免疫組織化学およびフローサイトメトリーを用いた気管支生検における空間分布と表現型の同定：ヒト肺樹状細胞

サマリー

ヒトの樹状細胞(DC)を含む肺に常在する免疫細胞は、吸入された病原体やアレルゲンに対する防御に重要です。しかし、ヒトの肺組織が不足しているため、研究は限られています。この研究では、免疫組織化学およびフローサイトメトリーを使用して肺DCを研究するためのヒト粘膜気管支内生検を処理するためのプロトコルを提示します。

要約

肺は常に外部環境にさらされており、無害な粒子に加えて、病原体、アレルゲン、毒素も含まれています。耐性を維持したり、免疫応答を誘導したりするためには、免疫系は吸入された抗原を適切に処理する必要があります。肺樹状細胞(DC)は、誇張された炎症反応による肺への巻き添え損傷を引き起こすことなく、必要に応じて免疫を開始するための微妙なバランスを維持するために不可欠です。ヒトの血液中のDCなどの免疫細胞の表現型と機能については詳細な理解がありますが、特に健康な個人からのヒト肺組織サンプルの研究が不足しているため、肺などのアクセスしにくい組織におけるこれらの細胞に関する知識ははるかに限られています。この研究は、気管支内生検のサンプリングのために気管支鏡検査を受ける健康なヒトの肺組織常在DCの詳細な空間的および表現型の特徴付けを生成する戦略を示しています。各個人からいくつかの小さな生検を採取し、その後、超微細切片化のために埋め込んだり、高度なフローサイトメトリー分析のために酵素的に消化したりできます。概説されているプロトコルは、定常状態の条件下では、低頻度のDCのみを含む小さな組織サンプルから最大限の情報が得られるように最適化されています。本研究はDCに焦点を当てていますが、記載されている方法は、粘膜肺組織に見られる他の(免疫)目的の細胞を含むように直接拡張することができます。さらに、プロトコルは、気管支鏡検査が診断の確立の一部である肺疾患に苦しむ患者から得られたサンプルにも直接適用できます(慢性閉塞性肺疾患(COPD)、サルコイドーシス、または肺癌など)。

概要

肺は、外部環境と連続的に接触している、高度に疾患を引き起こす能力を有する無害な粒子および微生物の両方にさらされています。したがって、侵入する病原体に対する強力な免疫応答をマウントする免疫システムにとって重要であるが、病気を引き起こさない吸入抗原に対する寛容を維持することも同様に重要です。強力な免疫監視機構を提供するために、呼吸器系は、樹状細胞（DC）を含む免疫細胞のネットワークが並んでいます。 DCは、ナイーブT細胞を活性化する固有の能力を有するプロフェッショナル抗原提示細胞です。ヒトの肺において、常駐DCを抗原と、処理が発生し、T細胞を^1、2、3に提示および活性化のために肺流入領域リンパ節に輸送します。

ヒト免疫系では、DCはdistinで、複数のサブセットに分割することができCTが、重複する機能：CD1c ⁺およびCD141 ⁺骨髄性樹状細胞（MDCの）とCD123 ⁺形質樹状細胞（PDCに^）4、5。ヒトDC上で最も詳細な知識は、血液中の研究に由来するが、人間の肺はまた、T細胞刺激能^{6、7、8、9}でDCサブセットの希少集団を保有することは現在明らかです。しかし、蓄積したデータは、DCなどの免疫細胞は、その解剖学的位置¹⁰に応じてその頻度、表現型、および機能が異なることを示しています。したがって、局所免疫と寛容への貢献を理解するために、関連する組織から免疫細胞を研究することが重要です。まとめると、これは、血液DCは、より容易に入手可能であり、アクセス可能であるにもかかわらず、肺疾患に対処するとき、肺常駐DCを検討する必要性を強調します人間インチ

