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方法論記事

ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

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DOI:

10.3791/55260

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2017年2月18日

 , 
1Department of Neurology, The University of Arizona

この記事について

サマリー

人工多能性幹細胞（iPS細胞）の定期的な特性評価は、それらの多能性状態の維持を確認するために、これらの細胞が他のアプリケーションに使用される前の重要なステップです。ここでは、免疫細胞化学によるヒトiPS細胞の簡便かつルーチンな特性評価を可能にするために特別に設計された、ヒトiPS細胞の小規模増殖法について説明します。

要約

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を疾患のモデリングや細胞治療に利用することに大きな関心が寄せられています。その特徴と特徴的な幹細胞性からさかのぼります。しかし、iPS細胞の機能に必須の多能性を確認しないと、これらの細胞をこのようなアプリケーションで使用することはできません。iPS細胞の多能性を確立するためには、さまざまな細胞アッセイや機能アッセイを通じてiPS細胞の厳密な特性評価が必要ですが、免疫細胞化学的手法により、多能性維持の日常的な評価をより簡単かつ効果的に行うことができます。ここでは、免疫細胞化学を用いたヒトiPS細胞の多能性状態の検証を特に容易にするために、ヒトiPS細胞をスケールダウンして培養するための体系的なプロトコールを紹介します。具体的には、この方法論には、無血清条件でiPS細胞を増殖させ、免疫細胞化学に最適な小さなチャンバースライドまたはガラスカバースリップに播種する効率的で費用対効果の高い方法が含まれます。

概要

人工多能性幹細胞（iPS細胞）に、ヒト成人の体細胞を再プログラミングする疾患1,2を研究するための患者特異的細胞の潜在的に無制限の供給を得るための方法を提供します。 in vitroでの疾患表現型を反復することは、それがもっともらしい疾患に関連する細胞および分子メカニズムを調べるために行い、創薬やオーダーメイド医療3を高めるであろう。加えて、ヒトiPS細胞（hiPSCs）が死亡または機能不全の細胞を交換し、いくつかの障害4、5との関連で機能を回復するための固有の資源として使用することができる特定の細胞型を誘導する可能性を提供します。

上記のアプリケーションでiPS細胞を使用することに重要な前提条件は、その多能性未分化状態は、培養中の拡張中に維持されることを保証することです。一般的に、techniq細胞および特殊な装置を大量に必要とするようなフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応および機能アッセイのようなUEは、IPSCの多能性6、7、8、9、10の詳細な分析のために使用されます。しかし、性IPSC「未分化状態のルーチン評価は、効果的にこのように減少し、時間とリソースを含む、特に免疫細胞化学（ICC）のために、これらの細胞の限られた増殖によって達成されることがあります。

最近の進歩は、マウス線維芽細胞フィーダー層および血清含有培地を必要とする従来の培養系よりも大幅に改善されて定義された無血清条件でのiPS細胞の成長、を可能にします。しかし、現在の文献は、フィーダーからiPS細胞を移行する方法について説明し明確な段階的なプロトコルが含まれていません。フィーダーフリーシステムへの層。

この文脈では、本プロトコルは、系統的に照射マウス胚性線維芽細胞（iMEF）フィーダー層上で増殖させhiPSCsは、特に堅牢をサポートするために、小規模の（1）無血清培地中で伝播するように適合され、及び（2）で培養することができる方法の詳細免疫細胞化学的解析。全体として、この方法は、免疫細胞化学を用いて、定期的にそれらの多能性を確認するために、無血清条件下でのヒトiPS細胞を増殖させるためのタイムリーかつ費用効果的な手順を表します。

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プロトコル

hiPSCsは4ミリメートルの皮膚パンチ生検から単離されたヒト皮膚線維芽細胞に由来し、センダイウイルス媒介リプログラミング11を 介して家の中に再プログラムされました。アリゾナ大学の治験審査委員会は、被験者の募集と生検コレクションのすべての手順を承認しました。

IPSC文化のための細胞外マトリックスコーティングされた表面の調製

  1. 前日iMEFsに成長しているhiPSC文化の合流点に、細胞外マトリックス（マトリゲル）でコーティングされたプレートを準備します。
  2. 緩慢解凍は、細胞外マトリックスのアリコート2時間4℃で氷の上で（依存多くは、仕様書の指示に従ってください）。
  3. バイオセーフティフードでは、（-20℃で保存）冷たいピペットチップを使用して、多くの特定の希釈率に係る冷ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12（DMEM / F12 / HEPES）に、細胞外マトリックスの1アリコートを追加。
  4. ディスペンス〜60081;それぞれの新しい細胞培養ウェル当たり細胞外マトリックスのLは、必要に応じて12ウェルプレートを処理しました。
  5. 室温で数時間プレートをインキュベートします。ここでは、3時間のインキュベーション時間を使用します。
    注意：プレートを直ちに使用するか、または2週間まで4℃で保存することができます。

