人工多能性幹細胞（iPS細胞）の定期的な特性評価は、それらの多能性状態の維持を確認するために、これらの細胞が他のアプリケーションに使用される前の重要なステップです。ここでは、免疫細胞化学によるヒトiPS細胞の簡便かつルーチンな特性評価を可能にするために特別に設計された、ヒトiPS細胞の小規模増殖法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を疾患のモデリングや細胞治療に利用することに大きな関心が寄せられています。その特徴と特徴的な幹細胞性からさかのぼります。しかし、iPS細胞の機能に必須の多能性を確認しないと、これらの細胞をこのようなアプリケーションで使用することはできません。iPS細胞の多能性を確立するためには、さまざまな細胞アッセイや機能アッセイを通じてiPS細胞の厳密な特性評価が必要ですが、免疫細胞化学的手法により、多能性維持の日常的な評価をより簡単かつ効果的に行うことができます。ここでは、免疫細胞化学を用いたヒトiPS細胞の多能性状態の検証を特に容易にするために、ヒトiPS細胞をスケールダウンして培養するための体系的なプロトコールを紹介します。具体的には、この方法論には、無血清条件でiPS細胞を増殖させ、免疫細胞化学に最適な小さなチャンバースライドまたはガラスカバースリップに播種する効率的で費用対効果の高い方法が含まれます。
概要
人工多能性幹細胞（iPS細胞）に、ヒト成人の体細胞を再プログラミングする疾患1,2を研究するための患者特異的細胞の潜在的に無制限の供給を得るための方法を提供します。 in vitroでの疾患表現型を反復することは、それがもっともらしい疾患に関連する細胞および分子メカニズムを調べるために行い、創薬やオーダーメイド医療3を高めるであろう。加えて、ヒトiPS細胞（hiPSCs）が死亡または機能不全の細胞を交換し、いくつかの障害4、5との関連で機能を回復するための固有の資源として使用することができる特定の細胞型を誘導する可能性を提供します。
上記のアプリケーションでiPS細胞を使用することに重要な前提条件は、その多能性未分化状態は、培養中の拡張中に維持されることを保証することです。一般的に、techniq細胞および特殊な装置を大量に必要とするようなフローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応および機能アッセイのようなUEは、IPSCの多能性
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プロトコル
hiPSCsは4ミリメートルの皮膚パンチ生検から単離されたヒト皮膚線維芽細胞に由来し、センダイウイルス媒介リプログラミング11を 介して家の中に再プログラムされました。アリゾナ大学の治験審査委員会は、被験者の募集と生検コレクションのすべての手順を承認しました。
IPSC文化のための細胞外マトリックスコーティングされた表面の調製
- 前日iMEFsに成長しているhiPSC文化の合流点に、細胞外マトリックス（マトリゲル）でコーティングされたプレートを準備します。
- 緩慢解凍は、細胞外マトリックスのアリコート2時間4℃で氷の上で（依存多くは、仕様書の指示に従ってください）。
- バイオセーフティフードでは、（-20℃で保存）冷たいピペットチップを使用して、多くの特定の希釈率に係る冷ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12（DMEM / F12 / HEPES）に、細胞外マトリックスの1アリコートを追加。
- ディスペンス〜60081;それぞれの新しい細胞培養ウェル当たり細胞外マトリックスのLは、必要に応じて12ウェルプレートを処理しました。
- 室温で数時間プレートをインキュベートします。ここでは、3時間のインキュベーション時間を使用します。
注意：プレートを直ちに使用するか、または2週間まで4℃で保存することができます。 ....
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結果
このプロトコルは、人間性IPSCは、無フィーダーするための条件をフィーダー層から転送され、その後、具体的に多能性の維持を確認するための費用対効果の高い免疫細胞化学を有効にするために限定的に伝播させることができる方法を段階的に説明します。 図1は、このプロトコルの概略図を示します。 図2Aは、6ウェルプレート中iMEFsに成長しているhiPSCコロニーを示しています。これらのコロニーは、定義された境界線と濃厚相明るいセンターとの典型的な形態を示します。 図2Bに示すように、無フィーダー12ウェルプレート中で条件をiPS細胞の転写後に、コロニー形態は、以下の異なるエッジを有する幾分無秩序現れます。また、いくつかのiMEFsこの段階で培養物中に残ることができます。 図2Cは、フィーダーフリーシステムに追加の通過後、IPSCのコロニーがCYに高い核を持つ古典的な単層の形態を示していることを示していますtoplasm比。この段階では、iMEFsが実.......
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ディスカッション
ここで紹介する体系的なプロトコルは、具体的には、免疫細胞化学を介して、効果的な多能性分析をサポートするように設計されたスケールダウン培養技術の形で時間節約と費用対効果の高い方法を、提供しています。
以下のように記載される方法論の主な利点はあります。伝統的に3以上4継代12、13を表示するバルク分離技術の使用後に残留iMEFsを除去するために、典型的な単層形態のための培養条件の無フィーダするフィーダー層からiPS細胞を移行するために必要とされます。これとは対照的に、ここで紹介する方法は、IPSCコロニーの手動ピッキングを経由して無血清条件へのiPS細胞の比較的迅速な転送を可能にする短縮タイムラインを伴います。性IPSCは、小さなチャンバースライドまたは免疫細胞化学のために資するカバースリップ中に限られた量で栽培されています。実際には、voluウェル当たりに必要な培地の私はちょうど0.5 mLであり、このプロトコルを使用する場合、単一のカバースリップの.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
資金源: アリゾナ大学、ジム・ヒメリック財団、アリゾナ複合疾患の生物学センター。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM-F12/HEPES | ライフテクノロジー | 11330032 | |
| ノックアウト血清補充 | ライフテクノロジー | ズ 10828028 | |
| L-グルタミン | ライフテクノロジー | ズ 25030081 | |
| MEM-NEAA | ライフテクノロジー | ズ 11140050 | |
| 2-メルカプトエタノール | ライフテクノロジー | ズ 21985023 | |
| 組換えヒトFGF-基礎 | 細胞科学 | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK阻害剤 | R&D | 1254 | |
| コラゲナーゼ IV型 | Life Technologies | 17104019 | |
| マトリゲル hESC認定 マトリックス | コーニング | 354277 | |
| mTeSR1 基礎培地 | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5x Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1 M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldehyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) ウサギ mAb, Sox2 (D6D9) ウサギ mAb, SSEA4 (MC813) マウス mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) マウス mAb | 細胞シグナル伝達 細胞シグナル伝達 細胞シグナル伝達 細胞シグナル伝達 | 2840 3579 4755 4746 | あるいは、カタログ#9656 |
| ヤギ抗Ms抗体 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| ヤギ抗Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| ヤギ抗Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| ウェル細胞培養プレート | に、6種類の多能性一次抗体を一緒に購入することもできますフィッシャーサイエンティフィック | 0720080/0720081 | 6、12、24、48、96ウェルサイズで利用可能 |
| チャンバースライド | フィッシャーサイエンティフィック | 12 565 21 | ガラスまたはPermanoxプラスチックで利用可能 1、2、4、8、16ウェルサイズ |
| 成長用カバーガラス | ッシャーサイエンティフィック | 12 545 82 | 12、15、18、22、25 mmのサイズで利用可能 |
参考文献
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, ....
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