ヒトにおける肺常駐DCを調べた最初の研究は、主に免疫組織化学^{11、12、13を}用いて組織切片において、形態や、HLA-DRおよびCD11cのような単一のマーカーの発現に依存していました。対照的に、典型的には、フローサイトメトリーに依存していたより最近の研究は、異なる免疫細胞サブセットを研究するために分析します。それは一意に特定のDCサブセットを識別する単一細胞表面マーカーを見出すことは困難であるので、わずか4色フローサイトメトリーを適用した研究の潜在的な制限は、DCと同様の表現型マーカーを有する細胞集団を含む、危険です。例えば、CD11cのすべての骨髄性DCおよび単球の大半で発現されます。一方、より高度なフローサイトメトリーパネルを適用する研究において、患者の外科的切除からの非癌性肺組織は、典型的に使用されました外部参照"> ^{10、14、15、16、}これらの稀な集団が真に健康な被験者でのDCの存在の代表的なものであるかどうかは不明ですが。全体的には、研究は主として外科的に除去または全ヒト肺組織が不足しているという事実に制限されています。

これらの制限のいくつかを克服するために、この作品は空間分布と気管支鏡検査を受ける健康なボランティアから得た粘膜気管支生検におけるDCの表現型の識別の詳細な分析を実行する方法について説明します。いくつかの小さな生検を、各個体から採取することができ、その後、免疫組織化学を使用して切片化し、分析のために埋め込まれた、または酵素的に高度なフローサイトメトリー分析のために消化することができます。 bronchoscopiesから得られた気管支生検の形で肺組織を使用して、STを実行することを可能にするという利点を与えますUDYは、健康なボランティアに、肺の開放手術とは異なり、明らかな理由のために、胸部外科手術を必要とする患者に限定されている、ということ。さらに、健康なボランティアの気管支鏡検査の間にサンプリングされた組織は、肺疾患を有する患者における肺組織の非患部とは対照的に、生理的に正常です。一方、生検が小さく、いくつかの生検をプールさえ取得細胞の数は、実行することができる分析のタイプを制限します。

本研究は、樹状細胞に焦点を当てているが、記載された方法は、直接人間の粘膜肺組織に存在する関心のある他の（免疫）細胞を含むように拡張することができます。さらに、プロトコルはまた、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、サルコイドーシス、または肺癌のような気管支鏡検査は、診断を確立するための部分である肺疾患、に罹患した患者から得られた試​​料に直接適用可能です。

プロトコル

注：この研究は、ウメオ、スウェーデンの地方倫理委員会によって承認されました。

ヒト対象から採取気管支生検1.気管支鏡検査

1. すべての参加者からインフォームドコンセントを取得します。
2. 気管支鏡検査の前に経口ミダゾラム（4-8 mg）を静脈内グリコピロニウム（0.2から04 mg）を30分で対象を治療。喉頭および気管支におけるリドカインで局所麻酔を適用します。リドカインの〜3ミリリットル4パーセントで、被写体のうがいをしましょうと舌ベースにし、喉頭の注射器を経由して喉頭に3ミリリットルを適用します。リドカインスプレーの8-10用量で局所麻酔を最適化します。件名座ってこの手順を実行します。
3. 仰臥位の対象とプラスチック製のマウスピースを介して口から柔軟なビデオ気管支鏡を挿入します。気管支鏡を介した遠位気管や気管支の局所麻酔を完了するために、目的製スプレーカテーテルを使用してください。ここで、約の用量を使用しますリドカイン5〜10mlの2％。
4. 有窓鉗子（ 図1）を使用して6-9メイン竜骨から気管支粘膜生検および主気管支部門を取ります。気管支鏡検査の後、病院を出る前に、2〜4時間、対象の残りの部分を聞かせ軽い食事で彼/彼女を提供しています。

