方法論記事

乾燥風-LCインターフェイス上Megamolecular生体高分子の自己統合するための方法

DOI：

10.3791/55274

⸱

2017年4月7日

 ,  ,  , 
1Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2Department of Bioengineering, School of Engineering, The University of Tokyo

この記事について

サマリー

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空気 - 液体結晶界面にmegamolecular生体高分子の乾燥誘導性の自己集積化するための方法がここに提供されます。この方法は、生体高分子の巨視的ポテンシャルを理解するために、だけでなく、生物医学や環境分野でのソフト材料の評価方法としてだけでなく、有用であろう。

要約

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水を使用する生物は常に環境に乾燥する傾向があります。皮膚層における維管束と保湿水で水を動かすの例に見られるように、彼らの活動は、生体高分子ベースのマイクロおよびマクロ構造によって駆動されます。本研究では、乾燥にバイオポリマーからなる水性の液晶（LC）溶液の効果を評価するための方法を開発しました。 LCの生体高分子がmegamolecular重みを持っているように、我々は多糖類、細胞骨格タンパク質、およびDNAを研究することにしました。偏光下で乾燥中に生体高分子溶液の観察は、不安定な空気-LCインターフェースから出発milliscale自己集積化を明らかにする。水性LCバイオポリマー溶液のダイナミクスは、片側開放セルから水を蒸発させることによってモニターすることができます。交差偏光を用いて撮影した画像を解析することにより、 配向秩序度における時空間変化を認識することができます。このこの方法は、様々な分野でなく、自然の生きた組織における人工材料ではないだけの特徴付けのために役立つことができます。私たちは、それが生物医学や環境分野での柔らかい素材のための評価方法を提供することを考えています。

概要

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生体高分子の剛直棒状構造に着目して、ダイナミックソフト材料は多糖バイオフィルムマトリックス1、細胞骨格タンパク質2からなる「活性ゲル」、および所望の形状3の「DNA折り紙」など、様々な用途に使用されてきました。構造特性を明確にするために、多くの戦略は、透過型電子顕微鏡、走査電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡として、検討されてきました。これらの方法は主に乾燥または静止状態で行われるため、実際の生体系で見られるようにしかし、巨視的スケールにおける動的挙動を説明することは困難です。最近、我々は正常偏光4を介して水性空気-LCインタフェース上の生体高分子の動的挙動を観察しました。配向構造の可視化の間、バイオポリマーを乾燥させながら溶液、経時変化が不安定エア-LCインタフェース上の生体高分子の自己集積化を示しました。

ここでは、偏光機器を用いて空気-LC界面におけるLC生体高分子溶液の乾燥のためのプロトコルを記載します。 5乾燥考慮していないLC相、6の他の分析とは対照的に、乾燥工程中LCダイナミクスは片側開放セルにおける流体相の側面図で配向秩序度を評価することによってここに検討しました。セル蒸発及び制御蒸着方向と巨視的な監視のために許可される偏器具の使用の組み合わせ。また、それは方法の有効性を実証するために、分子量、濃度、 等の影響を受けた吸着ミクロドメインの結晶構造に着目し、乾燥レコードを検証することが可能であった、乾燥プロこのような多糖類、微小管（MTS）、およびDNAなどの剛性ロッド形状の基本的な生体高分子のcessesは、調査しました。彼らはmegamolecular重みを持つ階層的な高分子の代表的な例であり、その分子間相互作用がLC状態を形成することを可能にするので、私たちは、これらの生体高分子を選びました。

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プロトコル

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1.楽器

  1. 偏光素子
    1. 偏光素子を構成するために、（偏光については、図1Cおよび物質一覧を参照して、ハロゲンランプ、ライトガイド、偏光子、試料ステージ、光学レール、ロッドスタンド、およびデジタル一眼レフカメラで光源を提供デバイスパーツ）。

