方法論記事

MitoCeption：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトMSCミトコンドリアの転送

DOI：

10.3791/55245

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2017年2月22日

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1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

この記事について

サマリー

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ここでは、プロトコル（MitoCeption）はGSCの代謝および機能に対するそれらの生物学的効果を研究する目的で、神経膠芽腫幹細胞（GSC）を、ヒト間葉系幹細胞（MSC）から単離されたミトコンドリアを転送するために提示されています。同様のプロトコルは、他の細胞型との間のミトコンドリアを転送するように適合させることができます。

要約

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ミトコンドリアは、細胞代謝、エネルギー産生およびアポトーシスの制御に中心的な役割を果たす。不十分なミトコンドリア機能は、神経病変から癌に至るまで、非常に多様な疾患の原因が分かっています。興味深いことに、ミトコンドリアは最近容量を表示することが示されており、さらに現在の関心を高め、ミトコンドリアのレシピエント細胞を代謝および機能的結果と、共培養条件下で癌細胞にヒト間葉系幹細胞（MSC）からのとりわけ、細胞タイプとの間で転送されますこれらの細胞小器官の生物学的特性のために。

標的細胞における転写MSCミトコンドリアの効果を評価することは、細胞 - 細胞相互作用の生物学的結果を理解するために最も重要です。ここで説明MitoCeptionプロトコルは、MSCのミトコンドリアを用いて、標的細胞へのドナー細胞から予め単離されたミトコンドリアの移動を可能にしますモデル系としておよび神経膠芽腫幹細胞（GSC）。このプロトコルは、以前にMDA-MB-231癌細胞を接着するために、MSCをから単離されたミトコンドリアを転送するために使用されてきました。このミトコンドリア転送プロトコルは、in vitroでのニューロスフェアとして成長の具体的な特殊性を提示GSCsのためにここに適合されています。単離ミトコンドリアの転写は、ミトコンドリア生体染色色素を用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）および共焦点イメージングによって追跡することができます。異なるハプロタイプ（のSNP）を有するミトコンドリアのドナーおよび標的細胞の使用は、標的細胞におけるそれらの円形のミトコンドリアDNA（ミトコンドリアDNA）の濃度に基づいて、転送ミトコンドリアの検出を可能にします。プロトコルは、これらの条件で検証された後、転送ミトコンドリアを有する細胞はさらに、細胞代謝、可塑性、増殖、および治療に対する応答としての生物学的特性に外因性のミトコンドリアの効果を決定するために分析することができます。

概要

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ミトコンドリアは、彼らが栄養摂取ならびにエネルギーおよび代謝物の生産において中心的な役割を果たし、真核細胞に見られる細胞小器官です。これらの細胞小器官は、電子輸送鎖複合体、tRNA及びrRNAの1のタンパク質をコードして16.6キロバイトの長円形のミトコンドリアDNA（mtDNAのを）、含まれています。これらの細胞小器官の機能は、ミトコンドリア機能不全1、2、3で細胞ホメオスタシスおよびいくつかの病態のための重要な関連しているされています。ミトコンドリアの状態は、例えば、治療4、5、6、7への転移及び抵抗性の結果この後者の場合には、炎症、感染症および癌に関連しています。

ミトコンドリアはの驚くべき能力を表示します 「ドナー」と「ターゲット」セル間転勤。最近になって、15の異なる研究室8、9、10、11、12、13、14によって示されるように、これは、例えば、組織修復および化学療法剤に対する耐性のような他の機能の改変と同様に、標的細胞のエネルギー代謝の変化をもたらします、16。ヒト間葉系幹細胞（MSC）は、これらの細胞の機能的特性の改変をもたらす、心筋細胞、内皮細胞、肺の肺胞上皮細胞、腎尿細管細胞と癌細胞を含む標的細胞の多種多様なミトコンドリアを転送するこの能力を示します8、> 9、10、12、17、18。

