マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激

哺乳類のNotchシグナル伝達経路は、 キイロショウジョウバエで同じ経路に相同であり、4つの膜貫通Notch受容体（Notch1-4）とジャグ（JAG1＆JAG2）とデルタ様（DLL1、3の5膜結合リガンドで構成されてい＆ 4）家族^1。受容細胞のNotch受容体は、送信セル²のリガンドによって結合されるときに、ノッチシグナリングが開始されます。このトランス活性化の際に、膜結合Notchリガンドは、膜結合型Notch受容体^3,4の伸縮力を生成します。リガンド結合の伸縮力は、プレセニリン含有γ-セクレターゼ複合体（γセクレターゼ）によって媒介される細胞内切断事象に続く変換酵素（TACE）TNFアルファによる受容体の細胞外切断を促進するNotch受容体の立体構造変化を誘導します。 γセクレターゼのリリースノッチint型それはCBF-1-蘇（H）-Lag-1（CSL）、首謀者様（MAML）と転写活性化複合体を形成する核に移行し、細胞型特異的因子の発現を駆動するracellularドメイン（NICD）標的遺伝子⁵の。

インビトロでの Notch経路活性化の独特な方法が必要でNotchシグナル伝達活性化の結果の機械要素。可溶性Notchリガンドは、受容体のNotchに結合するが、同時に競合的に細胞関連Notchリガンドの結合を抑制しつつ、NICDのリリースのために必要な伸縮力を生成するために失敗することがあります。したがって、培養培地に可溶性のNotchリガンドの添加は^{6,7シグナリング}通常のノッチを減衰させることができます。それらが適切にリジッド基板^{5、 図8、 図9}に固定されている場合には幸いなことに、Notchリガンドは^、NICDの放出を誘導することができます^10。リガンドコートした培養基板上に細胞を播種または細胞へのリガンドでコーティングしたビーズを適用し、両方のNotchシグナル伝達を活性化し、それらの間の選択は、Notch刺激の所望のタイミングに主に依存することができます。機能または分化アッセイの中点の間に所望されるように、即時、一時的なNotchシグナル伝達の活性化のために、Notchリガンドは、アガロースビーズに結合させることができ、培養細胞に適用し、任意の時点で洗い流さ。培養期間の開始から、より持続的なNotchシグナル伝達のために、組織培養プレートを細胞播種の前に、リガンドでコーティングすることができます。

このプロトコルの目的のために、方法は、マウス破骨細胞前駆体を用いて行われるが、ここで記載された方法の方法及び変形は、細胞タイプ^{6、11、12、13}の広範囲に適用可能であり^、 14。破骨細胞は、骨組織の再吸収に関与している分化した造血LINAGE細胞であり、それらは、骨喪失¹⁵の多数の疾患に関与しています。したがって、それらの単球/マクロファージ系統の前駆体とその機能を制御する分子機構からの破骨細胞の分化のin vitroでの研究では、破骨細胞と新しい骨再生治療法の開発をよりよく理解するために不可欠です。それは現在、一般的に、そのNotchシグナル伝達は、破骨細胞の分化および機能に積極的な役割を果たして受け入れられているが、Notchシグナル伝達の刺激および破骨細胞前駆体の培養および分化の両方の変化は、最初は相反する知見^{16、17、18、19}につながりました。クローサー方法の違いの検査や遺伝子の使用モデルが大幅破骨細胞形成におけるNotchシグナル伝達の役割を明らかにしているが、標準化されたノッチ刺激および培養方法の適用は、他の細胞型^{20、21、22、23}におけるNotchシグナル伝達の今後の研究で、このような論争を防ぐことができます。

Notchシグナル伝達を刺激するための様々な方法のように、最善の方法は、実験的な質問に依存し、そこに培養すると、マウスの破骨細胞前駆体を区別するための複数の方法がある、と。ここで、マウスの長骨からフラッシュ骨髄細胞の接着性および非接着性画分を培養する我々の好ましい方法は提示されます。この方法は、本質的に特殊な装置を必要とせず、分化の様々な方法に適用可能である細胞を産生するという利点を有します。

