ここでは、プロトコル（MitoCeption）はGSCの代謝および機能に対するそれらの生物学的効果を研究する目的で、神経膠芽腫幹細胞（GSC）を、ヒト間葉系幹細胞（MSC）から単離されたミトコンドリアを転送するために提示されています。同様のプロトコルは、他の細胞型との間のミトコンドリアを転送するように適合させることができます。
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この記事について
サマリー
要約
ミトコンドリアは、細胞代謝、エネルギー産生およびアポトーシスの制御に中心的な役割を果たす。不十分なミトコンドリア機能は、神経病変から癌に至るまで、非常に多様な疾患の原因が分かっています。興味深いことに、ミトコンドリアは最近容量を表示することが示されており、さらに現在の関心を高め、ミトコンドリアのレシピエント細胞を代謝および機能的結果と、共培養条件下で癌細胞にヒト間葉系幹細胞（MSC）からのとりわけ、細胞タイプとの間で転送されますこれらの細胞小器官の生物学的特性のために。
標的細胞における転写MSCミトコンドリアの効果を評価することは、細胞 - 細胞相互作用の生物学的結果を理解するために最も重要です。ここで説明MitoCeptionプロトコルは、MSCのミトコンドリアを用いて、標的細胞へのドナー細胞から予め単離されたミトコンドリアの移動を可能にしますモデル系としておよび神経膠芽腫幹細胞（GSC）。このプロトコルは、以前にMDA-MB-231癌細胞を接着するために、MSCをから単離されたミトコンドリアを転送するために使用されてきました。このミトコンドリア転送プロトコルは、in vitroでのニューロスフェアとして成長の具体的な特殊性を提示GSCsのためにここに適合されています。単離ミトコンドリアの転写は、ミトコンドリア生体染色色素を用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）および共焦点イメージングによって追跡することができます。異なるハプロタイプ（のSNP）を有するミトコンドリアのドナーおよび標的細胞の使用は、標的細胞におけるそれらの円形のミトコンドリアDNA（ミトコンドリアDNA）の濃度に基づいて、転送ミトコンドリアの検出を可能にします。プロトコルは、これらの条件で検証された後、転送ミトコンドリアを有する細胞はさらに、細胞代謝、可塑性、増殖、および治療に対する応答としての生物学的特性に外因性のミトコンドリアの効果を決定するために分析することができます。
概要
ミトコンドリアは、彼らが栄養摂取ならびにエネルギーおよび代謝物の生産において中心的な役割を果たし、真核細胞に見られる細胞小器官です。これらの細胞小器官は、電子輸送鎖複合体、tRNA及びrRNAの1のタンパク質をコードして16.6キロバイトの長円形のミトコンドリアDNA（mtDNAのを）、含まれています。これらの細胞小器官の機能は、ミトコンドリア機能不全1、2、3で細胞ホメオスタシスおよびいくつかの病態のための重要な関連しているされています。ミトコンドリアの状態は、例えば、治療4、5、6、7への転移及び抵抗性の結果この後者の場合には、炎症、感染症および癌に関連しています。
ミトコンドリアはの驚くべき能力を表示します 「ドナー」と「ターゲット」セル間転勤。最近になって、15の異なる研究室
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プロトコル
1日目
間葉系幹細胞の1ラベリング（MSC）ミトコンドリア（オプション）
- 1日目に培養液中で4×10 5 MSCを有するように二日、ミトコンドリアの準備の前に、10ミリリットルαMEM/ FBS 10％で、100ミリメートル培養皿にヒトMSCをシード。
- PBS（4ml）でMSCをすすぎ、4ミリリットルαMEM/ FBS、1％を追加（37℃に予め温め）。
- 37℃のインキュベーター中で30分間、細胞をミトコンドリア生体染色色素の必要量を添加し、インキュベートします。
- 、ミトコンドリア色素溶液を外し予め温め4ミリリットル（37°C）αMEM/ FBS、1％で細胞を2回洗浄し、バック4ミリリットルαMEM/ 10％FBSを追加します。 37℃で細胞をインキュベートします。
- 2時間後、30分と、別の時間後に培地を変更します（10ミリリットルαMEM/ FBS 10％）。
1日目
神経膠芽腫幹細胞（GSC）の2ラベリング（オプション、ディスカッションセクションを参照してください）
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結果
間葉系幹細胞（MSC）とMitoCeptionによって標的神経膠芽腫幹細胞（GSC）への転写からミトコンドリアの単離を概説する処理手順は、 図1に示されています。 GSCsは、それらの幹細胞の特性を保持するニューロスフェアとして増殖させたがん幹細胞です。プロトコルの場合、GSCsは時間のカップル（FACSデータ図3B参照）、より高いミトコンドリアの転送効率を可能にするために、ミトコンドリア（ステップ3）の転送の前に単一細胞として播種します。セクション5（3日目）に続いて、これらの細胞は、ニューロスフェア（図1）を形成するように再び観察されます。
GB4 GSCsのイメージングは、蛍光標識されたMSCのミトコンドリアとMitoCeption 72時間後には、共焦点画像から得られた直交ビューによって示されるように、MSC.......