ミトコンドリア交換は、現在の異なる細胞型の数が互いに通信し、それらの生物学的特性を変更することができ、広く使用されるメカニズムとして現れます。このミトコンドリア交換は19複雑なコネキシン43を含むギャップジャンクション8またはM-秒/ TNFaip2とエクソシストを含む、トンネルナノチューブ（TNT）の形成を介して発生する可能性があります。代替的に、ミトコンドリアの転送は、ドメイン含有タンパク質1媒介性微小胞（ARMMs）20アレスチンによって媒介されることが示されました。興味深いことに、ミトコンドリアの転送の有効性は、RhoのGTPアーゼ1 MIRO1 21、iPSC-間のミトコンドリア転送効能の違いを説明するための重要な因子の発現率にリンクされましたMSCおよび成人BM-MSCの22。

細胞と細胞のミトコンドリア交換に関するデータのこの富のにもかかわらず、比較的少ないが、このミトコンドリア転送の代謝性および生物学的結果について知られています。したがって、それは完全に完全にこの転送の生物学的効果を評価するための適切なツールをセットアップ保証します。長年にわたり、受容細胞へのドナーからミトコンドリアを転送するためのいくつかの技術的なアプローチが提案されています。これは27、transmitochondrialサイブリッド26を生成するために、卵母細胞23、24、25、細胞融合にミトコンドリアの直接注入を含みます そして、最近では、光熱nanoblades 28を用いて、単離されたミトコンドリアの転送。

我々と他の人は以前に分離されたmitochondの能力を実証しましたインビトロおよびインビボの両方で観察されたようにRIAは、生細胞によって内在化されます メカニズムを通して29、30、31は 、マクロピノサイトーシス32が関与することを提案しました。我々はさらに、定量的（付着）で例示されるように、標的細胞にMDA-MB-231乳癌細胞株31（MSCS）から単離されたミトコンドリアを転送するために、MitoCeptionと呼ばれる方法を開発しました。このプロトコルは、神経膠芽腫幹細胞（GSCs）の単離されたヒトMSCのミトコンドリアの転送のためにここに適合させました。

神経膠芽腫は急速に主に起因する腫瘍33内に存在する神経膠芽腫幹細胞（GSC）に、治療に耐性となる脳の積極的な悪性腫瘍です。これらのGSCsは、in vitroでのニューロスフェアとして成長し、異種移植モデルにおいて腫瘍を発生させます。神経膠芽腫内癌細胞は持っています放射線治療抵抗性星細胞腫のネットワーク34で、その結果、移行することができるミトコンドリア（ならびにカルシウムおよび細胞核）まで延長マイクロチューブを介して、その相互接続アストロサイトの脳腫瘍細胞のために最近示されるように、細胞から細胞への接続を行うための能力。神経膠芽腫は、MSC 35、36を含む、腫瘍微小環境内の多くの異なる細胞を動員することができます。我々は、GSC機能的特性を変更すると予想される（データは示さず）MSCは共培養でGSCsと細胞間接続を行い、それらのミトコンドリアを転送することができることを示しました。現在のプロトコルはMitoCeption技術はそれらの機能の生物学的結果を決定する目的でヒトGSCsに、ヒトMSCからのミトコンドリア、孤立事前を転送するために使用する方法について説明します。多能性の高い腫瘍形成GB4 GSC線37は、この研究において使用しました。

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プロトコル

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1日目

間葉系幹細胞の1ラベリング（MSC）ミトコンドリア（オプション）

  1. 1日目に培養液中で4×10 5 MSCを有するように二日、ミトコンドリアの準備の前に、10ミリリットルαMEM/ FBS 10％で、100ミリメートル培養皿にヒトMSCをシード。
  2. PBS（4ml）でMSCをすすぎ、4ミリリットルαMEM/ FBS、1％を追加（37℃に予め温め）。
  3. 37℃のインキュベーター中で30分間、細胞をミトコンドリア生体染色色素の必要量を添加し、インキュベートします。
  4. 、ミトコンドリア色素溶液を外し予め温め4ミリリットル（37°C）αMEM/ FBS、1％で細胞を2回洗浄し、バック4ミリリットルαMEM/ 10％FBSを追加します。 37℃で細胞をインキュベートします。
  5. 2時間後、30分と、別の時間後に培地を変更します（10ミリリットルαMEM/ FBS 10％）。

