方法論記事

ショウジョウバエのグルーミング行動の定量

9.2K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/55231

⸱

2017年7月19日

 ,  , 
1Department of Biology, Williams College

この記事について

サマリー

このプロトコールは、グルーミング行動を測定するための堅牢で定量的なデータをもたらす、 ショウジョウバエにおけるスケーラブルな個々のグルーミングアッセイ技術を記載する。この方法は、一定期間にわたり、無毛化された動物と不毛化した動物の体の色素蓄積の差を比較することに基づいている。

要約

ショウジョウバエのグルーミング行動は、前肢および後肢の両方の協調運動を必要とする複雑な多段階歩行プログラムである。ここでは、 ショウジョウバエのグルーミングの小規模または大規模の研究のいずれかのための費用対効果とスケーラビリティであるグルーミングアッセイプロトコルと新規チャンバーデザインを紹介します。ハエはブリリアントイエロー染料と体内の体から染料を除去するために与えられた時間で彼らの体のいたるところに散布されます。次に、フライを一定量のエタノール中に沈着させて色素を可溶化する。グルーミングされた動物と不毛飼育された動物の色素 - エタノール試料の相対的な吸光度を測定し、記録する。プロトコルは個々のハエの色素蓄積の定量的データをもたらし、これは容易に平均化され、サンプル間で比較され得る。これにより、実験的デザインは、突然変異動物研究または回路操作のためのグルーミング能力を容易に評価することが可能になる。この効率的な手順は、汎用性と拡張性の両方を備えています。我々はwを示すショウジョウバエ I型ドーパミン受容体（ DopR ）のためのWT動物と突然変異動物との間のプロトコルおよび比較データのork-flow。

概要

ショウジョウバエmelanogaster （ D. melanogaster ）のグルーミングは、複数の独立した運動プログラムの調整を含む強力な生得的な行動である1 。フルーツの飛行は、ビジョンや飛行などの正常な生理機能を阻害する可能性のあるほこり、微生物、およびその他の病原体の体を清潔にするか、または重大な免疫挑戦につながります。機械的2および免疫活性化3の両方を感知し、応答すると、十分にきれいになり、グルーミングが身体の別の部分に進行するまで、ハエはそれらの足を一緒に、または対象の身体領域上で繰り返し擦る。ハエは、主に定型パターン1,4で発生する異なる発作でグルーミング運動を行います。グルーミング信号が優先されると、行動階層が明らかになる。回路と活動のパターンは、階層の最上部にあるグルーミングプログラムが最初に発生し、その後5手入れされている身体の領域からパラレル信号を抑制FAモデル。頭部に最も高い優先順位が与えられ、次に腹部、翼部、そして最後に胸部が与えられる5 。

D. melanogasterのグルーミングプログラムは、神経回路、調節分子シグナル、および神経伝達物質を研究するための理想的なシステムです。例えば、ニューロフィブロミン機能6の妥協、 ショウジョウバエ脆弱X精神遅滞タンパク質（ dfmr1 ） 7の 喪失 、およびビスフェノールA（BPA） 8への曝露はすべて、神経線維腫症の個別のヒト症状である壊れやすいX症候群に類似した過剰なグルーミングおよび他の挙動を引き起こすシンドローム、および自閉症スペクトル障害および注意欠陥多動性障害（ADHD）の局面が含まれる。グルーミングの行動もハビツァになることができます突然変異株2を差別的に区別し、この運動プログラムを行動可塑性の研究に貸与する。 ショウジョウバエによってモデル化され得る神経学的現象の幅は、ハエが自分自身を調整する能力を測定するための新規な比較アプローチを必要とする。