2.グリコールメチルアクリレート（GMA）樹脂で生検を埋め込みます

注：GMA免疫染色プロトコルは、もともとサウサンプトン大学、組織化学研究ユニット¹⁷で開発されました。

1. 固定：免疫組織化学のために、鉗子から生検を除去し、氷冷脱水アセトンおよびプロテアーゼ阻害剤の3ミリリットル（フッ化フェニルメチルスルホニル（35ミリグラム/ 100ミリリットルのアセトン）を含有するガラスバイアルに直接それらを配置し、ヨードアセトアミド（370ミリグラム/ 100ミリリットルのアセトン））。 -20°C（ 図2）で一晩組織を修正しました。
   注：次の手順はperfoする必要があります適切なニトリル手袋付きドラフト内rmed。埋め込みキットは増感、刺激、および/またはアレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性がありますコンポーネントが含まれています。すべての廃棄物は危険廃棄物として廃棄されなければなりません。
2. 脱水：阻害剤を用いてアセトンを除去し、室温（RT）で15分間（阻害剤なし）新鮮な脱水アセトンと交換します。アセトンを除去し、15分間安息香酸メチルと交換してください。
3. 浸潤：グリコールメタクリレートモノマー中の5％のメチル安息香酸溶液の処理液を準備します。 10mlの1つのバイアルに十分です。安息香酸メチル溶液をオフにプラスチック製のパスツールピペット、吸引を使用して処理溶液3mlと交換してください。生検および2時間4℃で過剰の処理液をインキュベートし;パスツールピペットで溶液を埋め込むなど、後続のすべての解の変化、のために使用することができます。
4. 処理液ごとに2時間（3×2時間のインキュベーション）を交換するので、バイオの総浸潤時間処理溶液中のpsiesは、少なくとも6時間です。生検を識別するために埋め込むカプセルの上端部に紙のラベルを挿入します。
5. グリコールメタクリレートモノマーの10ミリリットル中に75mgの過酸化ベンゾイルの埋め込み溶液を調製します。重合反応を開始するために、埋め込み溶液にN、N-ジメチルアニリン、ポリ（エチレンオキシド）、0.25mlの（アクセル）を加えます。処理溶液を除去し、鉗子を使用して、関連する埋め込みカプセルに1生検を置きます。
6. ゆっくりとソリューションを埋め込んでトップに埋め込むカプセルに充填し、キャップを閉じます。生検を妨害し、大きな気泡を作成しないでください。樹脂が完全に重合するまで4℃でカプセルをインキュベートします。
7. シリカゲルの約5グラムを含む50 mlチューブに-20℃で埋め込まれた生検を保管してください。

GMA-埋め込み気管支生検の3セクショニング

1. 顕微鏡スライドコーティング：で顕微鏡スライドを洗います通常のサイクルで食器洗い機。スライドを覆い、空気乾燥させます。
2. 蒸留水中の10％ポリ-L-リジン（PLL）溶液の塗布液を調製します。 5分間塗布液中でスライドを水没してから、それらを空気乾燥してみましょう。元の箱で乾燥PLL被覆スライドを保管してください。
3. 蒸留水に0.1％Tween 20でシートガラス片を洗ってください。ペーパータオルで70％エタノールとドライでガラスを洗浄します。ナイフメーカーを使用して、ガラスストリップからガラスブレードをカットします。切れ刃が破損またはニックを入れれないことを確実にするために移動を防止容器にブレードを格納します。
4. 生検トリミング：カプセルスプリッタで生検カプセルを配置し、炭素鋼、シングルエッジブレードを使用して各辺を削減。 GMA-埋め込まれた生検を削除し、バイスでしっかりとそれを置きます。鋼の刃を使用して、生検周りから過剰なGMAトリム。
5. GMAの切片。
   1. 蒸留水で0.05％アンモニア溶液を準備します。目にガラスナイフや生検を配置電子ミクロトーム。慎重にブレードがブロックの表面に対して平らに載るように、ナイフホルダーと生検ブロックの角度を調整することにより、ブレードで生検ブロックを揃えます。
   2. 遅い切削速度にミクロトームを用いて2μmの厚さの切片をカットし、転送し、アンモニア水にセクションをfloatに鉗子を使用しています。穏やかな抗原検索を可能にし、セクションの展開、45から90秒間のセクションが浮かんでいます。
   3. 顕微鏡スライドを持つセクションをピックアップ。すぐにトルイジンブルーで染色することによって、生検組織像を確認してください。
   4. 50℃にホットプレートセットにスライドを乾燥させ、プラスチック製パスツールピペットを使用してセクションにフィルタトルイジンブルー染色の500μLを適用します。緑色のリングは汚れの端に出現し始めるまで、ホットプレート上でセクションを温め、その後、水で洗い流してください。
   5. 光学顕微鏡を使用して、生検組織像を確認します。免疫組織化学のために使用されるセクションでは、損傷を受けていないラミナの良い領域を含むべきですなど、いくつかの腺とできるだけ平滑筋と固有とは上皮、。
   6. セクション3.4.2のように、良好な組織像を持つセクションを切断し、免疫組織化学染色のためのPLLでコーティングされた顕微鏡スライドでそれらを拾います。分析のために、各生検からの少なくとも二つの部分をカット。少なくとも1時間のためのドライスライド。乾燥後、切片をスズ箔でラップすることができ、最大2週間-20℃で保存し、またはそれらは、すぐに免疫染色することができます。

