方法論記事

評価するための総合的な手順

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DOI：

10.3791/55271

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2017年3月4日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Translational and Molecular Imaging Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

この記事について

サマリー

ナノメディシンの生体内性能についての理解が不十分であるため、彼らの臨床翻訳が妨げられています。ここでは、担がん免疫担当マウスの全身、組織、単一細胞、および細胞内レベルでのがんナノメディシンのin vivo挙動を評価する手順について説明します。このアプローチは、研究者が臨床翻訳のための有望ながんナノメディシンを特定するのに役立つ可能性があります。

要約

クリニック内の前癌nanomedicinesの成功に触発され、研究者は、過去10年間で新規製剤を大量に生成しています。臨床開発中のnanomedicinesの大半は不本意な結果を生み出しているのに対し、しかし、nanomedicinesのほんの数は、臨床使用が承認されています。新しいがんnanomedicinesの成功の臨床翻訳するための一つの主要な障害は、それらのインビボ性能の正確な理解の欠如です。この記事では、陽電子放出断層撮影-コンピュータ断層撮影法（PET-CT）、放射能の定量法の統合を経て全身、組織、単一細胞、および細胞内レベルでの担癌マウスにおけるnanomedicinesのin vivoでの挙動を特徴付けるために厳格な手順を提供しています、フローサイトメトリー、および蛍光顕微鏡。このアプローチを使用して、研究者は、正確にcanceの関連するマウスモデルにおける新規なナノスケールの製剤を評価することができますrを。これらのプロトコルは、高翻訳可能性の最も有望な癌nanomedicinesを識別するか、将来の翻訳のための癌nanomedicinesの最適化を補助する機能を有していてもよいです。

概要

ナノメディシンは、癌治療の開発1のパラダイムをシフトしています。このようなリポソームおよびアルブミンベースnanotherapies 2、3のような以前のがんnanomedicines、膨大な臨床的影響に触発され、多くの新規製剤は、過去10年間で生産されています。しかし、これらの癌nanomedicinesの臨床翻訳の成功の最近の分析は、それらのほんの数は、臨床使用4、5のために承認されていることを示しています。新しいがんnanomedicinesの臨床翻訳するための一つの主要な障害は、無料の治療用化合物6の直接投与と比較して、治療指数の彼らの限られた改善です。このように、 インビボでの全身におけるnanomedicinesの性能、組織、および前臨床動物モデルにおける細胞レベルの正確な評価は、identifに不可欠ですyの将来の臨床翻訳のための最適な治療指数を有するもの。

ナノ材料は、すべての臨床イメージング様式7の間で優れた感度と再現性を持っている陽電子放射断層撮影（PET）イメージング、で生きている動物で定量的な特徴づけのために放射性標識することができます。例えば、89のZr標識長期循環nanomedicines癌8、9、10、ならびに他の疾患モデル11マウスモデルにおいて特徴付けられています。また、nanomedicinesの血中半減期および生体内分布が広く、個々の組織8にエクスビボ放射能の測定を用いて評価することができます。したがって、放射性標識は、全身および組織レベルでnanomedicinesを定量的に評価することができます。

重要なことは、radiolabeledはnanomedicinesは、一般的に、単一セルまたは放射性シグナルの限定された空間分解能に起因する細胞内レベルで分析することができません。したがって、蛍光標識は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡12のような光イメージング技術を有するナノ粒子の評価のための補完的な様式であることが分かります。この目的のために、放射性同位体、蛍光タグで標識されたナノ粒子は、定量的放射能計数によって核イメージングおよびエクスビボによってインビボで評価することができ、それらはまた、広く光学イメージングにより、細胞レベルで特徴づけることができます。

以前、我々は、高密度リポタンパク質（HDL）11、リポソーム9、10、ポリマーナノ粒子、抗体フラグメント、およびnanoemuを含む様々なナノ粒子に放射性および蛍光標識を組み込むためにモジュール式の手順を開発しましたlsions 10、13。これらの標識されたナノ粒子は、それらの特定の用途のためにこれらのナノ材料の最適化を導いている、さまざまなレベルでの適切な動物モデルで定量的な特徴づけのために許可されています。現在の研究では、目的は、二重標識されたナノ粒子を生成するために、十分古典同系メラノーマB16-F10マウスモデル15でそれを特徴付けるために、包括的な手順を示すための例-asリポソームナノ粒子の最も確立されたナノ医療のプラットフォーム14を使用することです。結果から、我々は、このナノ粒子の特徴付けアプローチは、関連するマウスモデルにおいて他の癌nanomedicinesを評価するように構成することができる確信しています。