伝播の細胞外マトリックス上にiMEFフィーダー細胞上に成長させたhiPSCsの2.転送

  1. 継代の日に、4°Cからマトリックスコートしたプレートを取り外し、プレートを組織培養フード中で1時間室温に順応することを可能にします。
  2. 吸引しiMEFsに成長しているhiPSC文化の6ウェルプレートの1ウェルから培地および500μLのコラゲナーゼ解離試薬（基礎的培養液中1mg / mL）で交換してください。
  3. IPSCコロニーの縁が少し持ち上げるように表示されるまで30分 - 〜10 37℃でインキュベートします。
    注：インキュベーション時間がラインに依存し、変化します。顕微鏡下で解離を監視します。
  4. 車efully解離試薬を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で穏やかに2回洗浄します。
  5. ウェルに10ng / mLのRho関連タンパク質キナーゼ阻害剤（Y-27632のROCK阻害剤）を用いて室温mTeSR1完全培地の1 mLを加え。
    注：この最初の通過中にiMEF馴化培地とmTeSR1の50:50混合物を使用することは示唆されており、このメディア移行中hiPSCsの生存のために有益であり得ます。
  6. 手動スコアと1ピック、フードの内側に部分的に配置された小さな位相差顕微鏡を使用して - 2 hiPSCコロニーを（〜700 - 直径が1000μm）注射器と針（25 G、1.5で）を使用。 P200のピペットチップを用いて培地にコロニーの得点の作品をオフにプッシュします。
  7. コーティングを乱さないように注意しながら、新しいプレートからマトリックスで吸引し、廃棄してください。
  8. 転送ウェルコーティングされた新しい行列に決めたiPS細胞を含む古いから細胞懸濁液の1ミリリットル。
  9. プラ37℃、5％CO 2のインキュベーター中のCeプレート。細胞を均一に広げるために、いくつかのクイック、前後、および横方向の動きにプレートを揺らし。 24時間プレートを邪魔しないでください。
  10. mTeSR1完全培地（Y-27632 ROCK阻害剤を添加するステップ2.5での最初のプレーティング後に必要とされていない）との毎日の完全メディアの変更を行います。

マトリックスでコーティングされたプレート上のhiPSCsの3小規模継代

注：一般的に、コーティングされたプレートをマトリックスにhiPSCsの初期転送した後、細胞はすべてiMEFsが排除されており、細胞が無フィーダー条件に適合していることを確認するために、同様の方法でもう一度継代する必要があります。

  1. セクション1で説明したように前IPSCの密集度に一日を新たにコーティングされたマトリックスプレートを準備します。
  2. 通路の日に、4℃のインキュベーションからマトリックスコーティングされたプレートを取り外し、プレートを組織CULで1時間室温に順応することを可能にしますトゥーレフード。
  3. （当初は行列にフィーダーから移行）hiPSCsの6ウェルプレートの1ウェルから培地を吸引し、500μLの細胞解離緩衝液と交換してください。
    注：ここで使用した市販の細胞解離緩衝液は、（材料表を参照）、コラゲナーゼと比較して、mTeSR1媒体での使用に適しています。
  4. IPSCコロニーの縁が少し持ち上げるように表示されるまで7分 - 3室温でインキュベートします。前に述べたように、インキュベーション時間は、ライン従属変数です。したがって、最適な時間を決定するために、顕微鏡下で細胞の解離を監視します。
  5. 慎重に解離緩衝液を吸引し、PBSで穏やかに2回洗浄します。
  6. ウェルに10ng / mLのY-27632のROCK阻害剤を用いて室温mTeSR1完全培地500μLを追加します。
  7. 代わりに、ステップ2.6のようにスコアリングコロニーの、P200チップを使用してメディアにコロニーの所望の数をプッシュし、静かに細胞懸濁液を2倍のAGを粉砕しますサイズは200ミクロン - 〜50の塊にhiPSCコロニーを破壊するだけでなくの一角ainst。各1新しいウェルに転送するために2個のコロニー - 例えば、12ウェルプレートについて、1を選択します。 12ウェルプレートの単一の新しいウェルに古いから細胞懸濁液を転送します。
  8. 細胞を均一に広げ、37℃、5％CO 2インキュベーター中で24時間プレート残りをさせるためにいくつかの迅速、前後、および横方向の動きにプレートを揺らし。
  9. mTeSR1完全培地を毎日フルメディアの変更を行います。前述のように、最初のプレーティング後のY-27632 ROCK阻害剤を添加する必要はありません。
    注：ステップ3.7から未使用のIPSCのコロニーは、この時点で、容易に凍結保存することができます。

