細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

Summary

このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。

Abstract

細胞遊走は免疫応答、成長、および創傷治癒の重要な一部です。細胞遊走は、細胞外マトリックス、および可溶性および非水溶性の化学的因子（ 例えば 、化学誘引物質）との間の相互作用が関与する複雑なプロセスです。このようなボイデンチャンバーアッセイ、分周器のいずれかの側に細胞を計数することにより、作業のような細胞の遊走を測定するための標準的な方法。これらの技術は、使いやすいです。しかし、彼らは、異なるアプリケーションのために少しの幾何学的修正を提供しています。対照的に、マイクロ流体デバイスは、可溶性因子^1、2のカスタマイズ可能な濃度勾配を有する細胞遊走を観察するために使用することができます。しかし、マイクロ流体ベースのアッセイを作製するための方法は、学ぶことは困難な場合があります。

ここでは、化学物質の濃度勾配に応答して細胞遊走を測定するための細胞培養チャンバを作成するための容易な方法を記載します。私たちの細胞マイルグレーションチャンバー法は、様々な用途のための細胞移動を研究するために、別の直線濃度勾配を作成することができます。この方法は、使用が比較的容易であり、典型的には学部学生によって行われます。

マイクロチャンネル室はよくペトリ皿に、最終的なマイクロ流路室の形状のアクリルインサートを配置することによって作成されました。この後、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）は、インサートの上に注ぎました。 PDMSを硬化させ、次いで、インサートを除去しました。これは、任意の所望の形状や大きさのウェルの作成を可能にしました。細胞は続いてマイクロチャネルチャンバーに添加することができる、可溶性薬剤は、所望の薬剤にアガロースブロックを浸漬することによってウェルのいずれかに添加することができます。アガロースブロックをウェルのいずれかに添加し、タイムラプス画像は、細胞遊走を定量するために、マイクロチャネル室を撮影することができます。この方法のバリエーションは、このメソッドのHIGを作り、所与の用途のために作ることができますHLYカスタマイズ可能。

Introduction

創傷治癒、免疫応答、胚発生などの重要な過程が起こるためには、細胞の移動が起こらなければなりません。細胞遊走には、細胞と隣接する細胞との間の相互作用、細胞外マトリックス、および可溶性の化学的手がかり(誘引剤または忌避剤)が含まれます。一例として、創傷治癒の過程で、線維芽細胞は線維形成と創傷収縮に不可欠な役割を果たし、細胞が損傷部位に動員されてコラーゲンを合成し、細胞外マトリックス³を形成します。線維芽細胞の創傷部位への移動の背後にある多くのメカニズムが研究されており、それらにはさまざまな機械的、物理的、電気的、走化性因子が含まれます⁴。線維芽細胞は、成長因子のさまざまな濃度勾配に特によく反応します。これらの異なる成長因子は、組織の再生を最適化するために連携して働きます⁵。成長因子濃度に対する線維芽細胞の走化性応答を観察しながら、線維芽細胞の方向性移動のパターンと、線維芽細胞が目的地に到達するために物理的な障害物の周りをどのように向き付けるかを研究することができます。したがって、この研究の目標は、最初に、物理的な障壁によるガイダンスの下で線維芽細胞の成長を追跡できるシステムを開発し、次に、システム内を移動する線維芽細胞の成長をモデル化

することでした。

現在、ボイデンチャンバーアッセイは、細胞の移動を測定するために最も広く使用されているシステムです⁶。ボイデンチャンバーは、2チャンバーのマルチウェルプレートで構成されており、各ウェルには化学誘引剤の有無にかかわらず培地が含まれている場合があります⁷。フィルターメンブレンは、各ウェルの2つのチャンバー間に多孔質の界面を提供します。これにより、セルがアクティブ移動によって行われない限り、セルが通過できないようにバリアが作成されます。通常、ボイデンチャンバーでは、化学誘引剤が下部チャンバーに追加され、システムが平衡化して上部と下部のウェルの間に勾配が形成されます⁴。ボイデンチャンバーアッセイの問題点の1つは、メンブレンの表面と垂直な1つの軸に沿って急勾配が形成されることです。これにより、上部ウェルと下部ウェルの間の走化性物質濃度の差は、当初の予想よりも小さくなります。この制約により、ボイデンチャンバーアッセイでは、特定の細胞応答と特定のグラジエント特性(傾きや濃度差など)を相関させることが難しくなります。これらの測定がなければ、マルチグラジエント信号の積分を研究することは困難です。