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プロトコル

手順は、ナノ粒子の二重の放射性及び蛍光標識、in vivoでの PET-CTイメージング、ex vivoでの生体内分布の測定、およびex vivo免疫染色で構成され、フローサイトメトリー分析します。全ての動物実験は、メモリアル・スローンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

二重標識リポソームの調製

注：同系B16メラノーマ腫瘍を2％イソフルラン含有酸素を吸入から麻酔下でC57BL / 6マウスの背面脇腹に30万B16-F10細胞を注射することによって誘導することができます。手術中に滅菌ワークスペースに無菌試薬およびツールを使用してください。手術後、慎重に麻酔からの回復するまで動物を観察します。彼らは完全な意識と機動性を回復する場合にのみ、そのケージに戻って動物を置きます。異種移植された腫瘍を有する動物のための無菌室でそれらを収容します。サイズの腫瘍300ミリメートル3のナノ粒子の蓄積を増加させることができ、その顕著な強化された透過性および保持効果によるナノ粒子のキャラクタリゼーション（EPR）に最適です。詳細なプロトコルを以下に提供します。

  1. 丸底フラスコに、1,2- dipalmitoyl- SN -glycero -3- phophocholine（DPPC）、コレステロール、1,2- disearoyl- SN -glycero-を含むクロロホルム2mLに脂質20 mgの混合物を溶解3-ホスホエタノールアミン-ポリ（エチレングリコール）2000（DSPE-PEG2000）、DSPE-デフェロキサミン（DSPE-DFO）8、及び1,1- diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine -5,5-ジスルホン酸（ DiIC12 [5]は、それぞれ61.3％33.4％、5、0.2％、および0.1％のモル比で）-ds。
    注：この脂質組成物は、現在、診療所2で使用したドキソルビシンのリポソーム製剤と非常に類似しています。私たちの手順から得られたリポソームは、密接に臨床nanomedicのin vivo性能を模倣しますINE。
  2. 有機溶媒を除去し、室温で薄い脂質膜を形成し、ロータリーエバポレーターを使用して。氷上で十分に冷却して、3.8 mmの超音波処理チップと30 Wの振幅を用いて、リポソームナノ粒子を生成するために、20 mlのPBSと30分間超音波処理を追加します。
  3. 10分間4000×gで遠心分離リポソーム溶液凝集物を除去し、遠心濾過（分子量カットオフ（MWCO使用してPBSでナノ粒子を洗浄する：自由な脂質および残留有機溶媒を除去するために100キロダルトン）のリポソームを濃縮し、その意志上部チャンバー中に残り、新しいチューブに移す。リポソームは、後続のステップの前に最大1週間、PBS中の冷蔵庫に保存することができます。
  4. 品質管理のために、動的光散乱（DLS）によりリポソームを特徴付けます。具体的には、PBSの950μLを有するリポソームの50μLを混合し、次にサイジングキュベットに混合物を移します。アナライザにキュベットを置き、粒子を測定サイズは、そのサイズ分布を示します。それぞれ0.2 - 120nmで0.1 - 粒子サイズとそのサイズ分布（多分散性指数（PDI））が90であることが期待されます。
  5. 放射性標識のために、（1.5 mLチューブに2時間、37℃で1 mCiの89のZr-シュウ酸と6.9と7.1の間のpHで、総体積をPBS中の脂質の2ミリグラムに相当する精製されたリポソームを、ミックス：〜 100μL）。 1.3ステップと同様に、遠心濾過（MWCO = 100キロダルトン）によって自由、未反応の89のZrを削除します。滅菌PBSで保持物を洗浄し、所望の体積に希釈します。 95％ - 放射化学的収率は80でなければなりません。
    注意！放射性物質を使って作業することを強く規制されています。機関が認定し、必要な設備、人材育成、および放射能の使用の厳格な監視を提供する必要があります。研究者は、適切な訓練を受け、放射能を取り扱うときは個人用保護具や線量測定リング/バッジを着用する必要があります。
  6. 一般的に98％を超える10でなければならないサイズ排除ラジオ-HPLCにより放射性標識したリポソームの放射化学的純度を決定します。放射化学は95％未満、ステップ1.5に不十分な洗浄を示すものである純度。
  7. 放射性標識した後、動的光散乱法によりナノ粒子のサイズを決定します。サイズ及びPDIは、ステップ1.4 10での測定と同じ範囲内であることが期待されます。
    注：放射性サンプルをフローサイトメーターまたは蛍光顕微鏡で許可されていない場合は、非放射性のnatのZr-シュウ酸塩は、ステップ1.5でリポソームを標識するために使用することができます。これらの非放射性リポソームは、それらの放射性類似体と同一の特性を有しています。この手順の描写を図2に提供されます。

二重標識リポソームのインビボ PET-CTイメージングと生体内分布2.

