ヒトインフルエンザAウイルスの全身および局所的なゼブラフィッシュ感染モデルが示されています。全身感染モデルを用いて、ゼブラフィッシュは抗ウイルス薬のスクリーニングに使用することができます。局所感染モデルを使用して、ゼブラフィッシュは宿主免疫細胞の応答を特徴付けるために使用できます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、
この記事について
サマリー
要約
毎年、季節性インフルエンザの発生は世界中の社会に深刻な影響を与えています。世界的な取り組みにもかかわらず、インフルエンザは依然として医療の難治性の負担となっています。感染を抑制するための主要な戦略は、毎年のワクチン接種です。インフルエンザに罹患した人では、抗ウイルス薬が症状を緩和することができます。インフルエンザと闘うための代替戦略を開発する必要性は明らかで、満たされていない。宿主とインフルエンザの相互作用をモデル化するために、いくつかの動物モデルが作成されています。ここでは、全身性および限局性ヒトインフルエンザAウイルス(IAV)感染に対するゼブラフィッシュモデルを生成するためのプロトコルについて説明します。全身性IAV感染モデルを用いて、抗ウイルス活性が期待できる低分子をスクリーニングすることができます。その原理証明として、IAV感染ゼブラフィッシュにおける抗ウイルス薬ザナミビルの有効性を実証するプロトコールが記載されています。IAV感染ゼブラフィッシュにおける潜在的な抗ウイルス薬の相対的な有効性をスコアリングするために、疾患の表現型を定量化する方法を示しています。近年、好中球がインフルエンザ感染に対するヒト宿主の反応に重要な役割を果たしていることが注目されています。ゼブラフィッシュは、好中球生物学の研究に不可欠なモデルであり、人間の医学に直接影響を与えることが証明されています。Tg(mpx:mCherry)ゼブラフィッシュ系統で局所的なIAV感染を生じさせ、局所的なウイルス感染の状況下で好中球生物学を研究するためのプロトコールが記載されている。局所的な感染部位への好中球の動員は、治療への応用が可能な実験的操作を評価するための追加の定量化可能な表現型を提供します。記載されているゼブラフィッシュのプロトコルは両方とも、ヒトIAV感染の側面を忠実に再現しています。ゼブラフィッシュモデルには、高い繁殖力、光学的透明度、薬物スクリーニングへの適合性、好中球などの免疫細胞が蛍光タンパク質で標識されているものを含むトランスジェニック系統の利用可能性など、多くの固有の利点があります。ここで詳述するプロトコルは、これらの利点を活用し、最終的に臨床につながる可能性のある宿主とIAVの相互作用に関する重要な洞察を明らかにする可能性を秘めています。
概要
世界保健機関（WHO）によると、インフルエンザウイルスは大人5〜10％であり、毎年子どもたちの20から30までパーセントに感染し、重症の3〜5000000例の原因となり、世界中の1 50万人が死亡。インフルエンザに対する毎年のワクチン接種は、病気を防ぐための最良の選択肢のまま。 WHOグローバル・アクションプランのような取り組みは、季節性インフルエンザの流行2に関連する罹患率および死亡率を減少させるために、季節性ワクチンの使用、ワクチン生産能力、そしてより強力なワクチン戦略の研究開発が増加しています。ノイラミニダーゼ阻害剤（ 例えばザナミビルおよびオセルタミビル）のような抗ウイルス薬は、一部の国で利用可能であり、発症3、4、5の最初の48時間以内に投与された場合、症状を緩和するのに有効であることが証明されています。グローバルな努力にもかかわらず、季節性インフルエンザの封じ込めのouインフルエンザウイルス抗原ドリフトは、多くの場合、ウイルス6の変化ゲノムに適応するために、現在の能力を超えるようtbreaksは、この時点では手ごわい課題です。ウイルスの新たな株を標的とワクチン戦略は、事前に開....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての作業は、バイオセーフティーレベル2（またはBSL2）米国疾病管理センターによって記述規格（CDC）を使用して実施し、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって確立された指令に基づくべきです。安全性とコンプライアンスを確保するため、適当な当局と協議してください。
1.ゼブラフィッシュの手入れとメンテナンス
- ゼブラフィッシュをスポーンし、実験のための胚の必要な数を収集します。 Adatto らによって記載されたもののような、必要な場合、大量飼育タンク。 図32は 、発育ステージの胚の多数を収集するために使用することができます。
- 胚は低密度で深いペトリ皿中の所望の発達段階（ローカライズされた、泳ぐ膀胱感染の全身IAV感染[セクション3]または5日後に受精のための48時間後に受精[セクション4]）（まで発展することを許可します< 6を含む滅菌卵の水に28℃での100の胚/皿）蒸留水で0 / mlの海の塩（ 例えば 、インスタントオーシャン）。
- プラスチック製のトランスファーピペットで死んだ胚を削除し、最適な健康と発展を確保するために毎日卵水を変更します。
材料および試薬の調製
- 蒸留水とオートクレーブ中で（7.0から....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