GMA-埋め込み気管支生検の4免疫組織化学染色

注：アジ化ナトリウムは有毒です。ヒュームフード内で0.1％アジ化ナトリウム溶液を準備し、離れて酸から。酸と接触して有毒ガスを発生します。

1. ダイヤモンドひっくり返されたペンを使用してセクションの周りに描き、染色ラックにスライドを配置します。
2. ペルオキシダーゼブロックを実行します。 0.1％アジ化ナトリウム溶液中に0.3％過酸化水素をペルオキシダーゼブロック溶液を調製します。 APPLY 1セクションにペルオキシダーゼブロックmlの30分間インキュベートします。
3. 0.05 Mトリス緩衝食塩水（TBS）、pHが7.6の洗浄液を準備します。 TBS、3×5分でスライドを洗浄します。
4. DMEM中の1％BSAブロック溶液を調製します。事前にかつ大量、一定分量でこれを行うと、必要になるまでそれを凍結します。スライドを排出し、非特異的結合抗体をブロックするために30分間ブロック溶液中のセクションをインキュベートします。非特異的結合は、依然として発生する場合は、二次抗体と同じ種から5％血清ブロックで30分間のインキュベーション工程が含まれます。
5. 所望の濃度にTBSで一次抗体（CD45またはのCD1a）を希釈（1に希釈したCD45：1,000;のCD1aは1に希釈：1,00）とスライドに適用します。セクションをカバースリップし、室温で一晩インキュベートします。
6. TBSで3回スライドを洗浄します。 （TBS中の所望の濃度に_（2）この場合、ウサギ抗マウスF（ab 'に一次抗体宿主種に対して指向）1:30ビオチン化二次抗体を希釈0希釈）、それがスライドに適用されます。 RTで2時間インキュベートします。
7. 使用前に、ストレプトアビジンビオチン - ペルオキシダーゼ複合体に少なくとも30分を準備します。すべてのスライドをカバーするのに十分であることを確認してください。 TBSで3回スライドを洗浄します。スライドに溶液を塗布し、室温で2時間インキュベートします。
8. TBSで3回スライドを洗浄します。 3-アミノ-9-エチルカルバゾール（製造者の指示に従って作られた）（AEC）ペルオキシダーゼ基質溶液を調製します。スライドにそれを適用し、20〜30分間、または所望の染色強度が発現するまでインキュベートします。
9. 5分間水道水でスライドを洗浄します。 2分間のフィルタリングマイヤーのヘマトキシリン溶液でセクションを対比染色。 5分間水道水でスライドを洗浄します。
10. スライドを排出し、永久水性マウント媒体とのセクションをカバーしています。乾燥オーブン中で80℃でスライドを乾燥させます。スライドを冷却し、その後、DPXでそれらをマウントし、カバースリップを配置することができます。