1日目

神経膠芽腫幹細胞（GSC）の2ラベリング（オプション、ディスカッションセクションを参照してください）

細胞培養培地 組成
GSC基礎培地 DMEM / F-12を補充し
インスリンの20mg / mlの
N2サプリメント1倍
グルコース3グラム/ L
L-グルタミン2mMの
GSCの増殖培地基礎培地に入れます：
B27サプリメント、1×
EGFを10ng / mlの
bFGFを10ng / mLの
Fungine 10 mg / mlで
ファンギゾン0.25 mg / mlで
ヘパリンの2mg / mlの
シプロフロキサシンを2μg/ mlの
ゲンタマイシンを2μg/ mlの
MSCの増殖培地 ＆＃945; MEMはを補っ
L-グルタミン2mMの
10％FBS
bFGFを2 ngの/ mlの

表1：培養培地。

  1. ポリHEMAコーティングした細胞培養フラスコ上のニューロスフェアとして成長GSCs（GB4細胞株32（10×10 6細胞）（ステップ3.12から3.1を参照してください）解離します。
  2. 10 5細胞で48ウェルプレート中の種子GSCs /ウェルでGSCの増殖培地（500μl）を（ 表1参照します）。
  3. 20℃で5分間、270×gでプレートを遠心。
  4. 細胞生体染色色素の必要量を加え、37℃で30分間インキュベートします。
  5. 48ウェルプレートのウェル当たりGSC基礎培地（ 表1）の500μLを加えます。
  6. 5分間、20℃で270×gでプレートを遠心。上清を吸引除去します。
  7. 繰り返しは、2.6から2.5まで繰り返します。
  8. GSC基礎培地500μlを加え、37℃で30分間インキュベートします。
  9. 5分間、20℃で270×gでプレートを遠心。上清を吸引除去します。
  10. 48ウェルプレートのウェルあたりGSC増殖培地500μlを加え、37℃のインキュベーターでインキュベートします。
    注：GSCsの量を示した（10×10 6細胞）を、異なる用量応答実験とFACSの制御を行うことができます。実験条件をより正確に定義すると、この量を縮小することができます。

2日目

神経膠芽腫幹細胞の3播種

  1. 50mlのチューブ中20℃で、5分間、270×gで遠心分離することによってGSCのニューロスフェア（10×10 6細胞）を収集します。
  2. HBSS 5mlで細胞を洗浄し、20℃で5分間、270×gで遠心。
  3. 上清を吸引除去します。
  4. 静かに10×10あたり（100μlのトリプシン-EDTA（0.25％）でGSCペレットを再懸濁 6細胞）まで
  5. 3分間37℃でインキュベートします。
  6. 10μlののCaCl 2（20mMの）と2μlのDNアーゼI（10mg / ml）を追加します。
  7. 優しくP200ピペットでピペッティング（30-50x）によってニューロスフェアを解離。気泡を避けてください。すべてGSCsが解離して、顕微鏡下で確認してください。
  8. 10μlのトリプシン阻害剤（5％）、10mlのHBSSを追加します。
  9. 20℃で7分間、270×gで遠心分離GSCs。
  10. 上清を捨て、10ミリリットルGSC基礎培地（ 表1）を追加します。
  11. トーマ計数室でGSCsをカウントした後、20℃で7分間、270×gで細胞を遠心します。
  12. 10 6 GSCs / mlの細胞濃度に達するようにGSC増殖培地（ 表1）の適切な量を加えます。
  13. シード10、96ウェルプレートのウェルあたり5 GSCs（100μlの細胞懸濁液）。
  14. ボットでGSCsを取得するために20℃で7分間、270×gでプレートを遠心井戸のトム。
  15. 第5節まで37℃で96ウェルプレートをインキュベートします。

