MALDIイメージングマススペクトロメトリーのためのラット脳組織におけるガングリオシドの検出と可視化のためのDANマトリックスの昇華

サマリー

MALDIイメージング質量分析を使用してガングリオシドを検出するためのラット脳組織へのDANマトリックスの昇華のためのプロトコルが提示されます。

要約

試料調製は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）イメージング質量分析（IMS）の実験で最適な検出および分析物の可視化のための鍵です。各ステップは、目的の分析物の固有の特性に適合するように最適化されなければならないように、サンプル調製プロセスの全体にわたって追従するように適切なプロトコルを決定することは困難であり得ます。このプロセスは、効率的に目的の分子を脱着およびイオン化することができる互換性のマトリックスを求めるだけでなく、適切なマトリックス沈着技術を選択するだけでなく、を含みます。乾燥マトリックス沈着技術は、脂質のイオン化のために特に有効である一方で、例えば、溶媒中でマトリックスを溶解伴う湿式マトリックス沈着技術は、ほとんどのタンパク質およびペプチドの脱離のために優れています。昇華が原因homogeneiにMALDI IMSによる組織における脂質の検出のための乾燥マトリックス沈着の非常に効率的な方法として報告されています多くの湿式堆積方法^1,2と比較して、マトリックス結晶沈着および最小の検体非局在化のTY。広義には、それは冷たい表面に押し付けサンプルと真空封止チャンバ内の試料と粉末マトリックスを配置することを含みます。装置を冷却し、組織試料表面上に粉末マトリックスの昇華の結果、加熱された浴（砂または油）に低下します。ここでは、MALDI IMSを使用して、ラット脳におけるガングリオシドの検出と可視化のための1,5-ジアミノナフタレン（DAN）行列を用いて昇華プロトコルを記述します。

概要

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）イメージングマススペクトロメトリー（IMS）は、高度にそのまま試料表面全体の脂質の空間分布の可視化のための技術、ペプチドおよびタンパク質引っ張りだこになってきています。 MALDI IMSは、予め予備精製分析物のための分析技術として知られていたが、近年では、理由なしに、高解像度の視覚的/解剖学的基準点と質量分析の精度を結合する能力の他の多くの分野で注目されています任意の外部標識のために必要。この技術を利用する研究の科学的プールが成長し続けるにつれて、IMS実験の開発および最適化を支援するための標準化され、簡単に従うプロトコルの増加が必要です。ガングリオシド、中枢神経系に非常に豊富な膜脂質の群、膜内に埋め込まれたそれらの場所、としてMALDI IMS実験のための理想的であるが、特定の具体を作ります従来の免疫標識を用いて検出することは不可能エス。さらに、我々は、細胞シグナル伝達の調節因子として機能するこれらの脂質は、とりわけ、脳損傷^3、4、5後に変更された健康な齧歯類脳における固有の解剖学的分布パターンを有することを、MALDI IMSを使用して、示されています。ガングリオシドは、ほとんどの脂質種と比較してより高い質量範囲にあり、したがって、MALDIイメージングプラットフォームに最適されています。

図1：MALDI IMS実験のワークフロー。昇華を使用して、MALDI IMS実験の一般的なワークフローの図。 -80℃で凍結した組織は、クライオスタットに区分され、10μmの切片は、解凍は、導電性のITOスライド上にマウントされています。次いで、スライドを昇華するまでデシケーター中に置かれています。 SLIDESは、昇華装置内に挿入され、マトリックスの均一な層は、組織試料の表面に塗布されます。次いで、試料を10分間デシケーター中に入れ、-20℃の冷凍庫で一晩凍結されています。基準が適用された後、サンプルは、レーザーをイオン化するためにマトリックスに脱離した分子を引き起こす組織を横切って向けられているMALDI機器に挿入されます。イオンは、フライトチューブを下に移動し、彼らは検出器に到達するまで、その質量（飛行時間型/ TOF）に基づいて分離します。所定の質量対電荷（m / z）範囲内の検体のイオン豊富な情報を、分子画像とマススペクトルの両方として表示されます。このデータは、撮像された組織内の関心のある検体のイオン存在量を視覚化し、定量化の両方に使用することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