脊椎動物に関わるすべての研究はペンシルバニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルに従って行われました。

1.培養培地の準備

1. 100 mlの熱900 mLのH ₂ O中で最小必須培地（MEM）粉末1.9グラムの重炭酸ナトリウムを溶解させることによってα-MEMを調製し、2mM L-グルタミン、100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンを補充不活性化ウシ胎児血清。 0.22μmのポリエーテルスルホン（PES）フィルターを用いて滅菌します。
2. 35 ngの/ mlの組換えマウスマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）とα-MEMを補足することによってマクロファージ培地を調製
3. 100ng / mlのRANKLとマクロファージ培地を補充することによって破骨細胞培地を準備

2.骨髄細胞の単離

1. α-MEM 10ミリリットルとマウスあたり25⅝ゲージ針で1 10ミリリットル注射器を埋めます。 1.3 L /分の流量でCO _2〜10分間の暴露を介してマウスを安楽死させます。解剖を進める前に、頸椎脱臼とCO ₂の暴露に従うことによって、動物の死亡を確認してください。
2. クリーンな技術を使用して、ばらばらにすると脛骨と大腿骨を分離します。脛骨と大腿骨を露出するように、各後肢の前面に沿って切開を行う前に、70％エタノールでマウスの皮膚を消毒します。
   1. 大腿骨の遠位端を解放するために膝関節を切断し、可能な限り骨盤に近い大腿骨を切断。大腿骨を削除し、できるだけ多くの軟組織を清掃してください。足首を切断脛骨を、削除して、できるだけ多くの軟組織を削除します。
3. 単一のチューブに単一のマウスから骨髄フラッシュを組み合わせたα-MEM 2.5ミリリットル、室温で15ミリリットルコニカルチューブに鉗子とフラッシュ骨髄と骨を持ちます。
   注：成功した骨髄フラッシュはトンの着色を変更します赤からベージュに彼は骨。
4. 残骸がチューブの底に沈殿し、任意の破片を移すないように注意しながら、クリーン15ミリリットルコニカルチューブに上清を転送することができます。
   注：一部の細胞は、骨髄の破片で落ち着くことがあります。細胞のより多くが要求される場合、骨髄フラッシュクリーンな15mlチューブに70μmの細胞ストレーナーを通して濾過することができます。
5. 細胞をペレット化するために、室温で5分間300×gで遠心分離管（複数可）。
6. 真空バッファを溶解する0.5 mlの塩化アンモニウム - カリウム（ACK）で上清を再懸濁細胞ペレットを吸引し、赤血球を溶解するために3分間37℃でインキュベートします。
7. ACK-細胞溶液に直接10mlのPBSを追加し、5分間、300×gで遠心。
   注：以前に赤い細胞ペレットは現在、ベージュにする必要があります。
8. 100ミリメートル組織培養処理皿で真空吸引上清とペレットを再懸濁し10ミリリットルα-MEM中で、プレート。加湿で37℃で一晩細胞をインキュベート組織培養インキュベーター。
   注：細胞をカウントすることは、このステップは必要ありません。この間、骨髄からの接着細胞培養表面に付着します。非接着性骨髄細胞集団は、懸濁液中に残ります。 MCSFは、この最初のインキュベーション中に培養培地中に存在しません。

破骨細胞前駆体の3充実

1. 骨髄フラッシュ一晩インキュベートした後、50mlコニカルチューブに非接着細胞を含む転写培養上清。
   注：骨髄間葉系前駆細胞を含む接着細胞を含む培養皿を、廃棄することができるか、または他の実験のために、所望であれば、新たなα-MEMを用いて供給しました。
   注：破骨細胞は5日間隔日破骨細胞培地および爽やか培地に4×10 ⁵細胞/ cm ²の密度で組織培養処理皿にそれらをプレーティングすることによって、これらの非接着性骨髄細胞から直接分化させることができます。 18 mlの最終体積に、非接着細胞溶液にα-MEMを添加し、35 ngの/ mlの最終濃度になるようにM-CSFを追加します。
2. 6〜60ミリメートルの懸濁培養皿に細胞懸濁液3mlのそれぞれを加えます。
3. 加湿した組織培養インキュベーター中で37℃で一晩培養します。この時間の間に、M-CSFは、さらに、非組織培養処理された表面に付着することができる、マクロファージの分化を刺激します。
4. 3ミリリットルの新鮮なマクロファージ培地で一晩インキュベートした後、再給紙破骨細胞前駆体。これは、マクロファージに分化していない非接着細胞を除去します。
5. 2日間37℃、5％CO ₂で培養破骨細胞前駆体に継続するか、培養物は、約70％コンフルエンスに達するまで。