  1. ワット二重標識リポソームの約100μLを注入i番目の約300の放射能のμCiの抑制メラノーママウス（C57BL / 6、10の女性、 - 16週齢）に、その尾静脈を介して、約10 mCiの89のZr / kg体重で。
  2. 半減期を決定するために、28-Gのインスリン注射器を使用して、2％イソフルラン含有酸素の下で麻酔した動物からの尾静脈から血液を描画します。 2分、15分、1時間、4時間、8時間、24時間、及び注射後48時間で、予め秤量したチューブ中 - （20μL10）血液を収集します。 、差によって血液を計量ガンマカウンターを用いて放射能量を決定し、グラムあたりの注射用量率（％ID / g）でのパーセンテージとして放射能濃度を計算します。
    注：麻酔システム、回復ケージ、加熱、およびバイオハザードフードを装備した部屋の手順を実行します。動物が完全に回復してケージを保持するに回復ケージからそれらを転送する前に、手順の後に通常の移動性を得ることを確認します。ハウスで投与した動物に指定された部屋で、腫瘍を有する動物放射性物質。
  3. の注射後24時間または48時間 リポソーム、小動物マイクロPET-CTスキャナ10の画像マウス。その腹に水平に麻酔をかけた動物を配置し、麻酔し、それを維持します。ノーズコーンを介して2％イソフルラン酸素を管理します。乾燥からそれらを防ぐために、スキャンの前に、その眼に眼軟膏を適用します。
  4. 15分のおおよその期間で、全身PET静的スキャン記録少なくとも5000万一致イベントを実行します。それぞれ、350から700 keVの6ナノ秒でのエネルギーとの一致タイミングウィンドウを設定します。その後、5分間行う断層撮影（CT）スキャンを計算しました。 80 kVの500μAの電流の電圧にX線管を設定します。 CTスキャンは、フレーム10当たり約145ミリ秒で、220度の合計120回転のステップを使用しています。
  5. PET-CTスキャンの後、すぐに二酸化炭素窒息によりマウスを屠殺し、pinchiによって死亡を確認動物の足をngの。確認されると、子宮頸部転位を行います。
  6. 最初の右心房を切開した後、左心室に20 mLのPBSを注入することによって、マウス組織に血液を除去し、その後、腫瘍、肝臓、脾臓、肺、腎臓、筋肉、その他16などの関連組織を収集します。
  7. 、組織を秤量8,9をカウントガンマによるその放射能含量を測定し、1g当たりの注射用量率（％ID / g）での割合などの組織の放射能蓄積を計算します。

3. エクスビボフローサイトメトリーおよび免疫染色

注：体重1kg当たり染料0.5mgの用量で尾静脈を介してメラノーママウスに蛍光リポソームの約100μLを注入。放射性サンプルは、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡で許可されていない場合は、非放射性リポソームを使用する必要があります。

  1. ステップ2.5のように、マウス24時間後に注射を生け贄に捧げる、冷PBS中に保存しなければならない腫瘍を収集します。
  2. フローサイトメトリーのために、手順17に従います。
    1. 0.5％BSA及び1で（PBSバッファーフローサイトメトリーで精製されたコラゲナーゼIおよびII（4 U / mL）を、ヒアルロニダーゼ（60 U / mL）をDNアーゼI（60 U / mL）を混合物からなる酵素カクテルを調製mMのEDTA）。
    2. 1.5 mLチューブに酵素カクテル緩衝液200μLと腫瘍組織100mgを混合し、細かいハサミで小片に組織をダイシング。酵素カクテルの別の1.3 mLのチューブに追加し、6ウェルプレートにその内容を転送します。
    3. 60 rpmで60分間、37℃のオーブンの内部に配置され、水平シェーカー上で6ウェルプレートを振ります。
    4. 単一細胞懸濁液を得るために、フローサイトメトリー緩衝液で3回組織ホモジネートを洗浄します。
    5. 、CD45、CD11bの、Ly6C、CD11cのを含むバイオマーカーに特異的な抗体のカクテルで細胞を染色CD64、CD3、MHCII、およびCD31（1：すべての抗体のための200希釈;クローン情報は、材料のスプレッドシートで提供されています）。関連する細胞の種類を識別し、（5）解析ソフトウェアサイトメトリーの適切な流れと各細胞集団に-dS DiIC12のそれらの平均蛍光強度（MFI）を決定します。
  3. 免疫染色のために、次の手順を実行します。
    1. 最適な切断媒体（OCT）を充填したカセットに腫瘍を置き、ドライアイス上で凍結します。
    2. 腫瘍組織から6μmの凍結切片を作成し、組織学的ガラススライド上に置きます。セクションでは、組織上の最も代表的な情報を提供する、腫瘍の最大の断面を、カバーする必要があります。
    3. バイオマーカーを染色（ 例えば、内皮細胞に対してCD31）は、対応する抗体（ 例えば、抗CD31、クローンMEC13.3）との利益。パラホルムアルデヒドを持つセクションを修正しました。二次抗体の種起源と一致する血清でそれらをブロックします。 incub4℃で12時間、一次抗体で食べた後、2時間、二次抗体と;そして最後に、PBSで洗浄し、カバースリップでカバーしています。画像ライカ直立共焦点SP5顕微鏡13、16で染色したスライド。