試料調製プロセスの各ステップは、目的の分析物に合わせてカスタマイズされなければならないようMALDI IMSのための非常に可変です。 MALDIベースの実験の決定的な特徴は、分析前に試料表面上に堆積マトリックスコーティングを使用することです。アブレーションプロセスの間にレーザからの放射エネルギーを吸収し、転写の役割に加えて、マトリックスは、それによって関心^6,7の化合物の分析を容易にする、試料からの種々の分析物を分離するのに役立ちます。試料表面にマトリックスの均質な適用は、サンプル調製プロセスにおける最も重要な工程です。不適切なマトリックス沈着は、大規模な異種のマトリックス結晶形成や工芸品の開発、低イオン信号、および再現性が悪い⁷につながることができます。

原因特定の検体を分離するために、特定の行列の親和性に、マトリックスの種類は、実験のために選択することができます大幅に結果を変えます。タンパク質およびペプチドの画像化に使用されるマトリックスは、多くの場合、画像化脂質のために使用されるものとは異なる処理が正常組織からの信号を検出するために、そのような洗浄及び再水和の工程などの追加の手順を必要とすることにより、さらに複雑です。洗浄工程は、脂質シグナル⁸の増強のために存在するが、それらはほとんどの脂質種の検出のための前提条件ではありません。脂質イメージング実験のためのマトリックスを選択するとき、適切な基質の範囲が狭くなります。このような目的の脂質の極性を考慮することが重要です。例えば、ガングリオシドは、それらを全体的に負極性を与えるシアル酸残基が含まれています。効果的に脱着および組織からのガングリオシドをイオン化することができます行列の数があります。しかし、このような真空下での行列のスペクトルと安定性のマトリックス由来のピークのような要因が考慮の下で撮影する必要があります。 1,5- diaminonapthalene（DAN）マトリックスは、画像処理アプリケーションの大部分のための機器真空条件下で十分に安定であり、脂質の脱離のための高感度を示した正および負のイオンモード²の両方における脂質の分析のために使用することができます。このようなジヒドロキシ安息香酸（DHB）、9-アミノアクリジン（9-AA）、及び5-クロロ-2-メルカプトベンゾチアゾール（CMBT）のような他の負の脂質親和性マトリックスと比較した場合、DANマトリックスは、最も効率的にラット脳のガングリオシドを脱着することができました負イオンモード（原稿準備中）で組織。

マトリックス沈着の適切な方法を選択すると、マトリックス自体を選択することに等しく重要です。液体は、追加を可能にするために、試料を透過などの固体マトリックスは、有機溶媒に溶解し、空気圧によって堆積またはスプレーまたはスポッターを自動化された湿ったマトリックス沈着法は、タンパク質およびペプチドの脱離のために特に有効ですマトリックスを有する化合物と共結晶化のction。これらの技術は、脂質アプリケーション、検体の非局在化と不均一なマトリックス結晶形成のためにも使用することができるが、特に組織^2,9において、溶媒中の脂質の高い存在量及び溶解度に起因する一般的な出来事です。脂質は容易に組織からイオン化されているため、例えば、昇華などの乾燥マトリックス堆積技術は、単純に提供これらの技法の欠点の多くを回避しながら、噴霧器への効果的な代替手段を要します。 MALDI IMS実験における昇華の成功は、このようなマトリックス-検体結合増加マトリックス純度、湿式マトリクス技術^1、10と比較して増加した再現性をもたらす均一なマトリックス沈着のための表面積を増大させる微結晶マトリックスの形態などの機能に起因します。

