細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

サマリー

このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。

要約

細胞遊走は免疫応答、成長、および創傷治癒の重要な一部です。細胞遊走は、細胞外マトリックス、および可溶性および非水溶性の化学的因子（ 例えば 、化学誘引物質）との間の相互作用が関与する複雑なプロセスです。このようなボイデンチャンバーアッセイ、分周器のいずれかの側に細胞を計数することにより、作業のような細胞の遊走を測定するための標準的な方法。これらの技術は、使いやすいです。しかし、彼らは、異なるアプリケーションのために少しの幾何学的修正を提供しています。対照的に、マイクロ流体デバイスは、可溶性因子^1、2のカスタマイズ可能な濃度勾配を有する細胞遊走を観察するために使用することができます。しかし、マイクロ流体ベースのアッセイを作製するための方法は、学ぶことは困難な場合があります。

ここでは、化学物質の濃度勾配に応答して細胞遊走を測定するための細胞培養チャンバを作成するための容易な方法を記載します。私たちの細胞マイルグレーションチャンバー法は、様々な用途のための細胞移動を研究するために、別の直線濃度勾配を作成することができます。この方法は、使用が比較的容易であり、典型的には学部学生によって行われます。

マイクロチャンネル室はよくペトリ皿に、最終的なマイクロ流路室の形状のアクリルインサートを配置することによって作成されました。この後、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）は、インサートの上に注ぎました。 PDMSを硬化させ、次いで、インサートを除去しました。これは、任意の所望の形状や大きさのウェルの作成を可能にしました。細胞は続いてマイクロチャネルチャンバーに添加することができる、可溶性薬剤は、所望の薬剤にアガロースブロックを浸漬することによってウェルのいずれかに添加することができます。アガロースブロックをウェルのいずれかに添加し、タイムラプス画像は、細胞遊走を定量するために、マイクロチャネル室を撮影することができます。この方法のバリエーションは、このメソッドのHIGを作り、所与の用途のために作ることができますHLYカスタマイズ可能。

概要

創傷治癒、免疫応答、胚発生などの重要な過程が起こるためには、細胞の移動が起こらなければなりません。細胞遊走には、細胞と隣接する細胞との間の相互作用、細胞外マトリックス、および可溶性の化学的手がかり(誘引剤または忌避剤)が含まれます。一例として、創傷治癒の過程で、線維芽細胞は線維形成と創傷収縮に不可欠な役割を果たし、細胞が損傷部位に動員されてコラーゲンを合成し、細胞外マトリックス³を形成します。線維芽細胞の創傷部位への移動の背後にある多くのメカニズムが研究されており、それらにはさまざまな機械的、物理的、電気的、走化性因子が含まれます⁴。線維芽細胞は、成長因子のさまざまな濃度勾配に特によく反応します。これらの異なる成長因子は、組織の再生を最適化するために連携して働きます⁵。成長因子濃度に対する線維芽細胞の走化性応答を観察しながら、線維芽細胞の方向性移動のパターンと、線維芽細胞が目的地に到達するために物理的な障害物の周りをどのように向き付けるかを研究することができます。したがって、この研究の目標は、最初に、物理的な障壁によるガイダンスの下で線維芽細胞の成長を追跡できるシステムを開発し、次に、システム内を移動する線維芽細胞の成長をモデル化

することでした。

現在、ボイデンチャンバーアッセイは、細胞の移動を測定するために最も広く使用されているシス....

プロトコル

1.濃度勾配を作成するためにマイクロチャンネル発生室

1. アクリル成形型部品を切削
   1. 所望の幅のアクリルの一部を取得します。典型的には、1/16インチ厚のアクリルシートを使用。より厚いシートは、それらが処理中に破損したり、ワープさせ、必要な機械的強度を持っていないだけでなく、非常に薄いシートをカットすることは困難です。
   2. ポリジメチルシロキサン（PDMS）内に空洞を生成するためにアクリル片の所望の形状のCADファイルを作成します。個々の実験プロトコルに関連する目的の勾配を達成するために、チャネル幅と長さを調整します。
      1. 0.127センチメートル広いチャネル（0.254センチメートル長い）（ 図1）によって接続された2つの正方形（のx 0.254センチメートル0.254センチメートル）：ここでは、以下の寸法のアクリル作品を使用しています。
   3. レーザー切断装置にCADファイルをインポートし、マヌーに応じてレーザーカッターでアクリルピースを配置facturerのプロトコル。
      注：別の方法として、CAD設計から作品を3D-印刷します。この方法の利点は、代替材料が金型に使用することができることです。しかしながら、分解能および再現性は、レーザー切断に比べて三次元印刷に減少させることができます。

結果

図2は、細胞がメッキされているところから、チャネルの反対側の端部に配置されたウシ胎児血清の勾配に応じて、チャネル全体のセルフロントの動きを示しています。細胞フロント48時間（ 図2A）、72時間（ 図2B）、96時間（ 図2C）、および120時間（ 図2D）ポストプレーティングで示されています。セルフロントの移動は、これらのタイムラプス画像で追跡し、移動距離と成長率は、MATLABの関数polyfitによって計算しました。このことから、平均セルフロント速度が13.4ミクロン/時（ 図3）であることが見出されました。 図4は、チャネルの一端にデキストラン浸したアガロースブロックを配置し、デキストランは、12時間のためのチャネルを通って拡散することを可能にすることによって確立された蛍光勾配を示しています。タイムラプス画像は、毎時間で撮影した.......

ディスカッション

我々のマイクロチャネル室は、成長因子及び化学誘引物質に応答した細胞遊走の速度を決定し、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することを含む、目的の多数のために使用することができます。細胞を増殖し、チャンバの一端に化学誘引物質を配置するために我々のマイクロチャネル室を利用することが可能です。細胞は、化学誘引物質に応答して成長し、細胞遊走、細胞移動速度を決定するために分析することができるタイムラプス画像を撮影することによって定量することができます。この方法の代表的な結果は、成長速度は、MATLAB関数polyfitを使用して13.4ミクロン/時間であると決定された、図3に示されています。

我々のマイクロチャネル室の別の使用は、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することです。関心対象の薬剤と同様の分子量の蛍光タグ付けされたデキストランはDRUの拡散をモデル化するために使用することができます興味のあるグラム。サンプルは、勾配を崩壊させるだろう対流の大量として慎重に取り扱わなければならないことに留意することが重要です。この方法の代表的な結.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シルガード 184 シリコーン エラストマー キット	シグマ アルドリッチ	761036	ポリ (ジメチルシロキサン) 2 部構成キット シリコーン エラストマー ベースとシリコーン エラストマー硬化剤を含む
アクリル シート	US プラスチック	44200
使い捨てペトリ皿	ファルコン	25373-041
フルオレセインイソチオシアネート–デキストラン	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
アガロース、I型、低EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
ダルベッコのモディファイドイーグルス培地 フィ	ッシャーサイエンティフィ	11965092	細胞培地の成分
シ胎児	フィッシャーサイエンティフィック	16000036	細胞培地の成分
ペニシリン-ストレプトマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	15140148	細胞培地の成分
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Time-lapse imagesの撮影に使用される機器
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	モデル番号VLS2.30	プラスチックの切断に使用されるレーザーカッター

ック ウ血清