2日目

4. MSCミトコンドリアの単離

  1. 4℃にマイクロチューブの遠心分離温度を調整します。
  2. ミトコンドリア抽出（200μlの試薬Aと400μlの試薬C、EDTA不含プロテアーゼ阻害剤を含有するの両方）のための試薬を含む二1.5 mlチューブ「A」と「C」を調製します。 「MSC」と「水戸」と表示された2他のチューブを準備します。氷の上ですべてのチューブを保管してください。また、ミトコンドリアの段階希釈用チューブを準備します。
  3. 予め温めた10ミリリットル（37℃）PBSで洗浄するのMSC。
  4. 2ミリリットルのトリプシンを洗浄のMSC（EDTAなし）10秒間、1mlのトリプシン（EDTAなし）を追加します。 37℃で5〜10分間細胞をインキュベートします。
  5. 10ミリリットルαMEM/ FBS 10％、50mlのチューブへの転送を追加することにより、MSCを回復します。
  6. 20℃で5分間、270×gで遠心分離細胞。
  7. 上清を捨て、追加細胞ペレットを10ミリリットルαMEM/ FBS 10％。
  8. Malassez数える室とMSCをカウントします。
  9. 遠心分離機のMSC（4-5×10 5）20℃で5分間、270×gで。
  10. 上清を捨て、細胞ペレットに1メートルの氷冷αMEM/ FBSに10％を追加して（ステップ4.2で調製）「MSC」で標識したチューブに細胞を移します。チューブを氷上に保管してください。
  11. 遠心機で4℃で5分間、900×gでMSCを含有するチューブ。
  12. チューブから全ての残留培地を除去。
  13. ミトコンドリア単離試薬A（EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む）の200μlのを追加します。 5秒間中速でボルテックスし、正確に2分間氷上でチューブを残します。
  14. 10秒間最大速度でミトコンドリアの単離試薬B.渦の2.5μLを追加し、氷上でチューブを残します。 5分間、30秒ごとに繰り返します。
  15. （EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む）ミトコンドリア単離試薬Cの200μlのを追加します。チューブを傾けることによりミックス（ROughly 30回、ない渦を行います）。 4℃で10分間、700×gでチューブを遠心。
  16. （ステップ4.2で調製）「水戸」チューブに（MSCのミトコンドリアを含む）上清を移します。
  17. ミトコンドリアペレットを得るために3000×gで遠心分離し、4℃で15分、。上清を捨てます。ペレットは、単離されたミトコンドリアが含まれています。
  18. ミトコンドリアペレットを得るために、そして試薬Cの200μlを、12,000×gで遠心分離、4℃で5分間でミトコンドリアペレットを洗浄します。

GSCsに単離されたMSCミトコンドリアの5転送（MitoCeption）

  1. MSCは（4×10 5）から単離したミトコンドリアペレットに予備冷却（0℃）GSC増殖培地200μlを追加します。
  2. 一貫GSCsにミトコンドリア懸濁液の20μlのを追加する（GSC増殖培地中の）ミトコンドリアの準備を希釈します。
  3. 96ワットのウェルに単離ミトコンドリアのボリュームを追加します。エルプレートは、所望の濃度（0.1〜10μgの）で、（ステップ3.15から）GSCsを含みます。少なくとも一度表面全体を覆って、ウェルの底に近い、ゆっくりとミトコンドリアを追加します。
  4. MSCのミトコンドリアの重要な色素漏出を制御するために、GSCの増殖培地のみ（GSCs）を（生体染色色素漏れ検出のためのパート6.2を参照）を含む96ウェルプレートのウェルにミトコンドリアの準備（0.1から10μg）の同量を追加します。
  5. 遠心し、4℃で15分間1500×gでMSCのミトコンドリア（ステップ5.3）とミトコンドリアの受信者GSCsとコントロールプレート（ステップ5.4）を含む96ウェルプレート。
  6. すぐに遠心分離した後、37℃の細胞インキュベーターで培養プレートを置きます。
    注：ミトコンドリア転送プロトコルがSYSTに応じて調整することができる遠心分離の数と、十分な遠心力で培養した細胞のミトコンドリア懸濁液を遠心分離に依存していますミトコンドリアドナー/レシピエント細胞のEM。