4.破骨細胞の分化

1. 5ミリリットルのPBSで破骨細胞前駆体を洗い、セル画まで、室温で1ミリリットルの海洋由来のタンパク質分解/コラーゲン分解酵素で細胞を処理lsコマンドは、プレートの穏やかなタッピングによって外れることができます。
   注：彼らはサスペンション皿で培養される場合破骨細胞前駆体だけ持ち上げることができます。前駆体が持ち上げられるために、組織培養処理された表面にあまりにもしっかりと取り付けます。トリプシンは、破骨細胞前駆体を活性化することができ、回避されるべきです。
2. 50ミリリットルコニカルチューブに各皿と転送細胞にα-MEM 4ミリリットルを追加します。血球計数器を用いて細胞を計数し、ミリリットル5×10 ⁴細胞/密度に細胞を希釈し、100ng / mlの最終濃度35 ngの/ mlおよびRANKLの最終濃度になるようにM-CSFを追加します。
3. 組織培養処理プレートに2.6×10 ⁴細胞/ cm ²の密度でシード細胞及び2日間、加湿組織培養インキュベーター中、37℃でインキュベートします。分化は、典型的には5×10 ⁴個^の細胞を各ウェルに播種された24ウェルプレートで行われます。
4. 2日1ミリリットル新鮮osteocで培地を交換することにより、分化、再給細胞の開始後最後の培地。
   注：破骨細胞分化は、通常3日以内に完了します。得られた破骨細胞は、TRAP染色簡単に定量化し、形態素解析のためにすることができます。

Jagged1コーティングされた表面とNotchシグナルの5連続刺激

1. 10μg/ mlの濃度でPBS中のヤギ抗ヒトIgG Fc抗体をサスペンド（1：10 mg / mlでストック1000希釈）。 1.3μgの/ cm ²の密度で培養表面に抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。 24ウェルプレートの場合には、ウェル当たり250μlの（2.5μgの）を追加します。
2. 真空吸引井戸と1ミリリットルのPBSで補充します。このステップを2回繰り返します。
3. 10μg/ mlの濃度でPBS中の組換えJagged1-Fc融合タンパク質をサスペンド。 1.3μgの/ cm ²の密度で抗体で被覆された培養表面にJagged1-FCの溶液を加え、室温で2時間インキュベートします。培養表面は、抗体でコーティングされたONLYは、対照として使用することができます。
4. 真空吸引井戸と1ミリリットルのPBSで補充します。このステップを2回繰り返します。乾燥からそれらを防ぐために、直前に細胞播種になるまで、ウェルにPBSを保管してください。
5. シード2.6×10 ⁴破骨細胞コーティングされた表面への前駆体/ cm ²です。 Notchシグナル伝達は、連続的に、少なくとも3日間刺激します。

Jagged1コーティングされたビーズとNotchシグナルの6一時的な刺激

1. 1.5ミリリットルの最終容量を0.5μgの/ cm ²のJagged1-Fcを、21μL/ cm ²とプロテインGアガロースビーズ、およびPBS：適切なサイズのチューブに次のように結合します。 24ウェルプレートの1ウェルについてJagged1ビーズの適切な数を準備するには、1.5ミリリットルに1μgのJagged1-Fcを、40μlのプロテ​​インGアガロースビーズ、およびPBSを兼ね備えています。
2. 4で回転させながらチューブをインキュベート 2時間Cを°。
3. ペレットビーズに1分間300×gで遠心分離管。 1.5ミリリットルのPBSで再懸濁ビーズ。この洗浄を繰り返し2回。
4. 130μL/ cm ²の培養培地中で再懸濁Jagged1ビーズとは、培養細胞に適用されます。
5. 所望の期間、37℃、5％CO ₂でビーズで細胞をインキュベートします。 PBSまたは培養培地の数回の洗浄でビーズを削除します。
6. Notch標的遺伝子転写物の測定値^10を介して活性化シグナル伝達ノッチを確認します。

