細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム結核菌

結核菌 、結核（TB）の原因物質は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因です。薬物感受性TBは、6ヶ月の期間にわたって複数の抗生物質を必要とする治療可能な疾患です。治療可能な疾患であるにもかかわらず、結核死亡率は、2015年¹における150万と推定されました。過去10年間で、薬剤耐性結核の有病率に対する懸念が高まっています。多剤耐性結核（MDR-TB）は、少なくともイソニアジド（INH）、及びリファンピシン（RMP）、最もMDR-TB株は、このように治療の選択肢を制限する、第二のラインTB薬を選択することも耐性があるに耐性のあるTBのように定義されます。薬剤耐性の効果は、患者のヒト免疫不全ウイルス（HIV）で同時感染を治療するために大きな課題を作成します。 40万患者は世界中で2015 ¹でHIV関連結核で死亡しました。残念なことに、米国食品医薬品Administ配給は、過去40年間²に、MDR-TB、bedaquilineに対する唯一の新しい結核治療薬を承認しました。より良いと短いTBの治療法を見つけるの進歩が緊急TBとMDR-TBとの戦いに先に滞在するために必要とされています。

伝統的に、TB薬物スクリーニングは、化合物が成長している培養物に添加し、微生物を根絶におけるそれらの有効性は、固体培地上のコロニー形成単位（CFU）をカウントすることによって決定されることにより、増殖培地中でインビトロ増殖条件下で行われます。 CFU数は労働集約的、時間がかかり、かつ高価であるように、様々な間接的な方法は、この問題を軽減するために開発されています。そのような方法は、アラマーブルー生存率アッセイ^3、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはルシフェラーゼを発現する細菌からの発光⁵からの蛍光⁴の決意、および全アデノシン三リン酸の推定（Aを含みます^{TP）6、7。}

典型的なTBは、細菌は肺胞マクロファージ⁸のファゴソーム内部に存在し、複製肺の結核菌の感染によって特徴付けられます。シンプルな中ブロス表現型の画面は、細胞外病原体に合うこと。しかし、歴史的な観点では、この方法を用いて同定された結核菌に対する化合物は、多くの場合、感染モデルにおける下流の検証ステップの間、期待に応えるに失敗ヒット。私たちは、結核治療薬は、最高の細胞内宿主細胞の感染モデルで実行されていることを提案します。それにも関わらず、細胞内のモデルは、ハイスループットスクリーニング（HTS）の開発に多くの技術および生物学的障壁を保有します。大きなハードルは多くの工程と洗浄の間で-による細胞外細菌の精巧な除去によって例示される、感染プロセスの複雑さです。第二の主要なハードルは、長い時間の再ですquirementsは、通常CFU培養プレート上でカウントすることによって行わ増殖検出として、完了するまでに3週間以上を要するプロセスです。 CFUカウントを交換する1つの解決策は、蛍光細菌との組み合わせで自動化された蛍光顕微鏡によって提供されています。しかし、この解決策は、多くの研究室のための手の届かないところにある初期の設備投資が必要となります。シンプル、低コスト、および疾患関連HTS方法を大幅に創薬プロセスを高めるであろう。

本研究では、細胞内の結核菌に対する化合物の活性を決定するのに適した、迅速、かつ拡張性の高い、まだ経済的、アッセイを提供することを目的とする新しい、モジュラーHTSシステムを報告しています。 （I）細胞内、（ii）の細胞毒性、および（iii）中のブロスアッセイ：このシステムは、三つのモジュールから構成されています。合わせた最終的な結果は、作用の潜在的なモードなどの追加情報と、化合物の特性の包括的な説明を提供します。このSCreeningシステムは、薬物相乗作用⁹の分析、オートファジー¹⁰の刺激、および結核菌 -secreted毒性因子（未発表）の阻害を含む作用機序を標的とする様々な化合物ライブラリー、といくつかのプロジェクトで使用されてきました。アクションの未知のモードの化合物はまた^、11を研究されています。この方法の修正版は、細胞内結核菌 ¹¹に対して新規な化合物を同定するための一次スクリーニング法としての産業パートナーによって採択されました。