5.セントaining分析

1. コンピュータに接続された車載カメラの光顕微鏡を用いて40X倍率でのセクションを分析します。
   注：細胞解析のために、平滑筋、腺、大血管、およびミスマッチまたは損傷した組織の領域を除く、気管支粘膜固有層および無傷の上皮内の陽性染色、有核細胞をカウントします。
2. 細胞数を平均化し、粘膜固有層および上皮の長さの領域の平均細胞数を修正します。固有層および上皮の長さの領域を画像解析プログラムを用いて計算することができます。

気管支生検の6酵素消化

1. 洗浄生検：ハンクス緩衝塩類溶液（HBSS）（ 図3）10 mlを含む15 mlのコニカルチューブに滅菌ピンセット、場所無傷の生検を使用。 30rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で5分間インキュベートします。無菌Dに生検を転送HBSSで15ミリリットルチューブの内容をデカントすることによりっぽいです。
2. DTTで粘液を乱す：5 mMの1,4-ジチオスレイトール（DTT）を含むHBSSの10mlでチューブ内でHBSSを交換してください。滅菌ピンセットを用いて、15ミリリットルチューブに戻って生検を転送します。 30rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で15分間インキュベートします。
3. 15秒間穏やかにチューブをボルテックス。 HBSSおよびDTTで15ミリリットルチューブの内容をデカントすることにより、無菌皿に生検を転送します。
4. 培養培地に生検を転送する：RPMI 1640培地10mlでチューブ内でHBSSおよびDTTを交換してください。滅菌ピンセットを用いて、15ミリリットルチューブに戻って生検を転送します。 30rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で10分間インキュベートします。
5. コラゲナーゼおよびDNアーゼで生検を消化。
   1. 1 M HEPES溶液を含む予め温めたRPMI中のコラゲナーゼII（0.25 mg / mlで）およびDNアーゼ（0.2 mg / mlで）の消化溶液を準備します。 48ウェル組織カルトにウェル当たり消化溶液の500μLを追加UREプレート。
   2. 消化溶液中でウェルあたり1生検を置きます。 220rpmで37℃で60分間振とうプラットフォーム上でプレートをインキュベートします。ピペットで上下30分後に再分散生検に、そして60分後、組織を完全に脱凝集するの。
6. 単一細胞懸濁液を準備します。
   1. 40μmのセルストレーナーを通過させることにより、50ミリリットルチューブに一緒にプールウェルから消化生検を。 （2％ウシ胎児血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS））の氷冷FACS緩衝液でウェルを洗浄することによって残りの細胞を収集します。
   2. シリンジのプランジャーの背面を使用して、セルストレーナーに残りの組織を絞ります。 4℃で5分間、400×gで消化された細胞を遠心します。上清を慎重に除去し、氷冷FACS緩衝液5mlにペレットを再懸濁。手動での細胞の生存率を評価するために、血球計数器およびトリパンブルー染色を用いて細胞数を計測します。