3日目

FACSおよび共焦点イメージングによってミトコンドリア転送6.分析

  1. FACS分析のためGSCサンプルの調製
    注：MSCミトコンドリアを予め生体染色色素（セクション1）で標識した場合、効率は24時間ミトコンドリア転写後、FACSによってモニターすることができます。
    1. 遠心分離機20℃で5分間、270×gでMitoCepted GSCsで96ウェルプレート。
    2. 上清を捨てます。
    3. 各ウェルに100μlのトリプシン（EDTAなし）を追加します。 3分間37℃でインキュベートします。上下にピペットで24時間の期間内に形成されたニューロスフェアを解離します。
    4. GSC基礎培地100μlを加えます。
    5. 20℃で5分間、270×gでプレートを遠心し、上清を捨てます。
    6. FACSに300μlのGSC基礎培地と転送再懸濁GSCsは、チューブを適応しました。
    7. FACS ANを実行しますalysis。
  2. 単離ミトコンドリアからのミトコンドリアの重要な色素漏出のための制御（FACS）
    注：このステップの目的はむしろ、本物のMSCのミトコンドリアの転送を反映ではないでしょう背景FACS信号、MitoCeption（ステップ5.3）に使用される標識されたMSCのミトコンドリアからの生体染料の単なる漏れを決定することです。
    1. 3.15にステップ3.1で説明したようにGSC細胞をシード。
    2. 37℃で1時間細胞をインキュベートします。
    3. 遠心分離機20℃で5分間、1500×gで（ステップ5.4から5.6まで）のみミトコンドリアを含む96ウェルプレート。
    4. GSC 96ウェルプレート（ステップ6.2.2）から培地を吸引し、ミトコンドリアのみ（ステップ6.2.3からの上清）とインキュベートした媒体によってそれを置き換えます。
    5. 2時間37℃でGSCsを含む96ウェルプレートをインキュベート。
    6. 手順でFACS分析のために6.1.7に6.1.1のように進みます。
  3. GSC SAMPの調製共焦点イメージングのためのレ
    注：GSCsにMSCミトコンドリアの転送は蛍光イメージングにより分析される場合、MSCおよびGSCs両方ミトコンドリア（ステップ1）および細胞（ステップ2）バイタル染料でそれぞれ、予め標識される必要があります。
    1. ステップ6.1.5に6.1.1のようにGSCsを準備します。
    2. 35mm培養皿中で2％FBS及びシード（ガラスボトム）を含有する2ml中に再懸濁GSCs GSC増殖媒体。
    3. 24時間後に転送された蛍光MSCミトコンドリアとGSCsに共焦点イメージングを実行します。

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結果

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間葉系幹細胞（MSC）とMitoCeptionによって標的神経膠芽腫幹細胞（GSC）への転写からミトコンドリアの単離を概説する処理手順は、 図1に示されています。 GSCsは、それらの幹細胞の特性を保持するニューロスフェアとして増殖させたがん幹細胞です。プロトコルの場合、GSCsは時間のカップル（FACSデータ図3B参照）、より高いミトコンドリアの転送効率を可能にするために、ミトコンドリア（ステップ3）の転送の前に単一細胞として播種します。セクション5（3日目）に続いて、これらの細胞は、ニューロスフェア（図1）を形成するように再び観察されます。

GB4 GSCsのイメージングは、蛍光標識されたMSCのミトコンドリアとMitoCeption 72時間後には、共焦点画像から得られた直交ビューによって示されるように、MSC...

