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方法論記事

測定とマレの変更交尾ドライブ

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DOI:

10.3791/55291

⸱

2017年2月15日

 ,  ,  , 
1F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, 2Harvard NeuroDiscovery Center, Harvard Medical School, 3Department of Neurobiology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、モチベーションを研究するために、ショウジョウバエの melanogaste rの雄交尾ドライブを使用する行動アッセイを記載します。この方法を使用して、研究者は、この動機の根底にある、分子遺伝学、および細胞メカニズムを解明するために、高度なフライ神経遺伝技術を利用することができます。

要約

調査の何十年にもかかわらず、動機づけの状態の神経細胞および分子の塩基は、神秘的なままです。我々は最近、小説、還元主義、および男性キイロショウジョウバエ （ショウジョウバエ）、ここでは詳細をWEするための方法の交配ドライブを使用して動機の徹底的な調査のためのスケーラブルなシステムを開発しました。男性の交尾ドライブが繰り返さcopulationsの過程で生殖能力と一緒に減少し、〜3日間にわたって回復所見上の行動パラダイムセンター。このシステムでは、ハエで利用可能な強力な神経遺伝ツールは、遺伝的アクセシビリティと性的行動のために利用可能な推定上の配線図で収束します。この収束は、特定の動機づけの機能を持つ小型のニューロン集団の迅速な単離および尋問を可能にします。ここでは詳細男性のハエで求愛のモチベーションを測定し、変更するために使用される満腹アッセイの設計と実行を。これを使用して、アッセイは、我々は、低雄嵌合ドライブがドーパミン作動性ニューロンを刺激することによって克服することができることを示しています。満腹アッセイは、単純な手頃な価格、および遺伝的背景の影響に対してロバストです。私たちは、満腹アッセイは動機づけの状態の神経生物学に多くの新たな洞察を生成するために期待しています。

概要

ショウジョウバエでの作業は、遺伝子1の性質を含め、多くの生物学的現象に深く、先駆的な洞察を提供している、胚発生2、概日リズム3、および神経系4、5、6の開発や配線の原則。動機は、おそらくため、これまで検討されているシステム上の制限により、これまであまりよく理解これらの現象よりも残っています。ハエにおける動機は主に脂肪沈着の明白な徴候を排除送り試合と外骨格あたりの無視できるほど小さい食物摂取に起因する多くの課題を提示し、飢餓、との関連で検討されています。したがって、ハエにモチベーションを研究するために使用されるシステムを拡張する必要があります。

我々は内交配ドライブの研究のための行動の枠組みを説明しますショウジョウバエ 。このシステムは、フライに神経遺伝ツールを利用するだけでなく、アクセシビリティ7、8、9、10、11、12、その性的二形回路8,13の推定コネクトーム。また、生来の14、15、16、17、18、19、20、21の多く及び22を学習し、23において、24感覚運動回路制御求愛は、貴重な機会を提供し、具体的に働いています動機が衝突する時に正確な回路ノードを検索します。我々は最近、フライに、人間のように、ドーパミンレベルが交配ドライブ25、26、27の中心である、と報告しました。私たちはここに25を説明するアッセイを使用して、この保存された現象の解析関連ドーパミン産生やフライにニューロンを受け、容易に詳細なmolecular-と回路レベルへの遺伝的アクセスを得ています。

私たちは、Zhang らで行動アッセイに追加します。 25我々は2次元（2-D）満腹アッセイを呼び出すビデオ得点、以前の方法に比べて重要な改善を可能にする新しいフラット行動アリーナ。その結果、新しいアッセイは、よりスケーラブルかつ定量化できる、とモチベーションに関与する遺伝子と神経細胞の遺伝子スクリーニングのために、したがって、より適しています。私たちは求愛のアッセイおよびneurogeと一緒に、この新しいアッセイを使用します磁操作は、測定し、ハエにおける交配ドライブを変更する方法を実証します。