1.菌株および増殖培地

1. ウシ血清アルブミン、デキストロース10.0gを、脱イオン水の460 mLの塩化ナトリウムの4.05グラムの25グラムを溶解することによってアルブミンデキストロースおよび塩のストック溶液（ADS）を作ります。 4℃でのADS及びストアをフィルター滅菌します。
2. 7H9粉末4.7gの精製水900 mLでのグリセロールの2ミリリットルを添加することにより、7H9ブロスを作ります。 10分間121℃で7H9ブロスをオートクレーブし、それが進行する前に、室温まで冷却することを可能にします。 ADS 100mLおよび7H9ブロス900mLのにTween80を0.5ミリリットルを添加することによって7H9ADSTを作ります。 4°Cで保存。
3. 硫酸カナマイシン50mgを秤量し、脱イオン水1mLに溶解します。最終濃度は50mg / mLです。フィルター滅菌し、-20℃で保存。 7H9ADSTの1リットル当たりのカナマイシンストック溶液0.5mlを加えます。
   注：この培地はとてもボリュームを拡張適切培養サイズに応じて、新鮮されるべきです。
4. 7Hに結核菌を育てます9ADSTは文化を立っ中でカナマイシンを補いました。毎日文化を振ると、OD600が凝集を避けるために、1.0に到達する前にそれを希釈します。
   注：この方法の開発のために使用されるヒト結核菌株は、菌H37Rv pJAK2.Aプラスミド¹²で形質転換しました。 pJAK2.Aは、HSP60プロモーターからホタルルシフェラーゼ遺伝子の高レベル発現を可能にし、カナマイシンを使用して選択することができるpMV361ベクターに基づく組込みプラスミドです。

2. THP-1培地とメンテナンス

1. （FBSおよび2mMグルタミン約10％）RPMI不完全培地を作製するために、熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）の50 mLおよびRPMI 1640を500mLの200mMのL-グルタミンを5mLを加えます。
2. 標準的プロトコール¹³に従ってTHP-1細胞の培養を維持します。 PASの間に0.2培地1mL当たり100万の細胞密度を維持しながら簡単に説明すると、RPMI不完全培地中のTHP-1細胞を増殖させます賢人。

ルシフェラーゼ発現ヒト結核菌H37Rvを用い3.ハイスループット細胞内スクリーニング

1. 波長600nmで分光光度計で活発に増殖する細菌懸濁液の光学密度を測定します。ミリリットル当たり0.1 OD ₆₀₀ = 3×10 ⁷細菌の換算係数を使用して、細菌密度を計算します。
2. 新しい遠心管に10：1の感染の多重度のために十分な細菌（MOI）を行うピペット。 10分間3,000×gでペレット化し、液体を吸引。 RPMI1640の450μLにヒト血清の50μLを追加します。実験の値を適切にするボリュームをスケール。
3. 細菌をオプソニン化するために、10％ヒト血清を含有するRPMI1640 500μLあたり1×10 ⁸の細菌の密度でペレットを再懸濁します。混合物を30分間37℃でインキュベートすることを可能にします。血球計および反転microscoで計数することによりTHP-1細胞の培養密度を決定PE。
4. 100×gでの滅菌遠心管中の細胞をペレット化し、10分間37°C。上清を吸引し、ミリリットル当たり100万個の細胞の密度で、不完全RPMI中に細胞を再懸濁。 40 / mlの最終濃度までホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA）を加えます。
   注：これは分化ミックスと呼ぶことにします。
5. オプソニン化結核菌は、10のMOIでのTHP-1分化混合物と結合：1、96ウェル平底白色プレートにウェル当たり100μLの最終ミックスのアリコート。定期的に均一性を確保するために、混合物を攪拌。分化および感染は5％CO _2を含む加湿インキュベーター中で37℃で一晩進行させます。
6. RPMI各100μLでウェルを2回洗浄します。不完全RPMI中で所望の濃度に希釈した化合物を添加し、3日間インキュベートします。
7. ウェルから培地を吸引除去します。各ウェルにルシフェラーゼアッセイ試薬の50μLを追加します。 Tでプレートをシールransparent接着プレートシーラー。 22℃でのインキュベーションの5分を許可した後、ウェルあたり1秒でルミノメーターで読み出しを得ます。