従来のボイデンチャンバーアッセイの制約の一部に対処するために、マイクロ流体アッセイが開発され、カスタマイズ可能な濃度勾配を形成しました¹。マイクロ流体システムを作成するための標準的な方法では、リソグラフィー技術のためのクリーンルームが必要です。これらのテクニックは、特に標準的な教室の環境では習得するのが難しい場合があります。そこで、クリーンルームを使わずに細胞移動を測定するためのチャンバーシステムを設計しました。当社のシステムを使用すると、アッセイのウェルを好みのサイズに調整でき、カスタマイズされた傾きの線形濃度勾配を生成できます。これにより、ランダムな動きから走化性を正確に測定することができます。この設計は、さまざまな化学刺激に応答した細胞増殖をモデル化するための安価で使いやすいシステムです。

Protocol

1.濃度勾配を作成するためにマイクロチャンネル発生室

1. アクリル成形型部品を切削
   1. 所望の幅のアクリルの一部を取得します。典型的には、1/16インチ厚のアクリルシートを使用。より厚いシートは、それらが処理中に破損したり、ワープさせ、必要な機械的強度を持っていないだけでなく、非常に薄いシートをカットすることは困難です。
   2. ポリジメチルシロキサン（PDMS）内に空洞を生成するためにアクリル片の所望の形状のCADファイルを作成します。個々の実験プロトコルに関連する目的の勾配を達成するために、チャネル幅と長さを調整します。
      1. 0.127センチメートル広いチャネル（0.254センチメートル長い）（ 図1）によって接続された2つの正方形（のx 0.254センチメートル0.254センチメートル）：ここでは、以下の寸法のアクリル作品を使用しています。
   3. レーザー切断装置にCADファイルをインポートし、マヌーに応じてレーザーカッターでアクリルピースを配置facturerのプロトコル。
      注：別の方法として、CAD設計から作品を3D-印刷します。この方法の利点は、代替材料が金型に使用することができることです。しかしながら、分解能および再現性は、レーザー切断に比べて三次元印刷に減少させることができます。

図1：マイクロチャンネル商工会議所のコンピュータ支援設計（CAD）表現。この画像は、マイクロチャネルのチャンバを作成するために必要なアクリルインサートのCAD図面を示します。 1 A）CAD図面、1B）インチに寸法とCAD図面の側面図、 図1C）インチに寸法とCAD図面の上面図の上面図この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2. 、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を注ぎます
   1. 計量ボートでは、商業用エラストマー硬化剤（ 例えば 、シルガード194）1重量部で商業エラストマーベース（ 例えば 、シルガード184）10重量部を混合します。一般的に、エラストマー硬化剤の1グラムにエラストマーベースの10グラムを混ぜます。
   2. 5分間、マイクロピペットを用いて塩基及び硬化剤を組み合わせることかき混ぜます。
   3. 真空ベルを設定し、閉じ込められた気泡を除去するために30分間真空中でPDMSと計量ボートを配置します。
   4. 真空の電源を切り、計量ボートを削除します。小さなペトリ皿にアクリルカットアウトの上にPDMSを注ぎます。 PDMSが完全に挿入をカバーしていることを確認してください。
   5. PDMSは、室温で一晩（少なくとも18時間）を硬化させます。
3. PDMSからの挿入を削除します
   1. PDMSを硬化させた後、慎重にメスでアクリル作品の周りにPDMSを切断することにより、インサートを取り外します。