昇華invo直ちに組織試料表面上に堆積する粉末マトリックスの気相転移を固体で得冷却試料表面下の真空下で粉末化マトリックスを加熱LVES。昇華中、マトリックス沈着は、時間、温度、および再現性の高い結果を提供するための圧力として変化要因によって制御することができます。単一昇華実験を廃棄する前に数回再使用することができる選択されたマトリックスのタイプに応じて5〜20分にかかります。この装置は、自動化された噴霧器の価格のほんの一部で商業的に購入することができ、容易にクリーニングやメンテナンスのために解体されます。低コストで、この行列の堆積技術の相対的なシンプルさが始まるまたはMALDI IMSにおける脂質イメージング用途に拡張する研究者に最適です。 IMSのための組織の昇華のためのプロトコルの詳細情報^11が報告されているが、いくつかの標準化されたプロトコルは、Wが存在しますHICH、それが困難な大規模な試行錯誤することなく、技術を確立すること、負イオンモードで高質量の脂質を撮像するための昇華実験を行うことに伴う基本的なワークフローに焦点を当てます。以下は、ガングリオシドの高分解能イメージングおよび検出のために、ラットの脳切片上にDAN行列の昇華のためにそのギャップを埋めることを目指した実験のプロトコルです。

図2：昇華装置。写真（A）及び昇華装置の概略図（B）。真空ポンプは、エタノール300mlを充填した冷却トラップにゴム管により接続されています。コールドトラップは、その後、昇華装置にゴム管により接続されています。装置は、金属Uジョイントと共に密封されているガラス製品の二つの別個の片から構成されています。昇華の上半分氷のスラッシュが充填されているコンデンサーが含まれています。サンプルプレートは、密閉ガラス装置内のコンデンサーの底部上にテープ止めされています。昇華装置の下半分は、均等にサンプルプレートに面して広がる、DAN行列が含まれています。昇華中、ガラス装置は、直接下にホットプレートにより140℃に加熱した砂浴上に配置されます。温度プローブは、実験用の設定温度に比べて砂浴温度のフィードバックを通じて昇華実験を通して安定した温度を維持するのに役立ちます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プロトコル

以下で説明する全ての動物の取り扱い手順は、ウェスタンオンタリオの動物管理委員会の大学（2016から014）に準拠しています。

1.組織調製およびセクショニング

1. 「新鮮凍結抽出」（FFE）と呼ばれるプロセスを介してラットから脳組織を抽出します。
   1. ペントバルビタールナトリウムの過剰投与によりラットを安楽死させると手足の反射を監視します。すべての反射が停止したら、ギロチンを用いたラットの頭部を切断。
   2. 慎重には、メスを用いて頭蓋骨から筋肉や他の組織を分離します。前方部分に頭蓋骨（大後頭孔）のベースから出発し、脳を露出するように頭蓋骨を破るために骨切り鉗子を使用してください。
   3. 脳が露出されると、慎重に手術用へらでそれをかき出すと、すぐに瞬間冷凍のために砕いたドライアイス上に置きます。
      注：脳は非常に可鍛性になります。上の脳を配置するときしたがって、細心の注意を取りますドライアイス。脳を粉砕または表面に押圧されている場合は、その形状を変化させ、その位置で凍結します。
2. ドライアイス上で80°Cの冷凍庫と場所 - から（ホルムアルデヒドで灌流または10月に埋め込まれていない）新鮮凍結組織を削除します。
3. ドライアイスやクライオスタットフリーズバーのいずれかにクライオスタットホルダーと場所に水を数滴を置きます。押し組織は軽くクライオスタットホルダーの上には、組織のベースの周りの水が凍結するまで凍結して保持し始めると、所定の位置にそれを固定します。必要に応じてさらにホルダーに組織を固定するために追加の水を追加します。
   注：水は、所望の信号の検出に影響を与えることができる化合物を用いて組織の汚染を回避するために、組織を取り付けるための代わりのOCT媒体に使用されます。
4. クライオスタット内の位置組織。目的の解剖学的位置までの区間組織。 12ミクロン - 切断厚さが8の間であることを確認してください。
   注：共同クライオスタットの組織を切片デバイスは、ブレード、ブラシ、アンチロールバー、ホルダーなどの個別の材料が化合物を埋め込むことによる汚染を回避するために使用されることが必須です。クライオスタットの内部には、使用前にエタノールで十分に洗浄する必要があります。
5. クライオスタットアンチロールバーを使用して、ゆっくり部は、組織切片を平坦化。ロールバーの配置が間違っているか、ブレードが鈍いである場合、組織上の穴やマーキングが発生する可能性があります。きれいなペイントブラシを使用してプラットフォームをスライスの中心に組織を移動します。
6. 取り付け
   1. スライスながらクライオスタットにそれらを配置することにより、導電性スライドまたは金属プレートを凍結。スライドが完全に凍結されている場合には、慎重にきれいなペイントブラシを使用してスライドの導電性表面上に切片組織を動かします。すべての組織切片がスライド上に正しく配置されたらセクションでは、解凍するまで、スライドの下に指を置く組織反対し、を押します。
      注：セクションは、ときに、解凍処理中に折ったりカールすることができますこの実装方法を使用して。これは、組織を解凍時クライオスタットでスライドを保持することによって低減することができます。これらの問題は、代替問題となる場合は、温かみのマウント方法を以下に記載されています。
   2. また、室温酸化インジウムスズ（ITO）スライド（または金属板）を取ると軽くダウン、スライスプラットフォーム表面上の凍結組織切片上に導電性の側を下に押します。これは、組織のほとんどカールや折りたたみとスライドの表面上に均一に解凍した組織切片につながります。
      注：特定のタンパク質と脂質の損失につながる可能性があり、このメソッドを使用して実装する際に結露がセクションの下に表示されることがあります。
7. 10分 - 5のためにデシケーター中で組織を含むスライドを置きます。