この方法の目的は、文化にあると破骨細胞前駆体でNotchシグナル伝達を刺激します。ときに適切に培養し、破骨細胞前駆体は、滑らかな細胞質（ 図1A）と主に細長い紡錘形の形態を示します。ケアは、破骨細胞前駆体の免疫学的活性化を避けるために注意すべきです。活性化の際に、前駆体が広がり、泡沫状細胞質（ 図1B）で平らになります。これらの「目玉焼き」細胞は、RANKシグナルに耐性があり、効率的に成熟破骨細胞に分化しません。正しい文化と分化条件下で、濃縮された破骨細胞前駆細胞は分化すると3日間（ 図1C）内の大きなTRAP陽性多核破骨細胞へのヒューズ。

24時間以内のNotch標的遺伝子を調節アップJagged1-Fcをコーティングした表面上に、破骨細胞前駆体を播種（ 図2）。 Notchシグナル伝達によってアップレギュレートされた特定の遺伝子は、細胞の種類によって異なります。 Hey2およびMycは、同様に、適度にアップレギュレートされているものの、破骨細胞前駆体の場合には、Jagged1によってアップレギュレートされた最も優勢な遺伝子は、Hes1をです。例えばHey1およびp21などの他のNotch標的遺伝子の発現が有意に破骨細胞前駆体のJagged1刺激によって変更されません。

破骨細胞前駆体は、24ウェルプレート中で培養した場合、わずか600 ngのJagged1-Fcでコーティングしたビーズを用いた治療は、24時間（ 図3）内Hes1を発現の有意な増加を示します。四十八時間治療は、より少ない程度にかかわらず、Hes1を発現における同様の増加を示しています。

図1：文化と破骨細胞前駆体の分化。 （A）35 ngの/ mlのMCSFとし、活性化刺激なしで培養ナイーブ破骨細胞前駆細胞は、滑らかな、紡錘状の形態を有しています。 =25μmのスケールバー。 （B）、免疫学的活性化されると、破骨細胞前駆体は平坦化された、泡が充填された形態を採用し、破骨細胞に分化されません。活性化を誘導するために、破骨細胞前駆体は、16時間、10ng / mLのリポ多糖で処理しました。 =25μmのスケールバー。 （C）免疫学的に3日間35 ngの/ mlのMCSFおよび100ng / mlので培養したナイーブ付着破骨細胞前駆体は、成熟破骨細胞に分化します。成熟破骨細胞は、大きな多核、およびTRAP陽性です。スケールバー=200μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：固定化されたJagged1-Fcの上にめっき破骨細胞前駆体におけるNotch標的遺伝子のアップレギュレーション。破骨細胞前駆体は、固定化されたJagged1-Fcの上にプレーティングし、24時間培養しました。培養期間中、式Hes1を、Hey2、およびMyc mRNAを増加させました。その他のNotch標的遺伝子、Hey1およびp21は変更されませんでした。エラーバーは平均の標準誤差であり、有意性は、スチューデントの1テールt検定を用いて評価しました。 *、P <0.05。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：Jagged1-Fcをビーズで処理した破骨細胞前駆細胞におけるHes1をmRNAのアップレギュレーション。プロテインGアガロースビーズに結合した600 ngのギザギザ-Fcは、24ウェルプレートのウェルで培養破骨細胞前駆体におけるHes1を発現をアップレギュレート暴露の24時間以内。 Jagged1-ビーズによるHes1を誘導はJagged1-Fcをコーティングしたプレートにより誘導されるHes1をレベルに匹敵しました。強くJagged1-Fcをコーティングしたプレートによって誘導されなかった他のNotch標的遺伝子が評価されませんでした。エラーバーは平均の標準誤差であり、有意性は、スチューデントの1テールt検定を用いて評価しました。 *、P <0.05。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。