ここでは、ゼブラフィッシュにおける全身IAV感染は、薬効（ 図1A）をテストするために使用することができる方法を示すデータが提供されます。 48時間後、受精における胚は、ウイルス感染を開始するためキュビエのダクトを介しAPR8（ 図1C、1F）、X-31（ 図1D、1G）、またはNS1-GFP（ 図1H-1I）を注射します。 48時間後に受精で胚の別のコホートは、ウイルス感染（ 図1B、1E）のコントロールとして機能するように注入しました。 48時間後に感染することにより、IAVを注入したゼブラフィッシュは、心膜（ 図1G）全体に存在する赤血球で、心膜浮腫（ 図1C、1D）と循環停止（ 図1F）の証拠を示しました。早ければ3時間後に感染が認められたとして、蛍光顕微鏡によりNS1-GFP、GFPの最初の式を.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ヒト宿主 - 病原体相互作用をモデル化するために、小さな動物を使用することから得られる利益を最大化するためには、モデルシステムの固有の利点を生かす研究課題とテスト仮説をフレームに重要です。人間IAV感染のモデルとして、ゼブラフィッシュは、高い繁殖力、光学的透明度、薬物スクリーニングに従順、および好中球などの免疫細胞を標識したトランスジェニック系統の可用性を含むいくつかの長所を持っています。ゼブラフィッシュは、炎症および先天性免疫の研究のためのマウスモデルシステムにますます強力な代替手段として開発されました。彼らは開発の最初の4-6週間の間に機能して適応免疫応答を欠いているので、ゼブラフィッシュは、傷害および感染37から保護するために、自然免疫応答をマウントします。開発中のこの初期期間においては、単離し、単独で、自然免疫応答に起因する抗ウイルス応答のメカニズムを研究することが可能です。ティ赤色蛍光タンパク質と好中球のラベル、：作品は、Tgは（mCherryをMPX）のようなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の開発によって促進されてきました。
<.......アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者は、ゼブラフィッシュの手入れとメンテナンスをしてくれたMark Nilan氏と、NS1-GFPを伝播し、IAV力価を決定してくれたMeghan Breitbach氏とDeborah Bouchard氏に感謝したいと思います。本研究は、NIGMSの助成金であるNIH P20GM103534とMaine Agricultural and Forest Experiment Station(公開番号3493)の支援を受けて行われました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| インスタントオーシャン | スペクトラムブランド | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm滅菌使い捨てペトリ皿 | VWR | 89107-632 | |
| トランスファーピペット | フィッシャーブランド | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | ウェスタンケミカル | ||
| ホウケイ酸ガラスキャピラリー、フィラメント付き | サッターインストゥルメント | BF120-69-10 | |
| フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー | Sutter Instrument | P-97 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 鉗子 | 電子顕微鏡科学 | 72700-D | |
| マイクロローダーのヒント | エッペンドルフ | 930001007 | |
| 顕微鏡浸漬油 | オリンパス | IMMOIL-F30CC | |
| 顕微鏡ステージ キャリブレーション スライド | AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 圧力インジェクター | Applied Scientific Instrumentation | ||
| 実体顕微鏡 | オリンパス | SZ61 | |
| 背圧ユニット | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| マイクロピペットホルダーキット | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| フットスイッチ | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| マイクロマニピュレーター | アプライド・サイエンティフィック・インスツルメンテーション | MM33 | |
| マグネットベース | アプライド・サイエンティフィック・インスツルメン | テーション マグネティックベース | |
| フェノールレッド | シグマ・アルドリッチ | P-4758 | |
| 低温インキュベーター | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | ツァイス | ||
| イルミネーター | ツァイス | HXP 200C | |
| 冷光源 | ツァイス | CL6000 LED | |
| ガラス底マルチウェルプレート、24 ウェル | Mattek | P24G-0-13-F | |
| 共焦点顕微鏡 | オリンパス | IX-81 FV-1000 レーザー走査型共焦点システム | |
| Fluoview ソフトウェア | オリンパス | ||
| プリズム v6 | GraphPad | ||
| インフルエンザ A/PR/8/34 (H1N1) ウイルス | チャールズ川 | 490710 | |
| インフルエンザA型X-31、愛知県/68号(H3N2) | チャールズ川 | ||
| インフルエンザ NS1-GFP | は Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Lam et al. 2013 で参照 |
参考文献
- W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
- W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
- De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