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プロトコル

注：このプロトコルは、準備（セクション1から3）について説明し、2-Dの満腹アッセイの実行（第4節）、および分析（第4節）。次に、例として、ドーパミン作動性刺激を使用して、第5節では異常性欲を誘導するために2次元満腹アッセイと熱発生を起こす刺激を結合する方法を示しています。第6節では、2-Dの満腹アッセイの結果を検証する3つの方法について説明します。最後に、7節は、男性のハエで交配ドライブの回復を測定する方法を示しています。

1. 8ビットおよび32室行動アレナスを製作

注：各行動アリーナは、四隅（ 図1A）のそれぞれで六角ネジと親指ナットによって一緒に保持されたレーザーカットプラスチックシートのいくつかの層で構成されています。

  1. アリーナの層を作ります。適切な形状のアクリルプラスチックのシートを切断するためにレーザーカッターを使用して、各層を作製（ 図1B、製品の1Cを参照）。
    注：多くの研究institutionsのは、自分のマシンショップ、メーカーのスペースでレーザーカッターを持っています。機関はレーザーカッターへのアクセス権を持っている場合は、次の手順に進みます。そうでない場合には、代わりにステップ1.2の指示に従ってください。
    1. 各層について、レーザーカッターのソフトウェアのデザインパターンを開きます。
      注：デザインは適切な名前のPDFファイルで見つけることができる（ 例えば 、8-商工会議所アリーナ-レイヤ2 - Doors.pdf）補足資料1.このファイルにも使用されるプラスチックの種類のための注釈が含まれている（ 例えば 、1 / 8インチ（ すなわち 3.175ミリメートル）透明アクリル）。それぞれの層の正確な厚さは重要ではありません。主な要件は、0.12インチ（3ミリメートル）又はチャンバ内の空き垂直方向のスペースの多くを可能にすることです。
    2. 型とプラスチックの厚さのためにレーザーの設定（パワー、焦点、 等）を調整することに使用されます。レーザーカッターのベッドにプラスチックを配置し、レーザーカッターを実行します。
      注：これらの設定は、レーザーcutteに基づいて広く異なりますRモデルとそのレーザーの強さ。過去の経験やスクラッププラスチックのテストカットを行うことで、ベースの適切な設定を見つけます。深い六角形の彫刻は、六角ネジ頭を凹まするために、設計に含まれています。この機能は、親指ナットの片手締め付けを可能にし、アリーナは（ネジ頭を突出せず）ベンチの上に平らに休ませることができます。それにもかかわらず、深い彫刻を行うことは、しばしば達成するのが困難、かつ時間のかかる、レーザーカッターを使用しています。このステップはオプションであり、行動の結果に影響を与えずにスキップすることができます。
    3. ドアフレーム（レイヤ2、 図1A）を切断する際、また、チャンバ番号を彫刻するための適切なレーザー設定を使用した（ 図1B、1Cのように）設計に含まれます。
  2. オンラインレーザー切断加工業者との順序を置きます。 8ビットおよび/または32室の舞台のためにすべてのPDFデザインファイルをアップロードし、材料の種類（ 例えば 、1/8インチ（ すなわち 3.175ミリメートル）CLEAを指定しますファイル内の注釈に基づいて、Rアクリル）。結果を図1B（8室アリーナ）及び1C（32室アリーナ）のように表示されます。
  3. プラスチック層（ 図1A）を合わせ、一緒に保持するために4本の六角ネジと4親指ナットを使用してアリーナを組み立てます。アリーナは、 図1D、1E（8室）及び図1F、1G（32室）のように表示されます。
    注：（ 図1（a）のレイヤ4）食品の壁は、2-Dの満腹アッセイに使用され、求愛アッセイにおいて使用されている32室アリーナ、省略しています。

2-D満腹アッセイ2.食品の準備

注：2-Dの満腹アッセイは4.5時間に及ぶので、食品は栄養及び水を提供する分野で使用されて飛びます。このプロトコルは使用していますが、従来のコーンミール寒天フライ食品に限定されるものではありません。