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ディスカッション
研究の増加は、細胞がミトコンドリアを交換することができること、およびこれらのミトコンドリアは、標的細胞の代謝および機能に重大な影響を有することを示しています。したがって、定量的に、それらの生物学的効果の正確な研究を可能にするために、これらの標的細胞へのドナー細胞からのミトコンドリアを転送するためのツールを習得することが不可欠です。
ここで説明するプロトコルは、もともと付着癌細胞株MDA-MB-231 33にヒト間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを転送するために働きました。ここに示されるように、 インビトロでのニューロスフェアとして増殖、がん幹細胞に適合させることができます。ミトコンドリア転送MSCミトコンドリアは、GSCのニューロスフェアに添加されたときに発生したが、本プロトコールに記載のように、それは、単一細胞GSCsでより効率的であることが見出されました。このプロトコルも必要で、T細胞のような、他の非接着性細胞に推定することができMitoCeption工程のためのシードされた細胞濃度をDAPT。
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開示事項
INSERM（研究所国立・デ・ラ・サンテらデラRECHERCHEMédicale）、これでCJとML.V.提携している、MitoCeption技術（EP14306154.7）に特許出願しました。
謝辞
我々は提供するために、FACS分析のヘルプはモンペリエRIOイメージング施設（MRI）をアンドレア・パルメジャーニ（L2CとDIMNP、モンペリエ）、ブノワCharlotの（IES、モンペリエ）と同様に有用な議論のための研究室のメンバー、クリストフDuperrayに感謝しますFACSおよび共焦点顕微鏡のための適切な環境を提供します。 BNMはLabEx Numev（大会ANR-10-LABX-20）から大学院の交わりによってサポートされていました。 ABは、ワルシャワと欧州連合（EU）の大学（nはPOKL.04.01.02-00-221 / 12°）から学部交わりによってサポートされていました。 MLVは、科学研究のためのナショナルセンター（CNRS）からスタッフの科学者です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 組織用ミトコンドリア単離キット | フィッシャーサイエンティフィック | ||
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement w/o VIT A (50x) | Fisher Scientific | ||
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | > シグマ | H4385 | |
| ポリヘム | シグマ | P3932 | |
| aMEM グルタミンなし | オザイム | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 グルタミン無し | フィッシャーサイエンティフィック | ||
| L-グルタミン | インビトロジェン | 25030-024 | |
| グルコース | シグマ | G7021 | |
| インスリン | シグマ | 私は1882年 | |
| 人間 bFGF | R&Dシステム | ズ233-FB-025 | |
| ヒトEGF | ペプロテック | AF-100-15 | |
| ヘパリン | シグマ | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| トリプシン阻害剤 | シグマ | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | ||
| トリプシン0.25%/ EDTA 1 mM | Invitrogen | ||
| トリプシン | Gibco | 15090-046 | |
| プロテアーゼ阻害剤EDTAフリー | シグマ | 4693159001 | |
| シプロフロキサシン | シグマ | 17850-5G-F | |
| ファンジン | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | サーモフィッシャー | 15290018 | |
| ゲンタマイシン | ユーロメデックス | EU0410 | |
| MitoTracker グリーン FM | 分子プローブ | M7514 | |
| MitoTracker レッド CMXRos | 分子プローブ& | nbsp;M7512 | |
| MitoTracker 深赤色FM | 分子プローブ | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACSチューブ | ベックマン・コールター | 2,523,749 | |
| FACS装置 | ガリオス | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | ロシュ | 3515885001 |
参考文献
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S.
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