2.昇華装置セットアップ

注：ドラフト内でこれらの手順を実行します。

1. 金属シザーリフト上のホットプレートで、ホットプレート上にアルミニウム容器内の砂浴を配置（ホットプレートよりもすなわち大きい）適切な表面積の。ホットプレートの電源をオンにし、温度を140℃に設定してください。
   注： - 〜190℃DAN行列のための融点は187との間にあります。ホットプレート上で、この温度を超えないようにしてください。
   1. ホットプレートは、温度フィードバックプローブが装備されている場合、実験を通して砂の温度を監視し、温度の一貫性を保証するためにそれを使用します。この機能は、さまざまな昇華実験全体の実験の再現性を支援することができます。
      注：砂浴は高温で破損することがあり、ガラス容器などのアルミニウム容器内に含まれるべきです。
2. 昇華装置の底面にDAN行列の300ミリグラムを置きます。装置の中心に行列を配置し、昇華されているスライドのおおよその幅と長さであっても層に広がります。
   注意：DAN行列は有毒です。したがって、重要な摩耗手袋、マスク、安全です粉末状のマトリックスを扱うすべての回でゴーグル。それは光に敏感であるようDANは、暗所で保存する必要があります。
3. プレートは昇華中、スライドの表面全体にわたって冷却温度の均一な分布を確保するために、凝縮器の底部に直接接触することで、装置の内面に金属板をテープ。代替的に、砂凝縮器の底部は、平坦な表面を確保します。
   1. プレートの外縁に沿ってテープを配置し、内側のガラス製品の側面に付着します。テープがプレートの下に置かれ、内側のガラス表面の底に付着した場合、温度分布がさえないかもしれないとスライドの表面にわたって不均一なマトリックス分布につながる可能性があります。
   2. テープのブランク（テスト）が再びスライドの外縁上に配置されたテープで金属板の表面を横切って斜めにスライドさせます。
4. wは、装置の上部と底部を接続します完全なシールを確実にするために途中でゴム製のOリングi番目。
5. 装置の中央付近に金属U-関節を置き、装置の上部と下部の半分はしっかりと一緒にシールされるまで、悪徳を締めます。砂浴上に金属Oリングに配置します。
6. 砕いた氷の一握りを取り、凝縮器に入れてください。氷のスラッシュを作成するために、冷水で完全な1/2に¼コンデンサーを記入してください。アイススラッシュは、それに付着した機器の内部、その後スライド上に金属板を冷却します。定常状態に到達するために温度のために、少なくとも5分待ってください。
7. コールドトラップ容器内にエタノール300mlを注ぎ、容器にガラス製品を配置します。コールドトラップ容器の底にエタノールにドライアイスの3小片 - 2をドロップします。出力がないながらコールドトラップ入力は、シリンダの底部に実行されているガラス管を有しています。
8. ゴム管を使用したコールドトラップ出力に真空ポンプを接続します。ゴムの別の部分を使用します昇華装置にコールドトラップ入力を接続するチューブ。利用可能な場合、チューブがしっかりと金属クランプを使用して保護されていることを確認してください。
9. 50ミリテスラ - 30の真空を提供するために、真空ポンプを使用してください。ポンプは、圧力平衡化のために少なくとも5分間実行を許可します。昇華装置のU-リング上の悪徳は、真空ポンプが原因で装置内の圧力の低下によりオン動作すると、再び締めなければならないことがあります。
   注：非常真空計が実験中に真空の圧力を監視し、実験間で可能な限り最高の再現性を実現するために、圧力の漏れをテストするためにポンプに接続されていることが推奨されます。しかし、ほとんどのポンプは、従ってゲージは経験豊富なユーザのために必須ではないが、一定の圧力を維持するように設計されています。さらに、真空シールグリースは、真空圧を維持するために使用することができます。