  1. 6 - 部分的にレイヤ3と2次元満腹アリーナ（8室）を構築（層の割り当てについては、 図1A参照）と親指ナットと六角ネジで締めます。
  2. クリーン、電子レンジでボトルに新鮮なフライ食品を置きます。ボトル（ 図2A）の底面をカバーするだけの十分な水を追加します。
  3. 45秒 - 30のための高い上の電子レンジフード。進捗状況を確認し、（ 図2B）溶融するまで15秒毎にかき混ぜます。 注意！フライ食品は簡単にオーバー沸騰します。
  4. ゆっくり〜1 mLを転送するために鈍化1,000μLピペットチップ（ 図2C）を使用し 、各チャンバー（ 図2D）に食べ物を溶融しました。
  5. 食べ物は完全にアリーナ（ 図2F）を組み立てる前に10分（ 図2E）〜4℃で再凝固することを可能にします。
  6. 4℃で完了した実験の場（セクション4を参照）またはストアを使用してください。
  7. 4°Cおよび再利用で残飯を保管してください。

3.行動アッセイのための処女雌の準備

注： - 標準的な方法を用いて収集することは困難である（完全な行動アリーナのために160〜120）2-D満腹アッセイは処女雌ハエを大量に使用しています。このセクションでは、求愛のアッセイ25、29で正常に使用されているY染色体28、上のHS-HID導入遺伝子を用いて、別のアプローチを説明しています。 + / +; + / +（ブルーミントンストック番号24638）白い目処女雌を生成するために使用される株式は、遺伝子型w1118（X）/ HS-HID（Y）を有しています。

  1. 新しいボトルにハエをフリップ回20 -蛹の50％がeclosedている（例えば図3A参照）、十分な男性がある-株式を伝播する（5 10）。
  2. 1時間十分に男性（ 図3B）を殺すために、HS-HIDを活性化するために37℃の温水浴中で熱ショックオリジナルボトルを。ヒートショックの後、唯一の女性がこれらのボトルから孵化するだろうし、そうするまで処女のままになりますアッセイ。
    注：（水ライン用の図3Aを参照）ボトルのすべての側面を均等に加熱されていることを確認します。 1時間は、すべての男性を安楽死させるのに十分でない場合は最大2時間、この時間を延長します。
  3. 彼らは、29 25性的に受容するのに十分に古いであることを確認するための実験前に少なくとも3日間収集した雌を分離します。
    注：Y染色体レス男性は時折、この在庫から生じます。これらの男性は白い目をしていると、彼らはHS-HID導入遺伝子が含まれていないため、熱ショックの影響を受けません。彼らは精子を生成することはできませんので、メス30、31に受容性を低下させることはできません。

4. 2-D満腹アッセイを実施し、採点

注：それは年齢とともに交配ドライブの変更として男性のハエの年齢を制御することが重要です。 4日齢25 -このプロトコルは、3ある男性を使用しています。

  1. 湿度（> 30％）（標準、RT実験のために、例えば 、23°C）所望の温度にインキュベーターを設定します。インキュベーターで一杯の水を残して湿度制御なしインキュベーター、で十分です。
  2. 温度を平衡化するために、実験の過程で室内の結露を防止するために〜30分間インキュベーターで2-D満腹アッセイアリーナを置きます。回転ドアが開いた位置にあるべきです。
  3. アリーナ（ 図4）の各チャンバーに20処女雌- 15を吸引するためにフライアスピレーター32を使用してください。
    注：これは、女性と男性が検定と同じ日に麻酔されていないことが重要です。我々の経験では、そうすることは女性の受容性と男性の交尾行動に影響を与える可能性があります。
  4. 各チャンバ内に吸引し1男性。
  5. 4.5時間のための標準的な消費者のビデオカメラ（ 図5）と、膜の下インキュベーターでロードされた舞台を置きます。
  6. 各男性が開始さを飛ぶし、各交配（ すなわち交尾）を終了したときに注目することにより、ビデオをスコア。この工程は、第1の時間がかかるかもしれません。練習で、1は、5倍以上の速度で動画を得点することができます。
    注：ハエは〜23℃（高温で短い期間）29時〜20分間交尾ので、1は各交配の最初の15分で流し読みすることができます。
  7. すべての交配回ログインした後、各ハエのための交配の数を合計（代表結果を参照してください）。
  8. エソグラムを生成するために提供されたコードを使用してください。コード、命令、およびサンプルデータのための補足資料2を参照してください。
  9. それらを削除する前に、ハエを麻酔するためにCO 2や低温を使用してください。