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ディスカッション

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研究の増加は、細胞がミトコンドリアを交換することができること、およびこれらのミトコンドリアは、標的細胞の代謝および機能に重大な影響を有することを示しています。したがって、定量的に、それらの生物学的効果の正確な研究を可能にするために、これらの標的細胞へのドナー細胞からのミトコンドリアを転送するためのツールを習得することが不可欠です。

ここで説明するプロトコルは、もともと付着癌細胞株MDA-MB-231 33にヒト間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを転送するために働きました。ここに示されるように、 インビトロでのニューロスフェアとして増殖、がん幹細胞に適合させることができます。ミトコンドリア転送MSCミトコンドリアは、GSCのニューロスフェアに添加されたときに発生したが、本プロトコールに記載のように、それは、単一細胞GSCsでより効率的であることが見出されました。このプロトコルも必要で、T細胞のような、他の非接着性細胞に推定することができMitoCeption工程のためのシードされた細胞濃度をDAPT。

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開示事項

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INSERM（研究所国立・デ・ラ・サンテらデラRECHERCHEMédicale）、これでCJとML.V.提携している、MitoCeption技術（EP14306154.7）に特許出願しました。

謝辞

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我々は提供するために、FACS分析のヘルプはモンペリエRIOイメージング施設（MRI）をアンドレア・パルメジャーニ（L2CとDIMNP、モンペリエ）、ブノワCharlotの（IES、モンペリエ）と同様に有用な議論のための研究室のメンバー、クリストフDuperrayに感謝しますFACSおよび共焦点顕微鏡のための適切な環境を提供します。 BNMはLabEx Numev（大会ANR-10-LABX-20）から大学院の交わりによってサポートされていました。 ABは、ワルシャワと欧州連合（EU）の大学（nはPOKL.04.01.02-00-221 / 12°）から学部交わりによってサポートされていました。 MLVは、科学研究のためのナショナルセンター（CNRS）からスタッフの科学者です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
組織用ミトコンドリア単離キット フィッシャーサイエンティフィック 
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific11520536
B-27 Supplement w/o VIT A (50x)Fisher Scientific 
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+> シグマH4385
ポリヘム シグマ P3932
aMEM グルタミンなしオザイムBE12-169F
DMEM/F-12 グルタミン無しフィッシャーサイエンティフィック 
L-グルタミン インビトロジェン 25030-024 
グルコース シグマ G7021
インスリン シグマ 私は1882年 
人間 bFGF R&Dシステムズ233-FB-025
ヒトEGF ペプロテック AF-100-15 
ヘパリンシグマH3149 
CaCl2MERCK2382
トリプシン阻害剤シグマ T9003
DNase ISIGMA 
トリプシン0.25%/ EDTA 1 mMInvitrogen 
トリプシンGibco 15090-046
プロテアーゼ阻害剤EDTAフリーシグマ4693159001
シプロフロキサシン シグマ17850-5G-F
ファンジン Invivogenant-fn-1
Fungizone サーモフィッシャー15290018
ゲンタマイシンユーロメデックスEU0410
MitoTracker グリーン FM分子プローブM7514
MitoTracker レッド CMXRos分子プローブ&nbsp;M7512
MitoTracker 深赤色FM分子プローブ M22426 
CellTracker Green CMFDAMolecular ProbesC7025
CellTracker Blue CMF2HCMolecular ProbesC12881
RIPASanta Cruzsc-24948
FluoroDish Sterile Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
HemacytometerFisher Scientific267110
FACSチューブベックマン・コールター2,523,749
FACS装置ガリオス  3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS ロシュ3515885001
1057966311500446115405661010415900125200056

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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