小胞モノアミントランスポーターの組み合わせ作用と体内のドーパミンおよび他の生体アミンの相対的存在量は行動9、10グルーミングショウジョウバエを媒介することが示されています。オクトパミンとドーパミンは、断頭されたハエの同等の後部グルーミング活動を刺激しますが、オクトパミンの前駆物質であるチラミンもまた、より少ない程度でグルーミングを引き起こします7 。四つのドーパミン受容体はキイロショウジョウバエ 11、12、13、14で同定されています。このプロトコールに記載されているグルーミングアッセイ法を使用することにより、我々は、後天的グルーミング行動15におけるI型ファミリードーパミン受容体DopR（ DopR、dDA1、dumb ）の役割を決定した15 。

グルーミングを間接的に動物が完全マーカー色素または蛍光ダスト5、16で全体体を散布した後、グルーミングことが可能な清浄度の程度を調べることによって定量することができます。身体に残った残りの塵は、全体的な行動の相対的マーカーとして使用することができます。グルーミングするのに十分な時間が与えられた後のほこりは、グルーミング行動の特定の欠点を示している可能性がある。グルーミング調査がより広範になったので、プロトコルは、首の結合神経10に薬理学的処置を加えるための断頭、グルーミング応答2を誘発するための剛毛の触覚刺激、行動のビデオ録画15 。グルーミングの直接観察は、目視観察を使用し、特定のグルーミングイベントの頻度と期間を手作業で記録することによって、容易に研究することができます4 。

我々は、3Dプリンタまたはレーザーカッターで構築できる15ウェルのグルーミングチャンバーを設計し、青写真のデザインは再現のために利用可能である15 。この設計では、メッシュで仕切られた開口部を有する2つの接合された中央プレートと、ハエおよび/または染料がそれぞれ装填される2つの追加のスライド式上部および底部プレートとを使用する。散布したハエの草分けを許可した後、我々はそれらをエタノールに沈殿させて染料を可溶化し、この溶液の吸光度を染料の波長で測定する。複数の平行なサンプルにはプレートリーダーを使用でき、個々のサンプルにはシングルリード分光光度計を使用できます。この方法は、ハンドリングによって引き起こされる誤差を最小限にし、より小さな、コスト効率の高いスケールで実行されるグルーミングアッセイの最低水準。この方法は、温度感受性回路操作5ための加熱要素と、より大きなグルーミングチャンバを使用ジュリーシンプソンとAndrew種子、によって開拓された方法に由来し、修飾されています。以下のプロトコールは、全身の毛づくろいの定量化を示し、個々の身体部分に色素蓄積の定量化のための代替方法を示す。我々はまた、WTとDopR突然変異体の間のサンプル比較データ、およびグルーミング行動のための単純な性能指数を計算する方法を提示する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1.準備