免疫細胞化学のためのhiPSCsの播種のための商工会議スライドとカバーガラスの4準備

注：以下のプロトコルは、4ウェルのプラスチックチャンバースライドとappropriatと12ミリメートルのガラスカバースリップを利用しますマルチウェル中のメディアの電子ボリュームは、費用対効果の高い免疫細胞化学をサポートします。大きなウェルカバースリップサイズの使用が望まれる場合は、メディア・ボリュームを増大させることができます。

  1. 前hiPSCの合流点にある日、セクション1で説明したように十分なマトリックス溶液を追加したばかりの細胞外マトリックスでコーティングされたチャンバースライドを準備する（〜300から4ウェルチャンバースライドのウェルあたり500μL）だけでなく、任意の心配せずに完全にコートそれぞれに蒸発。代わりに、24ウェルプレートの各ウェルに1洗浄・滅菌カバースリップを配置した後、500μLの細胞外マトリックスでコーティングし、カバーガラスを溶液の上に浮いていないことを確認します。
  2. 通路の日に、4°Cからコーティングチャンバースライド/カバースリップを除去し、組織培養フード中で1時間室温に順化を可能にします。
  3. hiPSCsの12ウェルプレートの1ウェルから培地を吸引し、500μLの解離緩衝液と交換してください。
  4. 部屋テンペでインキュベート〜3 rature - IPSCコロニーの縁まで7分はわずかに持ち上げるように見えます。
  5. 慎重に解離緩衝液を吸引し、ウェルに10ng / mLのY-27632 ROCK阻害剤を用いて室温mTeSR1完全培地の1 mLを加え。
  6. 組織培養フードの内部に配置され、小さな位相差顕微鏡を使用して、手動で（〜千 - 直径が1500μm）をメッキする4ウェルチャンバースライドまたは1新しいカバースリップの1コロニー/新しい井戸を選ぶ押すことにより、P200のピペットチップを使用してそれ培地へプレート表面オフ。
  7. コーティングを乱さないように注意しながら、新しいチャンバースライド/カバースリップから行列を吸引します。
  8. サイズは200ミクロン - 優しく〜50の塊にhiPSCコロニーを破壊するために、細胞懸濁液をウェルの一角に対して2回粉砕します。ウェル4ウェルチャンバースライド/カバースリップのそれぞれの新しいウェルに古いから細胞懸濁液250μLを転送します。
  9. mTeSR1続き各新しいだけでなく、最大500μLの容量を持参10ng / mLのY-27632 ROCK阻害剤aining。
  10. 37℃、5％CO 2のインキュベーターでチャンバースライド/カバースリップを置きます。
  11. 24時間後、mTeSR1完全培地を毎日フルメディアの変更を行います。前述したように、再び、Y-27632 ROCK阻害剤の添加は、最初のプレーティングの後に必要ではありません。

免疫細胞化学のための性IPSCの5準備

  1. コンフルエント後、ウェルから培地を除去し、予め温めておい注意を 4％パラホルムアルデヒド（〜300μL/ウェルの4ウェルチャンバースライド/カバースリップ）を添加することにより固定を介しhiPSCコロニーを維持します。 20分間室温でインキュベートします。
  2. 制度バイオハザードや化学物質の安全性ガイドラインに従って適切にパラホルムアルデヒドを捨てます。
  3. PBSでベンチトップシェーカー上で5分間ずつ細胞を3回洗浄します。
    注：チャンバースライド/カバースリップ上の細胞は、この段階で無期限に4℃で十分なPBSを用いて格納することができます。あるいは、それらは、直ちにICCのために使用することができます。