3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ^14を使用4.細胞毒性分析

1. 不完全な透明な96ウェルプレートにPMAの40 / mlのを補充したRPMI中でTHP-1細胞に分化します。ウェル当たりミリリットル当たり100万、アリコート100μLの細胞密度を維持します。分化は、5％のCO _2を含む加湿インキュベーター中で37℃で一晩進行させます。
2. ウェルに不完全なRPMIで希釈した化合物を加えるウェルから培地を吸引除去し、RPMI 1640で二回洗って。 3日間インキュベートします。
3. 5mg / mlのストック溶液を作製するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）100mLにMTT 0.5gを溶かします。離れた光から-20℃で滅菌フィルターとストア、。それは、このソリューションは、新鮮な作るのがベストです。
4. 2.5時間beforE 3日間の潜伏期間の終わりには、各ウェルにMTT溶液25μLを追加し、潜伏期間を完了します。
5. 50％のNを準備し、N個のジメチルホルムアミド（DMF）250mLの脱イオン水とDMFの250ミリリットルを混合することによって。
6. 次のようにMTT抽出緩衝液を調製：500mLの瓶にSDSを100gを秤量し、50％のDMF 300 mLを加え。 SDSを溶解させるために、低熱を適用します。純粋な酢酸10mlおよび1MのHCl 12.5 mLを加え。 50％のDMFと500mLのマークに埋めます。抽出緩衝液の最終組成は、50％DMF、20％SDS、2.5％酢酸、2.5％1 M塩酸です。
7. 処置期間の終わりに、各ウェルに（任意の結晶を溶解するために45℃に加温し）抽出緩衝液100μLを加えます。混合物を37で一晩インキュベートすることを許可します 5％CO ₂を含む加湿インキュベーター内℃です。 570 nmの吸光度を読みます。
   注：細胞毒性アッセイは、最良のセル内と並行して行われますウラル画面THP-1細胞の同じバッチと年齢を使用しました。

レサズリンアッセイ^3を使用して、ブロス活性分析5.

1. （ - 0.8 OD _600〜0.5）対数中期に7H9ADSTに結核菌を成長させます。 0.01 OD ₆₀₀に7H9ADSTと文化を希釈します。各ウェルに各希釈した化合物の試験濃度及びアリコート100μLを2倍する7H9ADSTで化合物を希釈します。
2. 各ウェルに希釈した細菌懸濁液100μLを移します。プレートを5日間、加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートすることを可能にします。脱イオン水および滅菌フィルタ100mLにレサズリン10mgを溶解します。
3. レサズリン溶液を30μLを加え、48時間後に色の変化を監視します。細菌増殖はピンクに青から色変換によって示されます。
   注：定量分析もまた530での励起と共に、590nmでの蛍光のいずれかを測定することによって行うことができる - 560nMもしくは570 nmの吸光度と600nmで^15。

ルシフェラーゼ遺伝子を発現結核菌を用いた高スループットの細胞内スクリーニング

図2Aと表1はルミノメーターによって収集された生データを含む、THP-1細胞内の結核菌に対するTB薬物リファンピシンの濃度の増加の効果を示し、相対発光単位（RLU）で表しました。 図2Aは、リファンピシンの様々な濃度のためRLUで測定された生の発光の散布図です。エラーバーは平均の標準誤差（SEM）を示します。 図2Bは 、未処理ウェルと比較して、処理したウェルにおける蛍光のパーセント減少を示します。データは、リファンピシンは0.1μgの/ mLの濃度で細胞内結核菌からのRLUの> 99.9％を低減することが可能であることを示しています。これはpreviouslに従ったものですyは0.1と0.4 / mlの16との間にMICを発表しました。各ウェルにおいて産生さ発光は、 結核菌によって発現される総ルシフェラーゼの指標であり、従って、ウェル内の結核菌の代謝状態の指標です。生の発光レベルは、実験の間で変動するのは正常です。そのため、生データの比較は、信頼性のない結論を生成します。したがって、データは、DMSOのみで処理した試料であろう定義された陰性対照に対して正規化されるべきです。結果の値は、ウェル中の結核菌の減少率（ 図2B）のように表すことができます。

MTTアッセイを用いて細胞毒性分析

MTTアッセイは、真核生物の細胞毒性のために十分に確立アッセイです。この比色アッセイは、MTT（黄色）の変換に至る生細胞を示します紫色のホルマザン。細菌は、化合物の観察された毒性を低減MTTを代謝することが可能であるので、このアッセイは、 結核菌感染なしで行われます。 MTTアッセイのための一般的な提案は、570 nmの17で吸収によるpH指示薬フェノールレッドを含まない培地を使用することです。しかし、この方法に記載酸性化抽出緩衝液は、フェノールレッド17による干渉を最小化することができます。

図3は、試験化合物符号化G1-1H濃度の増加によって引き起こされる細胞毒性を示します。通常、50％阻害濃度（IC 50）は、細胞毒性のレベルを示すために使用されます。 G1-1Hの場合には、10μM及び3μMの濃度は、IC 50濃度未満明らかです。