5. 2-D満腹アッセイで満腹感を逆に熱を生じる操作を使用しました

注：定義されたニューロン集団の熱発生を起こす刺激が満腹感を克服することができるかどうかをこのプロトコルをテストします。実験FLIエスニューロン（UAS-TRPA1）の定義された集団における感熱性陽イオンチャネルTRPA1を発現します。以下の手順は、交配ドライブ25を促進することが示されているドーパミン作動性ニューロン（TH-GAL4）、の刺激に適用されます。これらのステップは、相手ドライブを促進する他の集団を検出する他の神経ドライバーと共に使用することができます。

  1. thermogeneticallyインキュベーターで温度を上げる、飽き飽きしハエに交配行動を誘導するために（ 例えば 、23℃から28.5℃）、フル4.5時間2次元満腹実験を完了した後。
  2. インキュベーターが所望の温度に達した後、熱刺激を継続し、1時間（代表的な結果を参照）交配（ すなわち 。copulations）は、男性のスコア。
    注：まだrobuを生産しながら、ニューロンの過剰刺激を防ぐ最適な条件をトラブルシューティングする必要があるので、刺激の温度と長さは、遺伝子型によって異なる場合があります目の表現型。

6.満腹感を確認するために求愛し、歩行を使用しました

注：このセクションでは、2-Dの満腹アッセイの結果を検証するために使用することができる3任意の方法を記載します。これらは、すべてのアッセイに必要とされません。

  1. 満腹感を確認するために、求愛のアッセイを使用してください。
    1. 吸引し求愛の分野で32室のそれぞれに1人の男性と1処女雌。
    2. 標準的な消費者のビデオカメラを使用して、20分〜のためにハエを撮影。
    3. 求愛25を定量化するために求愛指数（CI）をスコア。これは求愛行動を行う過ごした（ など 、以下、歌う。）時間と5分ウィンドウにわたって（ すなわち交尾）を交配の割合です。このウィンドウには求愛行動の最初のインスタンスから始まります。男性のハエは、最初の15分で求愛を開始しない場合は、そのCIが完全に飽き飽きしフライはCI bを持つべきであるのに対し、0ナイーブWTのハエは、0.9より大きいCIを示すべきです0.2をELOW。他の求愛措置も33、23と考えることができます。
  2. 2次元満腹アッセイで採点求愛
    1. 雄ハエは、2-Dの満腹アッセイ（ 例えば 、第1 の時間）の期間にわたって、求愛費やす時間の量をスコア。求愛は（ など 、以下、歌う）儀式のいずれかの手順を実行し、男性として定義されています。 6.1.3項とは異なり、このステップは、男性が交尾を費やしている時間は含まれません。
    2. 男性は、同じ期間に（ すなわち交尾ない）交配されなかった合計時間によって上記の求愛時間を分割します。 （ - 20分60分）= 0.375、男性は最初時間かけて20分間、15分間、裁判所や仲間を飛ぶ場合たとえば、比率は15分/です。比率は、代表的な結果に「求愛の時間をnonmatingのフラクション」として示されています。
  3. 疲労を評価するための移動アッセイを使用して
    1. 部分的に組み立て32すべての部品が、コントラストシートと室内アリーナ。
    2. 求愛の分野で32室のそれぞれに吸引し男性1フライ（なし女性ハエ）。
    3. 標準的な消費者のビデオカメラを使用して、〜10分間のハエを撮影。
    4. ImageJの中MTrack2プラグイン（http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html）でハエを追跡。

2-D満腹アッセイ後に交尾ドライブの回復7.

