝炎食品調理面と媒...

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開示事項

著者には相反する利益はありません。このレポートの調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも米国疾病予防管理センターの公式見解を表すものではありません。

謝辞

著者には謝辞がありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
キットの一般名
strong>Premoistened EnviroMaxスワブキット ピューリタン2588060PFUW
RNA 溶解バッファー CDC UNEX bufferMicrobiologicsカタログ番号 MR0501
RNA 抽出 スピンカラムmidi カラムOmega Biotekカタログ番号 R6664-02
RNA 精製スピンカラムZymol RNA クリーン&コンセントレータキット Zymo Researchカタログ番号 R1016
リアルタイム RT-PCR キットAgPath キット ワンステップ RT-PCR キットライフテクノロジーカタログ番号
4387391従来の RT-PCR キットQiagen ワンステップ RT-PCR キットQiagen キットCat No
210212Gel extraction kit>Qiagen QIAquick gel extraction kitCatNo 28704 or 28706
Coliphage MS2ATCCCat No 15597-B1
RNAランオフ転写産物
リアルタイムPCRプラットフォームApplied BiosystemsModel ABI 7500
Optical 96-well reaction plateThermo ScientificCat No 4316813
MicroAmp透明粘着フィルム Thermo ScientificCat No 4306311
ズ

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