  1. 生きたショウジョウバエを培養バイアルからグルーミングチャンバーに移動するための吸引器を準備する。アスピレーターは、麻酔がその後の行動観察に影響しないように、行動室に意識のある動物を移すことを可能にする。
    1. はさみを使用して、1.5フィートのタイゴンチューブID 1/8 "、OD¼"を切断します。1 mLの使い捨てマイクロピペットチップの先端から少なくとも1インチは外します。カット先端に1cm四方のメッシュ（開口部0.196インチ）を保持する。
      注記：ほとんどの1mLチップには、チップがパッケージボックスに収まるグラデーションラインがあります。通常、そのラインまでカットされます。
    2. 新しい1 mLのマイクロピペットチップをメッシュ/カットチップの上にしっかりと置きます。 2つのヒントの間にメッシュフォームがきつい障壁があることを確認してください。新しいチップの内側はハエのための保持室を作ります。
    3. 新しいマイクロピペット先端の極端な先端を切断して、シングルフライの通過を可能にするのに十分な開口部を広げる。ホールeは、グルーミングチャンバの開口部（直径約1.5~2mm）にほぼ一致する。
    4. 入れ子状の先端をタイゴンチューブの端にぴったりとはめ込みます。ヒントをチューブに押し込んで、真空圧力に耐えられるようにしっかりと固定します。
    5. チュービングのもう一方の端で、200μLのマイクロピペットチップの先端を切断し、細い切断端をチューブにはめ込む。これはアスピレーターの「口」側です。
  2. アリコートチューブを準備する。風袋計量紙に約5mgのブリリアントイエロー染料を秤量する。塵を0.6 mLのマイクロ遠心チューブに注ぎ、キャップをしっかり閉めます。
    注：一部のラテックス手袋は染料に対して透過性であるため、アリコート調製中にニトリル手袋を使用することをお勧めします。
  3. 実験中のすべてのサンプル（各チャンバーのすべてのフライに対して1つずつ）について、ステップ1.2）を繰り返す。
  4. エタノール（EtOH）チューブを調製する：100mLのEtOH 1mLを1.5mLのマイクロ遠心チューブにピペットで入れる。遺伝子型または条件についてチューブにラベルを付ける
  5. 実験のすべてのサンプル（各チャンバーのすべてのフライに対して1つずつ）について、ステップ1.4）を繰り返す。グルーミングアッセイの完了のためにEtOHチューブをキャップして保存する。少なくとも1つの「ブランク」サンプルも含まれています。このサンプルは、ネガティブコントロールのためのフライなしでEtOH 1 mLのみになります。
  6. 各グルーミングチャンバーを、摺動天板（より小さな穴を有する）をねじ込むことによって組み立てるが、ほこりの添加のために底板（より大きな穴を有する）を取り外したままにする。
  7. 各必要なグルーミングチャンバーを、上面を下にした台の上に平らに置きます。フライエントリー側がフェイスダウンです。
  8. チューブを所望のウェルの上にあるチャンバの表面に当てて、各チャンバに5mgのブリリアントイエロー色素アリコートをロードする。すべてのほこりがメッシュを通って天板に落ちるように、テーブルに向かってチャンバーをタップします。
  9. 円錐形の開口部の広い方の端が外側を向くように、底板を各チャンバーにねじ込み、穴がウェルの上に載っていないようにします。ボットを保護するトムプレートがしっかりとスライドして染料を放出しないようにします。
  10. チャンバーを裏返しにして、テーブルに数回平らにノックして、ほこりがメッシュを通って底板に載るようにします。
  11. 小さな穴が15個のウェルと整列するように、チャンバーの天板を「開位置」にスライドさせて、個々のウェルにハエを導入できるようにします。

2.フライダストとグルーミング

  1. ストローを使用しているかのようにアスピレーターの一端を静かに吸い込んで、1本のフライを口腔アスピレーターに入れます。軽く吹いて、ターゲットに向かって開口部を向けることによって、ハエを沈着させる。
  2. 実験に使用された各ウェルに1つのフライを吸う。ウェルをロードした後、フライがチャンバー内に閉じ込められるようにトッププレートをスライドさせ、他のウェルをロードしている間にフライの脱出を防ぐためにチャンバー全体のローディング中にテープをウェルの開口部の上に置きます。複数のハエが1つに吸引された場合eは、1つのフライだけが残るまで、その開口部を開けたままにしておきます。
  3. 必要な井戸のすべてがハエで満たされた後、ボトムプレートが上向きになるようにチャンバを反転させて、ホコリがメッシュを通ってハエを覆う可能性があるようにします。
  4. スクリューを締めて上部と下部のプレートをしっかりと固定し、ボルテックスして4秒間飛ばします。
  5. 染料が反対側に落ちるように、テーブル（上のプレートを下にして）を2度ノックしてください。次にチャンバーを裏返し（天板を上にして）、チャンバーを2回ノックして、上部チャンバーに保持されたフライから底部チャンバーの床に染料が落ち着くようにします。
  6. グルーミングが許可されていないコントロールハエについては、すぐにプロトコールのステップ3に進む。アッセイを完了するハエについては、ステップ2.7に進む。
  7. 上のプレートを上にしてテーブルまたはカウンタートップに30分間部屋を平らに置いて、ハエがきれいになるようにします。チャンバーを置く騒音と振動のない空間で、すべてのグルーミング実験（照明レベル、湿度、温度）を一定に保ちます。 RTまたは25°Cの湿度コントロールを備えた卓上型インキュベーターが理想的です。