多能性マーカーとhiPSCsの6免疫染色

注：標準的な多能性抗体を用いたイムノhiPSCs。アンチ段階特異的胎児性抗原4（SSEA4）を抗オクタマー結合タンパク質4（OCT-で：ここでは例として、細胞は、以下のように順次に1 1表面と1細胞内抗原を標的とする抗体で二重染色されています4）および抗TRA-1-60抗SRY関連HMGボックス遺伝子2（SOX2付き）（）抗体の詳細のための材料の表を参照してください。

  1. 井戸からPBSを吸引し、トリトンX-100なしで500μL/ウェルのブロッキング溶液に追加します。室温で1時間インキュベートします。
  2. トリトンX-100なしでブロッキング溶液で希釈することにより、表面抗体の、SSEA4またはTRA-1-60のいずれか、：事前に測定された濃度を準備します（200ここでは、1を使用します）。
    1. チャンバースライドの場合は、4ウェルチャンバースライドの300μL/ウェルを準備上記のソリューションおよび抗SSEA4またはTRA-1-60一次抗体の1.5μLをブロッキングの298.5μLを混合することによって。
    2. カバースリップのために、ソリューションおよび抗SSEA4またはTRA-1-60一次抗体の1μLをブロッキングの199μLを混合して40μL/カバースリップを準備します。
  3. チャンバースライドからのブロッキング溶液を吸引除去し、適切なウェルに一次抗体を分注します。カバースリップのために、しっかりとペトリ皿の内側にパラフィルムの一部を配置し、液滴のような上に一次抗体の40μLを分注します。曲がった注射針や鉗子を使用して、慎重に培養ウェルのうち、カバースリップを持ち上げ、パラフィルム上の抗体のドロップにダウンそれセル側に配置します。 4℃で一晩インキュベートします。
  4. チャンバースライドから抗体を除去し、PBS中に追加することで、各10分 - 翌朝は、3回、5細胞を洗浄します。カバースリップのために、パラフィルムオフ各1を持ち上げて、24ウェルプレート、セルサイドアップのほかに戻ってそれを置きます。慎重にPを追加BS。
  5. 1で適切な二次抗体を準備します。ブロッキング溶液で500。
    1. チャンバースライドの場合は、300μL/ウェルのソリューションおよび（SSEA4用）ヤギ抗マウスIgG3のアレクサフルオロ488または1μLヤギ抗マウスのIgMのアレクサフルオロの1μLをブロッキングの499μLを混合して4ウェルチャンバースライドを準備488（TRA-1-60のため）。
    2. カバースリップのために、ブロッキング溶液およびヤギ抗マウスIgG3の（SSEA4用）アレクサフルオロ488またはヤギの1μLTRA-1-60のための抗マウスIgMアレクサフルオロ488（の1μLの499μLを混合して40μL/カバースリップを準備）。
  6. チャンバースライドからPBSを吸引し、適切なウェルに二次抗体を分注します。カバースリップのために、ステップ6.2以下、2時間室温でパラフィルム上に配置された抗体溶液にカバースリップを反転。
    注：使用した蛍光二次抗体をタグ付けされた場合、細胞が光から保護されなければなりません。暗いENVでチャンバースライドとカバースリップを置きますインキュベーションおよび洗浄中にironment。
  7. チャンバースライドから抗体を除去し、PBS中に追加することで、10分ごと - 5のために、細胞を3回洗浄します。カバースリップのために、パラフィルムから一つ一つ丁寧に持ち上げ、24ウェルプレート、セルサイドアップのウェル内に戻って置きます。静かに洗浄液中にPBSを追加します。
  8. 第二の抗原に対するプロービングの前に、細胞内のOCT-4またはこの場合SOX2は、室温で1時間透過処理試薬（トリトンX-100）で作られたブロッキング溶液中で再度インキュベートします。
  9. OCT-4またはSOX2のために免疫染色するには、単に一次および二次抗体を適用するための手順6.1から6.6に記載の方法に従ってください。 1から200及び二次抗体ヤギ抗ウサギIgGアレクサフルオロ594：このプロトコルの目的のために、1の濃度で、OCT-4及びSOX2を使用する500。
  10. 6'-ジアミジノ-2 'PBSで10分間ずつ4で対比染色 - 上記の一次および二次抗体処理後、5、細胞を3回洗浄-phenylindole、核の可視化が所望される場合、標準的なプロトコルを以下の二塩酸塩（DAPI）。