  1. 第4章で説明したように2次元満腹アッセイを実行したが、男性は、アッセイの終了時に飛び出す吸引除去します。
  2. 日の所望の数のために23℃で男性のハエを分離します。
  3. 回収された雄と2次元満腹アッセイを行い、わずか1時間（代表的な結果を参照のこと）のために彼らの交配（ すなわち copulations）をスコア。

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結果

ショウジョウバエ嵌合ドライブを特徴づけるために、3日齢、WTカントン-S男性は、2-Dの満腹アッセイで試験しました。アッセイ（4.5時間）の間に、男性が4.8±0.3の平均を交尾回数（平均値、SEMの±標準誤差を意味します）。交配は、最初の2時間（78％）（ 図6A、6B）で、主に開始し、アッセイは（ 図6A、6B）を進むにつれて少なく頻繁になります。この減少は、交配相手の欠如（74％の女性はアッセイを通して嵌合解除のまま）、または物理的な疲労（ 図6F）によるものではありません。むしろ、この効果は、おそらく2.0±0.7％と42.6±8.0％（平均±SEM）（1 回目の時間）から、アッセイ中のオスの求愛の減少によって説明される（平均±SEM）nonmating時間の（最後の時間） （ 図6C）。求愛のこの減少も見られる男性が新たな雌と求愛のアッセイで試験されている場合（ 図6D、...

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ディスカッション

動機づけ状態は、飽き飽きし維持、及び34を回収することができます。我々は、迅速かつ堅牢フライに交配ドライブのこれらの側面のすべてを測定する2次元満腹アッセイを提示します。このアッセイは、動機付け行動の分子や回路部品を研究するために、高度なハエの遺伝子操作を使用しての可能性を開きます。

満腹アッセイが正常に裁判所や交尾するオスの能力に依存しており、適切な時期にcopulationsを終了します。以下hyposexualハエの裁判所が、低求愛ハエは必ずしもhyposexualではありません。それらは、例えば、故障認識または女性35の追跡を有していてもよいです。ナイーブ野生型の男性は満腹アッセイSH 1.異常性欲に近づいて求愛指数を示すので、このような理由から、満腹アッセイは、確実に、標準的な求愛のアッセイで観察することができない表現型を異常性欲をテストするために最適です男性での経験の年齢を基準に考えることがウルド、古い男性はもう少し頻繁にここで使用される3日齢の雄より交尾する傾向があります。...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、原稿に対するコメントに対してMike Crickmore、Dragana Rogulja、Michelle Frankに感謝します。Pavel Gorelik は、行動アリーナの製造に技術サポートを提供しました。この研究はMike Crickmoreの研究室で行われ、Whitehall Foundation(主任研究者:Dragana Rogulja)の支援も受けています。S.X.Z.は、ハーバード大学医学部のスチュアートH.Q.およびビクトリア・クアン・フェローです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1/16インチ透明アクリルMcMaster-Carr8589K12を作るために使用されます;デザインについては補足資料1を参照してください。
1/8インチ透明アクリルMcMaster-Carr8589K42を作るために使用されます;デザインについては補足資料1を参照してください。
3/16インチ透明アクリルMcMaster-Carr8560K219を作るために使用;デザインのための補足材料1を参照して下さい。
1/32インチ ブラック デルリンマクマスター・カー8575K132アリーナの製作に使用。デザインについては補足資料1を参照。
六角ネジ、長さ1インチ(50x)McMaster-Carr92314A115 アリーナを作るのに使われます。32チャンバーアリーナ用の3/4インチネジ(92314A113、McMaster-Carr)と交換できます。
親指ナット (25x)McMaster-Carr92741A100アリーナを作るのに使用。通常の六角ナット(90480A005、McMaster-Carr)と交換できます。
ビデオカメラCanonVixia HF R700は、どの消費者向けカメラでも交換できます。
アリーナアリーナアリーナ

参考文献

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