バイオポリマーソリューションの調製

  1. 多糖類ソリューション
    1. 以上12時間〜80℃で攪拌することにより純水（100 mL）中のsacran 7（0.5 g）を溶解します。解散時には、蒸発を防ぐためにラップでコンテナをカバーしています。同様にキサンタンガムの水溶液を調製します。
    2. 0.5重量％の水溶液を得るため〜25℃で溶液を冷却します。
    3. 不純物（48400×gで、4℃、1時間、3ティムを除去するsacran溶液を遠心分離ES）。
  2. MTソリューション
    1. ブリトン-ロビンソン緩衝液中0.5重量％のチューブリン溶液（1 ml）を調製し（80mMのは、N、N ' -ビス（2-エタンスルホン酸）（PIPES）をピペラジン; 1mMのエチレングリコール-ビス（βアミノエチルエーテル） - N、N、N 'N' -四酢酸（EGTA）、氷8上及び5mMのMgCl 2、pHは6.8）。
    2. 0.5重量％のチューブリン溶液（50μL）とを使用グアノシン5' - [（α、β）-methyleno]三リン酸（GpCpp）（5μL）をGpCpp含有チューブリン溶液（50μL）を調製しました。安定したMTの核を得るために3時間37℃でインキュベートします。
      注：GpCppの役割はMTの形成を支援するために、完全にチューブリンにMTの解重合を抑制することです。
    3. 安定した0.5重量％のMTの溶液を得るために1日〜25℃で0.5重量％のチューブリン溶液（950μL）とGpCpp含有チューブリン溶液（50μL）を混合します。
  3. DNA溶液
    1. Tris-EDTA緩衝液（1mMのEDTAを含む10 mMトリス、pHが8.0）に0.5重量％のDNA溶液（1 ml）を調製します。
  4. 乾燥実験のために25℃で0.5重量％のバイオポリマーサンプル溶液を保ちます。

クロス偏光下で3乾燥実験と観察

  1. 片側開放セル中の溶液（図1A）
    1. シリコンシートを切断し、厚さ1mmの適切な形状に（材料リストを参照）（5〜15ミリメートル、1mmの内径、及び〜20ミリメートル; 図1A）。
      1. 5〜15ミリメートル、1ミリメートル、および〜20ミリメートルと二つの非修飾ガラススライド（26ミリメートル×76ミリメートル×1ミリメートル）の内径を有するシリコンスペーサからなる片側開放セルを組み立てます。漏出から試料溶液を保持するために、事前に二重クリップ付きセルの両側を固定します。
    2. ゆっくり〜1mmの細孔サイズのピペットを使用して、0.5重量％のバイオポリマー溶液（100〜300μL）のそれぞれを追加〜25°Cでの各セルに先端のテ。注射針を用いて細胞から気泡を除去。
    3. 蒸発のために、大気圧下、60℃で空気循環オーブンでの細胞を置きます。蒸発方向が重力と反対です。
  2. 交差偏光下での観察（図1B-1C）
    1. 広域（80ミリメートル×80 mm）の上に平坦面光源100 Wハロゲンランプを介して直線可視光を提供します。ホルダ（ 図1C）を用いて45°および135°の偏光子を調整します。
    2. 光学レールやロッドスタンド（ 図1C）を用いた光源、偏光子、試料ステージ、カメラの位置を固定します。二つの偏光子（偏光子との間の距離は約5 cmであるべきである）との間に試料ステージを配置します。集中できるように、試料ステージから〜20センチメートルカメラを置きます。
    3. 与えられた時間では、ポーラの間にステップ3.1.3からサンプルを置きますrizers XZ平面にステージと平行に及び黒色のカーテンでデバイスを覆います。実際の装置は、 図1Cに示されています。
    4. 標準ズームレンズをデジタル一眼レフカメラを使用して、線形直交偏光子を介してサンプルを撮影（材料リストを参照）。コンピュータソフトウェア（物質一覧を参照）を使用して、例えば、焦点距離などのカメラの設定を制御します。
  3. 透過光強度の時空間分析（図1C）
    1. 乾燥工程における配向秩序度の変化を評価するために、24時間毎時写真を集めます。
    2. （ 例えば、ImageJの）画像処理プログラムを用いて、グレー値としてZ方向の中心線に沿って透過光強度を測定します。
    3. 上部開放側からの距離の関数としてグレー値のグラフをプロットします。
  4. 交差偏ガーゼの下で顕微鏡観察T（図1D）
    1. 方法を確認するために、CCDカメラ9を備えた偏光顕微鏡による顕微鏡観察を行います。光路に一次位相差板を保ちます。 PCソフトウェアを使用して写真のための条件を制御します。

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結果

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図1に示すように、乾燥空気-LCインターフェース上macrodomainするために、ミクロドメインからの自己統合のデバイスを使用すること（ 図2A）を評価しました。乾燥実験の最初の実証、megamolecular多糖類、sacran（M W = 1.9×10 7グラムモル-1）およびキサンタンガム（4.7×10 6グラムモル-1）の二種類として、比較しました。 図2Bは、交差偏光下での細胞中の溶液の写真を示します。乾燥前に、両方の溶液に散乱状態で透過光を有するいくつかの明るい領域を観察することが可能でした。 6時間60℃で乾燥した後、sacran溶液中の空気-LC界面の下の領域が大幅に高くなりました。これは、ドメインがゲル収縮プロセスにスキン層形成と同様のインタフェースで巨視的に配向構造を形成することを意味します"外部参照"> 10。温度...