試料の調製および吸光度分析

  1. 天板を上にしてチャンバーを水平に保ち、底板を緩やかに緩めて、チャンバーから取り出し、色素を失わないように注意してください。
  2. ハエが麻酔されるまで、気流の少ないフライCO 2パッドにチャンバーを置きます。
  3. チャンバーからトッププレートを外します。注意深く鉗子を使用して脚をつかみ、各チャンバーから1つの飛散したフライを動かし、EtOHを含む1.5mLの微量遠心チューブに入れてください。各フライを含む15個のチャンバーの移動時間は約3〜5分である。実験の効率的なステージングを確保するために、複数のチャンバーで驚異的な実験を行う場合、実験者は移動時間を考慮する必要があります。
  4. 各マイクロ遠心チューブに1フライが含まれたら、キャップを閉めてチューブを3回転倒させて、色素とエタノールの溶液を攪拌して混合します。
  5. エタノールとハエを含むチューブを室温で5時間インキュベートして、フライから溶液中に染料を完全に除去する。 5時間後、各チューブ（2秒間）を短時間ボルテックスして、ハエからの染料のクリアランスを確保する。
  6. プレート上の各サンプルの位置に注目して、使用可能であれば、96ウェルプレートのウェルに50μLの実験用1.5mLチューブを分注する。試料5xを希釈するために200μLのEtOHを添加する。この希釈は、多量の飛散したハエや大きなグルーミング欠陥の天井効果を回避します。
  7. プレートリーダーを使用して、各サンプルを397 nmで分析します。あるいは、プレートリーダーが利用できない場合、可視スペクトルの標準分光光度計で個々のサンプルおよびブランクの吸光度を測定する。
  8. プレートリーダーを介してサンプルを読み取り、記録し、スプレッドシートをレコーダーで保存するdプレート上のサンプル。

4.結果の定量化

  1. すべてのサンプルの結果をコンパイルし、各遺伝子型または条件の分散を測定します。
    注：時間0分および時間30分の色素蓄積は、一元配置ANOVAおよびBonferroni補正または複数の平行比較のための他の補正による統計分析を用いて、別個の条件とみなされる。
  2. 次の式を使用して、各遺伝子型/条件についてのグルーミングパーセンテージ差を計算する：[時間0における色素蓄積平均値 - 時間30 'における色素蓄積平均値] /時間0における色素蓄積平均値]×100。
  3. バープロットで各遺伝子型と状態のパーセンテージを表現し、遺伝子型と条件を比較する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

グルーミングアッセイは、グルーミングの測定時間（30分）後にハエの体に残った色素の相対的残量に基づいて行動性能を評価するための定量的データをもたらす。スライドグルーミングチャンバー設計のサンプル画像およびアッセイの主要なステップが図1に示されています 。ハエは、色素の存在下でボルテックスすることにより、即時の散布からかなりの量の色素を凝集させる（ 図2d、2e ）。散布されたハエは、アッセイ後の色素蓄積の範囲を保持することができる（ 図2f、2g ）。したがって、EtOH中に色素蓄積を可溶化し、個々の試料の吸光度を測定することにより、再現可能で非常に定量的なグルーミング能力の評価が提供される。