2.マイクロチャネルチャンバー内の細胞をプレーティング

1. 細胞をプレーティングするためのチャンバを殺菌します。
   注：PDMSは、エチレンオキシドまたは他の技術を用いて滅菌することができるが、迅速なUV処理は、迅速、安価、および細胞培養研究のために十分です。短いUV処理時間はPDMS片の構造又は機械的完全性を損ないませんでした。
   1. 標準的な細胞培養キャビネット内に、完全に70％エタノールを用いてチャンバを覆います。
   2. 蓋をオフにして、層流フード内でペトリ皿を置きます。
   3. フードを終了し、UV光をオンにします。 1〜2時間UV光にさらします。
   4. 層流フードを開き、流れを再確立するために15分を待ちます。
   5. 70％エタノールを削除します。
   6. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回チャンバを洗浄します。各洗浄のために1mLのPBSを使用してください。 PBSを削除し、室は蓋をオフにして一晩乾燥させます。
      注：別の方法として、代わりに1が利用可能な場合、層流フードを使用しての、滅菌のためにUVチャンバーボックスを使用します。アルミホイルを敷いた段ボール箱の裏面にUV光源を配置することによって、UVボックスを作成します。アルミ箔は、サンプルの均一な照明を可能にするために光を反射します。
2. チャンバー内の細胞をプレーティング
   1. トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を数えます。
      1. 0.4％トリパンブルーの400μLに100μLの細胞懸濁液を加え、穏やかに混合。静かにカバーガラスの下で両室を充填することにより、血球計数器に、この溶液100μLを適用します。
      2. 血球計数器上のグリッドに注力して10X対物レンズで顕微鏡を使用してください。血球計数器上の16の正方形の1セット内生非染色細胞をカウントするために手の数取器を使用してください。
      3. 16の正方形のすべての4組のセルをカウントします。 16の正方形の4セットからの平均細胞数を取り、5×10 ⁴を掛け。この最後の番号はnumbeです細胞懸濁液中の細胞/ mLのR。
   2. 各チャンバ内の1つのウェルに2,500細胞を追加します。これは〜3万/ cm ²の近コンフルエント細胞密度に変換されます。
   3. 細胞は培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）を加える前に、60分間室内に座ってできるようにします。

3.デキストラン浸しアガロースブロック

1. アガロースブロックを作成します
   1. 3Dプリントモールド（2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートル）にアガロース3％を注ぎます。
   2. アガロースは、任意の気泡を除去するために30分間、真空チャンバー内に固化することができます。
   3. 金型からアガロースブロックを削除します。
      注：別の方法として、2ミリメートルの厚さで小さなペトリ皿にアガロース3％を注ぎます。メスまたは他の切削工具を使用して、2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートルのブロックをカット。これは、金型システムのように正確ではありませんが、それを行うのは少し楽にすることができます。
2. 完全submerg走化性因子の所望の濃度の溶液中での電子アガロースブロック。濃度勾配の形成を評価するために、蛍光デキストランで第一室をフラッシュします。デキストランの濃度および分子量は、目的の可溶性因子または薬物のそれと一致する必要があります。
3. アガロースブロック一夜を浸します。

可溶性因子の濃度勾配を評価するために、デキストラン拡散の4タイムラプス

1. マイクロチャネル室の小さな正方形のウェルにデキストラン浸したアガロースブロックを配置します。
2. セルイメージングシステム内のマイクロチャネル室を配置したり、タイムラプス機能を備えた別の蛍光顕微鏡を使用しています。製造元の指示に従ってタイムラプスを開始します。
   注：示された結果は、GFPフィルター、50％の光、4月10日のpH、および4倍の倍率で撮影されています。