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ディスカッション

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カメラは透過光強度が低すぎることに起因する試料に焦点を合わせることが困難な場合がありました。このような場合には、ステージ上の拡張透明プラスチックフィルムを配置するフォーカスを配置するのに役立ちました。観察可能な解像度の限界は、この場合〜10μmのカメラレンズに依存していました。サンプルの厚さの観察制限、ΔYは、この場合〜10ミリメートルランプの最大光強度に依存していました。

図1Bに示された装置の利点は、試料の側面図の写真は、乾燥プロセス中に取り込まれることを可能にすることです。観察は、一般的な顕微鏡で使用される水平面に依存することなく行うことができます。乾燥実験中片側開放セルを放置し、蒸発方向が調節され、重力の反対方向です。側面図を監視することも、乾燥ラットの計算を可能にしますE 4。

将来的には、装置の試料ステージに温度と湿度レギュレータを配置することにより、自動的に配向秩序度の時間的変化を監視することが可能となります。さらに、重量変化を監...

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開示事項

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著者は、開示することは何もありません。

謝辞

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この作品は、費補助金教育省、文化、スポーツ、日本の科学技術、京都Technoscienceセンター、研究開発のための三谷財団からの若手研究（16K17956）用によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
sacranGreen Science Materials Inc., JapanFrom Aphanothece sacrum.
Mw = 1.9 × 107 g mol-1
>xanthan gumTaiyo化学株式会社, 日本Neosoft XCXanthomonas campestris.
Mw = 4.7 × 106 g mol-1
>tubulinCytoskeleton, Inc., USAT240ブタの脳から。
GpCppイエナバイオサイエンス、ドイツNU405L
ピペラジン-N、N′-ビス(2-エタンスルホン酸)Sigma-Aldrichi, Co. LLC.P6757-500Gパイプ
エチレングリコール-ビス(&β;-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸同人堂モレキュラーテクノロジーズ株式会社342-01314EGTA
MgCl2-6H2O和光純薬工業(株)〒135-15055
和光純薬工業株式会社162-21813ペレット
DNAシグマアルドリッチ、Co. LLC。D1626サケ精巣から.
Mw = 1.3 × 106 Da (~2,000 bp)
Tris-EDTA緩衝液Sigma-Aldrich, Co. LLC.T9285-100ML10 mM Tris, pH 8.0, with 1 mM EDTA
スライドガラス松波硝子工業S1111
シリコンゴムシートアソネ株式会社6-611-32厚さ:1mm
遠心分離機ベックマン・コールター社製 米国アバンティJ-25JA-20ローター
光源住田光学硝子社LS-LHA
光ガイド住田光学硝子社GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)80mm 80mm ハ
ロゲンランプウシオ電機社JCR 15V150WBN
ホルダーシグマコーキ(株)KMH-80
サンプルステージシグマコキ(株)TARW-25503L
サンプルホルダーシグマコキ(株)SHA-25RO
ロッドグマコキ(株)ROU-12-40
ポストホルダーシグマコーキ(株)RS-6-40
ポストホルダーシグマコーキ(株)RS-12-60
ポストホルダーシグマコーキRS-12-80
ポストホルダーシグマコーキ株式会社RS-12-130
キャリアシグマコキ(株)CAA-25LS
カメラホルダーシグマコキ(株)CMH-2
中型光学レールシグマコキ(株)OBA-500SH
レンズチューブトミーテック、BORGレンズチューブ BK80φ, L25 mm 
レンズチューブTomytech, BORGlenstube BK80φ, L50 mm 
マルチバンドTomytech、BORG80φ 
Vプレートトミーテック、BORGVプレート 60S
プレートホルダーViexen, Co.,Ltd.プレートホルダー SX
EOS Kiss X7i キヤノン株式会社8594B001標準ズームレンズ付き EFP 18-55 mm
写真ソフトキヤノンEOS ユーティリティ
PCマイクロソフト表面
偏光顕微鏡オリンパスBX51
一次位相差板オリンパスU-TP530&λ; = 530nm
CCD カメラオリンパスDP80
写真ソフトオリンパスのcellSens標準
Javaベースの画像処理プログラム、国立衛生研究所ImageJ
株式会社 搭載 シ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
  2. Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
  3. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  4. Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
  5. De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
  6. De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
  7. Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
  8. Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
  9. Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
  10. Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
  11. Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
  12. Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).

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