3.昇華

1. 砂浴の温度はSTABILを持っていることを確認してください140℃及び装置が接続されたすべてのチューブと砂浴上メタルOリングで固定され、真空がオンになっていること化されました。
2. 7分間のタイマーを設定しますが、タイマーを起動しないでください。昇華のU-関節がよく金属Oリングを超えるまでゆっくりと昇華装置にシザーリフトや砂浴を上に上げます。この余分なスペースは、砂の上に装置の調整を可能にします。
   1. 素早く装置は、砂の上に均等に座っていることを確認するために、砂の表面を軽く昇華を押して、すぐにタイマーを起動します。
3. タイマーが鳴ったら、真空ポンプをオフにして、慎重に昇華はもはや砂浴に接触している金属Oリングにしっかりと座っているまで、シザーリフトを下げます。
   1. ゆっくり装置内の圧力を解放するために、マイクロベントバルブを緩めます。昇華装置のゴム管の周りに金属クランプを緩め、ゆっくりチューブを緩め始めます。 ruの一回BBERチューブは残留圧力を逃がすために、1つの側にチューブを曲げ、少し緩めてきました。
   2. 周囲圧力が戻るには、慎重に昇華装置からゴム管を削除します。
4. 装置のUジョイントの悪徳を緩めて取り外します。慎重に昇華装置の2つの半分を分離し、内側のガラス製品の上からスライドをやってのけます。でも、行列の分布を確認するために、スライドを調べます。
   注意：マトリックスが不均一である場合には、昇華の底に粉末化マトリックスを再配置することができ、または昇華装置は、次のスライドのための砂の中に再配置することができます。昇華プロセスは、しかし、マトリックスは、最終的に繰り返される熱暴露粉末の量より暗くなり、同じ行列を用いて数回繰り返すことができる昇華時間を補償するためにわずかに調整されなければならないように減少します。このため、マトリックスBEIの量を監視することが重要ですngがスライド間マトリックス沈着の一貫性を確保するために、各実験の後に昇華しました
5. 昇華行列の分布と量が十分である場合、昇華を繰り返し第3節の内側に組織に新しいスライドをテープで固定します。
   注：品質管理（QC）の目的のために、昇華マトリックスの量は、前に昇華した後、スライドを秤量し、スライド²の表面積を有する昇華マトリックスの重量を割ることによって、各実験後に測定することができ、それことに留意すべきですQCの完全定量化可能な手段とは対照的に、高精度のバランスが使用されていない限りによる4進ポイントを超えて最もスケールの精度の欠如とスケール間の変動に、これらの測定値は、最適なマトリックス沈着のためのガイドを使用するする必要があります（ 図を参照してください3）。

4.組織保存/再水和

1. 昇華した後、店は密封容器や小さなCASSにスライド密封されたビニール袋でETTE。
2. 2時間または一晩-20℃の冷凍庫内のスライドをインキュベートします。
   注：凍結工程の目的は、マトリックスに組織物質の脱離のための再水和工程として作用することです。凍結プロセスは、C ¹² -80℃で保存した場合、最大1週間脂質信号の劣化を防止することが示されています。この理由のために、試料を冷凍庫に保存されている時間の量を有意に（我々の研究室で観察されるように）信号検出を変更することなく、実験者のニーズに合わせてある程度変化させることができます。サンプルは-20℃でより長い24時間のために凍結されている場合しかし、我々は、マトリックスの一部変色に気づきました。したがって、我々はその時間の前に昇華した組織を画像化する、またはより長いインキュベーション期間のため-80℃で組織を保存することをお勧めします。
3. 冷凍庫（容器）からスライドを外し、5デシケーターに置く - 10分。