7。酵素消化後の気管支生検の単一細胞のフローサイトメトリー解析

1. FACS緩衝液200μl中に約1×10 ⁶個^の細胞に細胞ペレットを再懸濁します。
2. 製造業者のプロトコルに従って死細胞を除外するための細胞生存色素を加えます。
3. FcRブロッキング試薬の5μlを添加して、4℃で5分間インキュベートします。
4. 、CD16（0.5μl）を、HLA-DR（3μL）、のCD11c（5μl）を、CD123、CD45（2μl）を、系統（2μlの各CD3、CD20、CD56、CD66abce、およびCD14）に対する細胞表面抗体を追加（5μl）を、CD1c（3μL）、およびCD103（2μl）を、4℃で15分間インキュベートします。抗体の詳細については、方法の項に見つけましたが、使用中の正確なフローサイトメーターに対する抗体を滴定し、最適化することができます。 400×gで5分間、PBSで過剰な抗体を洗い流してください。フローサイトメーター上で新鮮なサンプルを取得以降acquisit前に、1％パラホルムアルデヒドで細胞を固定イオン。
5. フローサイトメトリーアッセイ^18（ 図4）を使用して、肺生検におけるヒトDCを識別します。
   注：フローサイトメトリー分析ソフトウェアを用いて、免疫細胞がCD45にゲーティングすることによって、他の肺細胞から区別されます。死細胞は、LIVE / DEAD染料について陽性である細胞として除外することができます。すべての生CD45 ⁺細胞系統細胞（B細胞、T細胞、NK細胞、好中球、および単球）の1チャネルでCD20、CD3、CD56、CD66abce、CD14、およびCD16に対する抗体のカクテルを使用して排除することができます。 HLA-DR ⁺細胞は、すべてのヒトDCの同定を可能にする、ことを示します。 MDCが、それぞれのCD11cの発現またはCD11cの欠如に基づいて、PDCを区別することができます。 MDCがさらにCD1c ⁺のMDCまたはCD141 ⁺に分割することができます。

結果

DCを含むヒト呼吸組織常駐免疫細胞を特徴づける研究は、主として外科的に除去または全ヒト肺組織が不足しているという事実のために、限られています。ここでは、フローサイトメトリー、免疫組織化学を使用して組織内の免疫細胞を研究するか、流れるように健康なボランティアと開発されたプロトコルの気管支生検（EBB）から肺組織を得るためのより侵襲性の低い方法が概説されています。

以前に^19、20に記載^{されている}よう^に 、健康なボランティアは、気管支鏡検査を施行しました。シックス1-2 9 mmの³気管支粘膜生検を有窓鉗子（ 図1A）を使用して、主気管分岐し、各被験者の主...

ディスカッション

本稿では、免疫組織化学を使用して、健康なヒトにおける肺組織常駐DCの詳細な空間と表現型の特徴付けを生成し、気管支鏡検査中に収集された気管支粘膜生検でフローサイトメトリーする方法について説明します。以下の段落では、プロトコルにおける重要なステップは、詳細に説明します。

議定書の重要なステップ

セクショニングおよび免疫組織化学：彼らに（ステップ2.5）を使用していないときに、-20℃で生検のブロックを維持することが重要です。暖かいブロックが時々柔らかくなることができ、セクションは同様にしません。さらに、-20℃でブロックを維持すること抗原部位を維持し、免疫組織化学を使用して、より良い染色になります。