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結果

図1は、手順の概要を示しています。 図2は、ステップ1 10に記載の二重標識リポソームの模式的な合成手順を提示します。 図では 、ステップ2で説明したように3ディスプレイ代表PET-CT画像（ 図3a）、PET画像（ 図3b）、血中半減期（ 図3c）、および放射性ナノ粒子の生体内分布（ 図3d）からの放射能の定量化を、 図3aは 、リポソームは、高度に図3bの撮像結果の定量化によって確認される腫瘍に蓄積します。さらに、リポソームは、 図3cに約10時間の血中半減期を示します。 ex vivoでの生体内分布...

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ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ：

二重標識リポソームの高品質を長期間にわたって一貫性のある結果を生成するための鍵です。無料の蛍光色素または89のZrイオンは全く異なるターゲティングパターンを生成することができ、完全に精製工程の間に除去されなければなりません。免疫系が著しく実験的癌ナノメディシンの性能に影響を与える場合に加えて、免疫応答性マウスモデルを用いることが好ましいであるべきで、例えばこのプロトコルを通して使用されたC57BL / 6マウスにおけるB16-F10黒色腫モデルとして。腫瘍微小環境または遺伝的変異の特定の組み合わせが主な要因である場合には、患者由来の腫瘍異種移植片モデルは、理想的な選択肢であろう。

変更とトラブルシューティング：

私たちの手順は、担癌ANでnanomedicinesのin vivo性能を評価する簡単かつ信頼性の高い方法を提供しますimals。この手順は、異なるアプリケーションのためのがんnanomedicinesを...

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開示事項

著者らは開示すべきことはない。

謝辞

著者は、B16-F10-YFP細胞を提供し、メラノーママウスモデルに関する専門的なアドバイスを提供してくださったマウントサイナイ医科大学のHelene Salmon博士とMiriam Merad博士に感謝します。著者らはさらに、Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSK)のAnimal Imaging Core Facility、Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility、およびMolecular Cytology Core Facilityの支援に感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金であるNIH 1 R01 HL125703(W.J.M.M.)、R01CA155432(W.J.M.M.)、K25 EB016673(T.R.)、P30 CA008748(MSK Center Grant)の支援を受けました。また、著者らは、MSKのCenter for Molecular Imaging and Nanotechnology(CMINT)の財政的支援(T.R.)に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DPPCAvantilipids850355
CholesterolSigma-AldrichC8667
DSPE-PEG2000Avantilipids880120P
DSPE-DFOHome made110634Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DSAAT Bioquest22051
遠心フィルターVivaproductsVS2061
ロータリーエバポレーターBuchiR-100
Radio-HPLC島津製作所 HPLC LC-10ATポンプ2台付きN/A
89Zr-シュウ酸塩MSKCC自社製TR19/9 可変ビームサイクロトロン (Ebco Industries Inc.)
マイクロPET-CTシーメンInveon マイクロPET/CT
ガンマカウンターパーキンエルマー2470-0150
フローサイトメトリーBD バイオサイエンスフォーテッサ任意のマルチパラメトリックフローサイトメトリーアナライザーで十分です
C57BL/6 マウスジャクソン研究所
B16-YFP メラノーマ細胞自家製N/Aサーモン etal., Immunity, 2016
Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7128025Biolegend
MHCII (M5/114/152)--APC107613Biolegend
CD45 (30-F11)--BV510103137Biolegend
CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7139313Biolegend
CD11b (M1/70)--BV605101237Biolegend
CD3 (17A2)--BV711100241Biolegend
CD31 (13.3)--PE561073Biolegend
CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5117327BD Biosciences
CD31 (13.3) no fluorophore550274BD Biosciences
ス

参考文献

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PET CT 89 ex vivo

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