5.イメージングおよびAnalysis

1. デシケーターからスライドを削除し、撮像中MALDI機器の質量精度を確保するための機器の基準を適用します。標準のタイプは、計測に依存して変化します。規格は、一般的に（ 図3D）画像化されるべき組織を取り囲む、スライド全体に均等に適用されます。
2. MALDI機器にスライドを挿入し、（計器法が1000のために最適化されるべきである - 2000質量範囲）イメージング実験のための製造元の指示に従ってください。代表的結果（ 図4）は、70ミクロンのラスターと20ショット/スペクトル（取得時間〜2時間）でリフレクトネガティブモードで取得しました。

結果

昇華実験の完了時に、ガラス装置の2つの半分は、凝縮器にテープ、ドラフト及びスライドに分離された（ 図3A）を除去することができます。この時点で、スライドは、温度、不均一なマトリックス分布と時間について試験されるべき、または砂浴内装置の配置は、次のスライドのために調整されなければなりません。成功したDANの昇華実験は、組織の解剖学的特徴を明確に可視化することができ、スライドガラス上にマトリックスの量は、組織上の量に類似しているスライドの表面に沿ってグレー/ブラウンマトリックスの均一なコーティングをもたらすであろう（ 図3B）。あまりにも多くのマトリックスが組織に昇華されている場合たとえば、マトリックスの厚さは、組織の機能をカバーするだけの一般的な形状が識別可能になります。少なすぎるマトリックスが昇華する場合は、組織は、HA意志スライド（ 図3C）の残りの部分よりも暗い外観VEの。どちらも多すぎると少なすぎるマトリックスは、MALDI楽器で劣悪な信号になります。品質管理の目的...

ディスカッション

この作品は、MALDI IMS実験におけるガングリオシド、のような負に荷電した脂質の検出のための組織上にマトリクス昇華の標準化されたプロトコルを詳述します。 MALDI IMSのためのサンプル調製は非常に可変であり、目的の分析物のユニークな特性に合わせてカスタマイズする必要があります。組織サンプル表面上へのマトリックスの適用は、IMSにおける結果の品質に関して、サンプル調製プロセスの重要な側面です。行列は、対象の分析物と互換性があり、スペクトルにおけるマトリックス由来の成果物がないことを保証し、行列を選択する際に特に注意を払うべきです。昇華は、組織上の脂質のほとんど非局在化とマトリックス結晶均質性の高い学位を提供乾燥マトリックス堆積技術です。特にDANマトリックスは、ラット脳に示されているように、負に帯電した膜脂質の群の脱着のための感度の高い程度は、ガングリオシドと呼ばれる示しますセクション、およびイメージングアプリケーションの大部分との互換性を考慮して、長期間にわたって真空下で安定しています。 DANマトリックスはまた、正に荷電した脂質種に対して高い親和性を有し、従って、MALDI IMSアプリケーション

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
昇華剤	Chemglass Life Sciences	CG3038-01
1,5-ジアミノナプタレン(DAN)マトリックス	Sigma-Aldrich	D21200	100グラム
クライオスタット	サーモフィッシャーサイエンティフィック		クライオスターNX50
温度フィードバック付きホットプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	HP88857290	Isotemp ADVD 7x7 HP 100-120 V
ステンレス製ジャック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	2216479	10x10
コールドトラップ			カスタムメイド オンサイト
真空ポンプ	フランクリンエレクトリック	1102180403	Savant VP100 2段
式酸化インジウムスズ(ITO)スライド	ハドソン表面技術	PSI 1111000	タイプII、各1.1 mm/25
MALDI TOF/TOF 5800 Instrument	AB Sciex
デシケーター	Sigma-Aldrich	D2797	卓上デシケーター