ではブロス活性分析たちレサズリンアッセイをINGの

レサズリンアッセイは、一般に、真核細胞における細胞毒性の分析のために使用されるが、また、培養液3で生菌を監視するために使用することができます。レサズリンアッセイは、MTTアッセイと同様の酸化還元に基づくアッセイです。それはレゾルフィン、赤の蛍光団にレサズリンの変換によりNADPHレベルとNADPHデヒドロゲナーゼ活性を測定します。薬の有効性を決定する最も簡単かつ最速の方法は、ウェルが青色で残る最低の処理濃度を探すことです。 図4は、抗生物質アプラマイシンの効果様々な濃度は、 結核菌によるレサズリン変換に与える示す96ウェルプレートの一部を示しています。インブロスMICは2.5および5μg/ mLの間であると決定されました。これは、1.5μgの/ mLの18の以前に公表された値よりも若干高いですが、それはうまくacceptab内にありますル範囲。多くの場合、色の変化はかなり緩やかなので、自信を持って決意をすることは困難です。これらの条件下では、吸光度または蛍光のいずれかを使用してレサズリン変換の実際の量を定量化することをお勧めします。レサズリン及びレゾルフィン、MIC決意吸光度を用いて同様の吸収特性に二つの異なる波長および複雑な計算15を用いた測定を必要とします。したがって、最善の方法は、製造業者の文献15に記載されているように、530- 560-nmの励起波長および590 nmの発光波長を用いて蛍光を測定することです。

図4は、大幅スクリーニング結果を変化させることができる複数日のインキュベーションに関連付けられた矛盾の潜在的な供給源を示します。これ実験に用い、37℃のインキュベーターの不適切な加湿、Pの縁上のウェルに latesは、かなり多くの蒸発を負いました。全15 DMSO処理したウェルは、同一であることが想定されるが、左と上縁に沿ってウェルをボリュームを減少させました。これらのウェルは、プレートの中央に他のDMSOで処理したウェルとは異なる色を有するように見えます。同じ矛盾はまた、2.5 / mlのアプラマイシンで処理したウェルで観察することができます。この場合には、減少量はまた、分光光度計および蛍光光度計により定量的読み取りをもたらします。ケアは、矛盾のこのソースを回避するために、十分に加湿インキュベーターを維持するために取られなければならないので、蒸発は、長時間のインキュベーション時間を持つすべての実験のために重要になります。

図1： メソッドの回路図。ハイスループットスクリーニングシステムの3つの別々のモジュールのためのアッセイの概略図を示す図。 _upload / 55273 / 55273fig1large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：細胞内からの代表的なデータは、THP-1細胞内結核菌の排除におけるリファンピシンの効果を調べました。各処理（リファンピシン）濃度についての（相対的発光単位）読み出し平均発光の（A）のグラフ。エラーバーは、各三連の平均の標準誤差を示します。 （B）より高い値はより大きな有効性を示してリファンピシンの処理による発光で計算されたパーセント減少のグラフ。この場合の90％阻害濃度（IC 90）は、どこ0.01及び0.1 / mlの間です。NK ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3： 細胞毒性（MTT）アッセイからの代表的なデータは、分化したTHP-1細胞に対する化合物G1-1Hの毒性効果を検討します。より高い値は、健康THP-1細胞を示す治療化合物G1-1H、各濃度についての値を算出した「対照のパーセント」のグラフ。この場合のIC 50は、どこかに10〜30μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4： レサズリンアッセイからの代表的なデータは、Eを検査しますインブロス 結核菌を阻害することアプラマイシンffectiveness。唯一の定性的データが起因バイオセーフティーレベル3（BSL3）ラボにおける機器の制限により、この場合に収集されます。写真はDMSO又はアプラマイシン様々な量のいずれかで処理した結核菌を含有する96ウェルプレートの一部を示しています。ピンクの青から色変換によって示されるようにDMSOで処理したウェルは、レゾルフィンするレサズリンの変換を示しました。アプラマイシンで処理したサンプルは、明らかに5μg/ mlの以下の色変換を行いました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1： リファンピシンの 細胞内のIC 90 の決意のためにルシフェラーゼアッセイからの生データ 。

表2：Differeにおける細胞毒性試験の化合物G1-1Hの決意するためのMTTアッセイからの生データNT濃度。

著者らは、この研究に対して競合する金銭的利益がないことを宣言しています。