表示7.準備

  1. チャンバースライドの場合は、慎重に製造者の指示に従って、スライドから上部チャンバーを削除します。その後、蒸留水ですすぎ、および顕微鏡検査を可能にするための媒体とカバーガラスを取り付け追加します。
  2. カバースリップは、ガラス顕微鏡スライド上に配置された封入剤のドロップに上カバースリップを反転。
  3. 標準または共焦点蛍光顕微鏡下での画像。

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結果

このプロトコルは、人間性IPSCは、無フィーダーするための条件をフィーダー層から転送され、その後、具体的に多能性の維持を確認するための費用対効果の高い免疫細胞化学を有効にするために限定的に伝播させることができる方法を段階的に説明します。 図1は、このプロトコルの概略図を示します。 図2Aは、6ウェルプレート中iMEFsに成長しているhiPSCコロニーを示しています。これらのコロニーは、定義された境界線と濃厚相明るいセンターとの典型的な形態を示します。 図2Bに示すように、無フィーダー12ウェルプレート中で条件をiPS細胞の転写後に、コロニー形態は、以下の異なるエッジを有する幾分無秩序現れます。また、いくつかのiMEFsこの段階で培養物中に残ることができます。 図2Cは、フィーダーフリーシステムに追加の通過後、IPSCのコロニーがCYに高い核を持つ古典的な単層の形態を示していることを示していますtoplasm比。この段階では、iMEFsが実...

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ディスカッション

ここで紹介する体系的なプロトコルは、具体的には、免疫細胞化学を介して、効果的な多能性分析をサポートするように設計されたスケールダウン培養技術の形で時間節約と費用対効果の高い方法を、提供しています。

以下のように記載される方法論の主な利点はあります。伝統的に3以上4継代12、13を表示するバルク分離技術の使用後に残留iMEFsを除去するために、典型的な単層形態のための培養条件の無フィーダするフィーダー層からiPS細胞を移行するために必要とされます。これとは対照的に、ここで紹介する方法は、IPSCコロニーの手動ピッキングを経由して無血清条件へのiPS細胞の比較的迅速な転送を可能にする短縮タイムラインを伴います。性IPSCは、小さなチャンバースライドまたは免疫細胞化学のために資するカバースリップ中に限られた量で栽培されています。実際には、voluウェル当たりに必要な培地の私はちょうど0.5 mLであり、このプロトコルを使用する場合、単一のカバースリップの...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

資金源: アリゾナ大学、ジム・ヒメリック財団、アリゾナ複合疾患の生物学センター。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEM-F12/HEPESライフテクノロジー11330032
ノックアウト血清補充ライフテクノロジーズ 10828028
L-グルタミンライフテクノロジーズ 25030081
MEM-NEAAライフテクノロジーズ 11140050
2-メルカプトエタノールライフテクノロジーズ 21985023
組換えヒトFGF-基礎細胞科学CRF001B
Y-27632 ROCK阻害剤R&D1254
コラゲナーゼ IV型Life Technologies17104019
マトリゲル hESC認定 マトリックスコーニング354277
mTeSR1 基礎培地StemCell Technologies05850
mTeSR1 5x SupplementStemCell Technologies05850
Gentle Cell Dissociation BufferStemCell Technologies07174
0.1 M PO4 BufferIn-Housen/a
Paraformaldehyde, prillElectron Microscopy Sciences19202
1x Phosphate Buffered Salinen/an/a
Normal Goat SerumLife Technologies16210072
ウシ血清アルブミンSigma-AldrichA2153
Triton-X-100Sigma-AldrichX100
Oct-4A (C30A3) ウサギ mAb,
Sox2 (D6D9) ウサギ mAb,
SSEA4 (MC813) マウス mAb,
TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) マウス mAb		細胞シグナル伝達
細胞シグナル伝達
細胞シグナル伝達
細胞シグナル伝達		2840
3579
4755
4746		あるいは、カタログ#9656
ヤギ抗Ms抗体 Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21042
ヤギ抗Ms IgG3 Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21151
ヤギ抗Rb IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11037
ウェル細胞培養プレートに、6種類の多能性一次抗体を一緒に購入することもできますフィッシャーサイエンティフィック 0720080/07200816、12、24、48、96ウェルサイズで利用可能
チャンバースライドフィッシャーサイエンティフィック 12 565 21ガラスまたはPermanoxプラスチックで利用可能 1、2、4、8、16ウェルサイズ
成長用カバーガラスッシャーサイエンティフィック 12 545 8212、15、18、22、25 mmのサイズで利用可能
ズ マルチ フィ

参考文献

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