セクショニングおよび免疫組織化学：GMA-埋め込まれた生検を区画する場合は、上のセクションをフロートするために利用可能なアンモニア水の3-4の容器を持っていると便利です。セクションがピックアップされ、ミリアンペア新鮮なセクション（ステップ3.4）に置き換えてくださいKE。これは、そのセク...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
光源	オリンパス	エクセラCV-160
穴あき鉗子	オリンパス	FB21C	検を取るために使用
ブロック	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
コース25%			500 ml の静脈内
化グリコピロニウム 0.2 mg/ml			内。粘液/唾液の分泌を防ぎます
ミックス。ミダゾラム 1 mg/ml p.o			追加のリラクゼーションに使用できます
リドカイン、40 mg/ml			口と喉の投与 / うがい
リドカイン 100 mg/ml スプレー			喉の奥に投与
リドカイン 20 mg/ml スプレー			気管支鏡を介して気道に投与
GMA 処理と埋め込み
ガラスバイアル5			ml
アセトン	シグマ-アルドリッチ	32201-1L
モレキュラーシーブ、4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm 直径ペレット
フェニルメチルスルホニルフッ化物	Sigma-Aldrich	P-7626	0.035 g/100 ml アセトン
ヨードアセトアミド	Sigma-Aldrich	I-6125	0.37 g/100 ml アセトン
ポリエチレンフラット TAAB包埋カプセル	TAABラボラト	C094	直径500×8mm、ポリエチレン、平底カプセル
カプセルホルダー	TAABラボラトリーズ	C054	8mmカプセルを25個保持
JB-4 GMA包埋キット	Polysciences	00226	JB-4溶液A(0026A-800)、JB-4溶液B(0026B-3.8)、過酸化ベンゾイル(02618-12)
安息香酸メチル	Sigma-Aldrich	27614-1L
湿度インジケーター付きシリカゲル	Scharlau	GE0043	2.5-6 mm
GMA セクショニング
ガラス顕微鏡スライド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10143562CEF	カットエッジ、つや消しエンド
ポリ-L-リジン溶液	シグマ-アルドリッチ	P8920-500mL	1:10 作業溶液用
ウルトラミクロトミー用シートガラスストリップ	アルカー
トゥイーン 20	シグマ-アルドリッチ	P2287	ウォッシュ溶液 (0.1% Tween20)
LKB 7800B ナイフメーカー	LKB
カプセル スプリッター	TAAB 研究所	C065
炭素鋼 片刃	TAAB 研究所	B054
副
アンモニア、25%	VWR	1133.1000	2 ml 1 L、1:500 (0.05%)
ミクロトーム	ライカ		ライカRM 2165
光源	ライカ		ライカ CLS 150 XE
顕微鏡 スイングアームスタンド付き	ライカ		MZ6
GMA 免疫組織化学
>Diamond 先端ペン	Histolab	5218
過酸化水素 30% 溶液	AnalaR Normapur	23619.264
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
塩化ナトリウム	VWRケミカル	27810.295
ウシ血清アルブミン	ミリポア	82-045-2	プロブミン BSA診断グレード
ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM)	シグマ-アルドリッチ	D5546
抗ヒトCD45抗体	BioLegend	304002	マウスモノクローナル、クローンHI30、アイソタイプIgG1k。500 ng/ml
の作業濃度 抗ヒト CD1a 抗体	AbD Serotech	MCA80GA	マウスモノクローナル、クローン NA1/34-HLK、アイソタイプ IgG2a。10 µの作業濃度。g/ml
マウスモノクローナル IgG1 アイソタイプコントロール	Abcam	ab27479
マウスモノクローナル IgG2a アイソタイプコントロール	Dako	X094301-2
ベクタステイン ABC エリート スタンダードキット	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-アミノ-9-エチルカルバゾール) ペルオキシダーゼ 基質 凧	Vector Labs	SK-4200
Mayers ヘマトキシリン	HistoLab	01820
永久埋込用水性封入剤	AbD セロテック	BUF058C
乾燥炉
DPX永久埋込液	VWR	360292F
光学顕微鏡	ライカ		ライカ DMLB
顕微鏡カメラ	ライカ		DFC 320
分析ソフトウェア	ライカ		Qwin V3
酵素消化
ハンクの平衡塩溶液 (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
ジチオスレイトール (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
コラゲナーゼ II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ロシュ
RPMI 1640	シグマ-アルドリッチ	R8758
鉗子
プラットフォームロッカー	グラント機器	PMR-30
50 ml円錐管ファ	ルコン	14-432-22
40&マイクロ;m細胞ストレーナー	Falcon	352340
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit	Life Technologies	L34957
CD45	BD	555485
CD3	BD	557757
CD20	BD
CD56	Biolegend	318332
CD66abce	Miltenyi	130-101-132
HLA-DR	BD
CD14	BD	557831
CD16	Biolegend	302026
CD11c	BD	560369
CD1c	Miltenyi	130-098-009
CD141	Miltenyi	130-090-514
CD103	Biolegend	350212
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	F8775
LSR II フローサイトメーター	BD		フローサイトメーター
FlowJo	FlowJo		解析用ソフトウェア