後肢グルーミングの調節にDopRのこの研究では、（強いハイポモルフのグルーミングの性能を比較しました

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

グルーミングアッセイは比較的簡単ですが、以下の問題に特別な注意を払うように実験者に注意します。ハエと染料を導入した後、上板と下板のネジを締めることでしっかりとシールを維持することは、再現性のある結果には不可欠です。ブリリアントイエロー染料は非常に細かく、ゆるいジョイントはチャンバーの端から染料を失うことになります。個々のウェルの色素含有量の不規則性は、不均一な散布がグルーミングイベントの変動および偽陽性率を増加させるため、グルーミング定量化を容易に捨てることができる。さらに、実験者は、30分間のグルーミング期間中にグルーミングチャンバーを保持する環境を知っておくことをお勧めします。 ショウジョウバエ行動アッセイの一貫した性能を得るためには、温度、照明、時間、および湿度に対する環境の不変性が不可欠です。気を散らすことを最小限に抑えるために小さなインキュベーター内にグルーミングチャンバーを保持するさまざまなラボ環境が結果の最大限の再現性には理想的ですが、他の空間配置も成功する可能性があります。

色素蓄積測定に関しては、色素がラテックス手袋に対して透過性であることが観察...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、利害の対立を宣言していない。

謝辞

この方法論とチャンバデザインのテストと確立の初期の仕事については、Brian Shepherd、Tat Udomritthiruj、Aaron Willey、Ruby Froom、Elise Pitmon、Rose Hedreenに感謝します。私たちはKelly TellezとGraham Buchanに原稿の読み書きについて感謝します。 Brilliant Yellow Dye（Sigma）の使用を提案する上での先駆的な仕事と助言と支援についてAndrew SeedsとJulie Simpsonに感謝します。この仕事は、Mary E. Groff外科医学研究および教育慈善団体、ブロンフマン科学センター、ヘルマンフェロープログラムによって一部サポートされています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ハイフレックスタイゴンPVCクリアチューブマクマスターカー5229K54ID 1/8インチ、OD 1/4インチ、マイクロピペットチップとメッシュを使用して口内吸引器を構築
マイクロピペットチップ(1mLおよび200 μL)ジェネシーサイエンティフィック24-165、24-150R
ナイロンメッシュスクリーン、2 x 2.6インチMcMaster-Carr9318T44グルーミングチャンバーと口の吸引器を構築するために使用されます
デュモン#5鉗子ロボッツ手術器具RS-5050
リアントイエロー染料グマアルドリッチ201375-25Gこの製品を
取り扱う際にはニトリル手袋の使用をお勧めしますVortexerFisher Scientific12-812set to "touch"
エタノールCarolina Biological Supply86-1282
1.5 mL 微量遠心チューブVWR International10025-726
0.65 mL 微量遠心チューブVWR International20170-293チューブは、連続アッセイで再利用可能
UV 96 ウェルプレートCorning
BioTek Synergy HTX プレートリーダーBioTekhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Microsoft ExcelMicrosoftにアクセスするためにカタログをダウンロードする必要がありますhttps://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
ショウジョウバエインキュベーターTritechDT2-CIRC-TK
1/4 "アクリルプラスチックMcMaster-Carr8473K341
8 - 32McMaster-Carr90257A009
8 - 32 x 1 "六角キャップネジMcMaster-Carr92185A199底板は、このサイズのネジ8
- 32 x 1/2 "六角キャップネジのためにタップする必要がありますマクマスターカー92185A194上から2番目のプレートは、
タップする必要があります2 - 56 3/8"フラットヘッドフィリップス小ネジMcMaster-Carr91500A088これらは、2つの中間プレートを一緒に保持
0.175インチID、1/4インチOD、0.34インチアルミパイプマクマスターカー92510A044自社で製造。記載されている製品はほぼ同じ寸法で、サイズ8のネジで機能します。 これらは1インチネジのシースとして機能し、六角キャップをトッププレートの表面から少し上に設置
ブリシ26014017 は、製品番号 Gen5 マイクロプレート リーダーおよびイメージャー ソフトウェア BioTek ナット しますします

参考文献

  1. Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
  2. Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
  3. Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
  4. Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
  5. Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).
  6. King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
  7. Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100(2011).
  8. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
  9. Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
  10. Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
  11. Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
  12. Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
  13. Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
  14. Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
  15. Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
  16. Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
  17. Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758(2015).
  18. Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事