細胞増殖の5タイムラプス

1. の一端にマイクロチャネルチャンバー内板細胞チャンバー。ここでは、3T3線維芽細胞を使用しています。マイクロチャネルチャンバー内で1つのウェルに2,500細胞を追加します。 2.2.1で説明したように、細胞をカウントします。
   1. 細胞は培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）を加える前に、60分間室内に座ってできるようにします。 5％CO ₂中37℃で播種した細胞とマイクロチャンネル室を保管してください。チャネルを介して細胞遊走を顕微鏡で見ることができます。
   2. マーカーを追加または距離セルフロントの動きを定量化するための出発点として機能するために、マーカーとしてチャンバ内の微小欠陥を使用します。
2. マイクロチャネルの一方の端部に集中し、成長因子、化学誘引物質、薬物、または他の因子が試験される（ここで、40％FBSを例として使用されている）を含むアガロースゲル（8 mm ³でブロック）を配置することによって勾配を確立しますチャンバー。
3. 移動セルフロントのタイムラプス画像を撮影します。ここでは、結果があちこちセルの画像を表示しますNTイメージングシステムを用いて12時間ごとに採取したもの。
4. 細胞増殖速度を定量化するために、セルの前面の写真を使用してください。最初のセルのフロント、チャネル壁、及び基準マーカによって定義される多角形のマスクを作成する（roipoly）MATLABの関数polyfitを使用して、増殖速度を計算します。このマスクの寸法は、平均セルフロント速度が算出されたフロントの移動距離をもたらします。他の研究では、同様の方法^8を利用しています。
   注：同じ距離で可溶性因子の濃度になるように、各フレーム上の細胞増殖前面の縁を比較してください。可溶性因子の濃度勾配は、1次元拡散モデルの近似を用いて計算されます。
5. ファロイジンおよびDAPI染色を用いて細胞の蛍光画像を撮ります。
   1. ファロイジンで染色する前に細胞を固定。
      1. 37℃で温め、4％パラホルムアルデヒド。
      2. セルをカバーするのに十分な4％パラホルムアルデヒドを加えます。で細胞を保ちます10分間パラホルムアルデヒド。
      3. 15分間、PBSで2回、それぞれの時間をすすぎます。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。
   2. 細胞からPBSを除去し、細胞をカバーするのに十分な透過化溶液（PBS中0.1％トリトンX-100）を追加します。 10分間この溶液を残します。
   3. 毎回5分間、PBSで2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。
   4. 細胞からPBSを除去し、20分間溶液（PBS中の1％ウシ血清アルブミン）でブロッキング加えます。
   5. ブロッキング溶液を除去し、5分間PBSで各回2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。
   6. 使用されていない場合、この時点から、アルミニウム箔で光から細胞を保護します。細胞からPBSを削除し、1時間、PBSで希釈したファロイジン488 1:50に追加します。
   7. 各洗浄のための5分間、PBS中で2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。次に、細胞からPBSを削除します。
   8. 15分間、細胞をPBS 1,000：DAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を追加し、1に希釈しました。
   9. DAPIを削除し、各洗浄のための5分間PBSで2回細胞を洗浄します。
   10. 最後の洗浄を削除し、セルをカバーするのに十分なPBSを追加します。細胞は、現在、蛍光顕微鏡で画像化することができます。

Results

図2は、細胞がメッキされているところから、チャネルの反対側の端部に配置されたウシ胎児血清の勾配に応じて、チャネル全体のセルフロントの動きを示しています。細胞フロント48時間（ 図2A）、72時間（ 図2B）、96時間（ 図2C）、および120時間（ 図2D）ポストプレーティングで示されています。セルフロントの移動は、これらのタイムラプス画像で追跡し、移動距離と成長率は、MATLABの関数polyfitによって計算しました。このことから、平均セルフロント速度が13.4ミクロン/時（ 図3）であることが見出されました。 図4は、チャネルの一端にデキストラン浸したアガロースブロックを配置し、デキストランは、12時間のためのチャネルを通って拡散することを可能にすることによって確立された蛍光勾配を示しています。タイムラプス画像は、毎時間で撮影した...

Discussion

我々のマイクロチャネル室は、成長因子及び化学誘引物質に応答した細胞遊走の速度を決定し、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することを含む、目的の多数のために使用することができます。細胞を増殖し、チャンバの一端に化学誘引物質を配置するために我々のマイクロチャネル室を利用することが可能です。細胞は、化学誘引物質に応答して成長し、細胞遊走、細胞移動速度を決定するために分析することができるタイムラプス画像を撮影することによって定量することができます。この方法の代表的な結果は、成長速度は、MATLAB関数polyfitを使用して13.4ミクロン/時間であると決定された、図3に示されています。

我々のマイクロチャネル室の別の使用は、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することです。関心対象の薬剤と同様の分子量の蛍光タグ付けされたデキストランはDRUの拡散をモデル化するために使用することができます興味のあるグラム。サンプルは、勾配を崩壊させるだろう対流の大量として慎重に取り扱わなければならないことに留意することが重要です。この方法の代表的な結...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
シルガード 184 シリコーン エラストマー キット	シグマ アルドリッチ	761036	ポリ (ジメチルシロキサン) 2 部構成キット シリコーン エラストマー ベースとシリコーン エラストマー硬化剤を含む
アクリル シート	US プラスチック	44200
使い捨てペトリ皿	ファルコン	25373-041
フルオレセインイソチオシアネート–デキストラン	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
アガロース、I型、低EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
ダルベッコのモディファイドイーグルス培地 フィ	ッシャーサイエンティフィ	11965092	細胞培地の成分
シ胎児	フィッシャーサイエンティフィック	16000036	細胞培地の成分
ペニシリン-ストレプトマイシン	フィッシャーサイエンティフィック	15140148	細胞培地の成分
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Time-lapse imagesの撮影に使用される機器
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	モデル番号VLS2.30	プラスチックの切断に使用されるレーザーカッター