方法論記事

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

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DOI：

10.3791/55297

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2017年6月26日

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1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

>jove_content<ここで説明するプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚をin vivoシステムで使用し、関心のある細胞タイプで選択的に発現する蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの遺伝的にコードされた電圧インジケータ(GEVI)を使用することにより、最も非侵襲的な生理学的条件での興奮性細胞の電気的特性の研究を可能にします。

要約

ここで説明されているプロトコルは、研究者が細胞が存在する環境の完全性を変えることなく細胞コミュニケーションを研究できるように設計されています。具体的には、脊髄ニューロンなどの興奮性細胞の電気的活動を解析するために開発されました。このようなシナリオでは、脊髄細胞の完全性を維持することが重要であるだけでなく、関与するシステムの解剖学的構造と生理学的形状を維持することも重要です。実際、神経系やその他の複雑なシステムが機能する方法の理解は、体系的なアプローチに基づいている必要があります。このため、モデル系として生きたゼブラフィッシュの胚を選び、胚の生理的条件に干渉することなく脊髄ニューロンの膜電圧変化を評価しました。

ここでは、ゼブラフィッシュの胚の使用とFRETベースのバイオセンサーを組み合わせたアプローチについて説明します。ゼブラフィッシュの胚は非常に単純化された神経系を特徴としており、その透明性によりイメージングアプリケーションに特に適しており、ゼブラフィッシュの発生中に原形質膜で蛍光ベースの電圧インジケーターを使用することができます。これら2つのコンポーネント間の相乗効果により、生理学的状態を乱すことなく、無傷の生物の細胞の電気的活動を分析することができます。最後に、この非侵襲的アプローチは、他の解析(例えば、ここに示すように自発的な動きの記録)と共存させることができます。

概要

生体内の全身成分分析により、科学者は最も信頼性の高い方法で細胞の行動を調べることができます。膜電圧の変化が興奮性細胞間の伝達を促進する神経系のように、精査中の活性が細胞 - 細胞相互作用（接触および非接触依存）によって大きく影響を受ける場合、これは特に当てはまります。これらの電気信号によってコード化された情報の理解は、神経系が生理学的状態および疾患状態の両方で働く方法を理解するための鍵である。

最も非侵襲性の生理学的条件における細胞の電気的特性を研究するために、いくつかの遺伝的にコード化された電圧指示薬が最近開発されている1 。以前の世代の光電圧センサ（主に電圧感受性色素） 2とは対照的に、GEVIはインタクトな神経系の生体内解析を可能にし 、それらの発現は、特定の細胞型または集団に限定することができる。

ゼブラフィッシュの胚は、GEVIに起因する大きな潜在的可能性を利用するための生体内の 「基質」です。実際、ゼブラフィッシュモデルは、その光学的明瞭性と簡略化され、進化的に保存された神経系のおかげで、ネットワーク内のすべての細胞成分を簡単に同定し、操作することができます。実際、FRETに基づくGEVI Mermaid 3の採用により、筋萎縮性側索硬化症（ALS） 4のゼブラフィッシュモデルにおける脊髄運動ニューロン挙動の予兆的な変化が同定された4 。

以下のin vivoプロトコルは、ニューロン特異的様式でマーメイドを発現する完全なゼブラフィッシュ胚における脊髄運動ニューロンの電気的特性をどのように監視するかを記載する。また、どのように薬理学的に誘発されたchanこのような電気的性質の変化は、発達の非常に初期の段階でゼブラフィッシュの運動挙動を特徴付けるステレオタイプの運動活動である、胚性の自発的な巻き取りの頻度の変化に関連し得る。

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プロトコル

1. pHuC_Mermaidプラスミドの生成

注：マーメイドは、 Ciona intestinalisの電圧感知ドメイン（VSD）をペアにして開発されたバイオセンサーです FRETパートナーフルオロフォアUmi-Kinoko Green（mUKG：ドナー）およびオレンジ発光蛍光タンパク質Kusabira Orange（mKOk：アクセプター）の単量体バージョンを用いて、ホスファターゼ（Ci-VSP）を含むCiona robusta ） 5電圧センサー。このバイオセンサーでは、膜脱分極によって誘導されるVSDドメインの構造変化が、ドナーおよびアクセプター蛍光タンパク質の近接を増加させるため、それらの間のエネルギー移動を増加させる（FRET比を増加させる） 3 。 VSDは、原形質膜におけるバイオセンサーの効率的な局在を保証する。バイオセンサーの神経細胞の発現（脊髄において、シグナルは、介在ニューロンおよび運動ニューロンの両方において検出可能である）は、マーメイドオペレーションをクローニングすることによって達成されるゼブラフィッシュ汎 - 神経系プロモーターHuC 6の下で、フレームリーディングフレーム（ORF）にクローニングした。

  1. 上流のSmaI制限酵素部位を挿入するために、T3ユニバーサルプライマーおよびマーメイドSmaIプライマー（5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA）を用いて、Pfu（プルーフリーディング）DNAポリメラーゼを用いて、マーセイドORFをpCS4 +マーメイドプラスミド3からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅する。マーメイドORFの
    1. 以下のPCR混合物を使用する：0.5μLのPfu DNAポリメラーゼ、7.5μLの特定の10倍緩衝液、1μLの10mM dNTP、2.5μLのジメチルスルホキシド（DMSO）、0.5μL（50ng）のプラスミド調製物、および1 50μLの全容量中の各プライマーの20μMストック溶液μL。
    2. 95℃で15秒間PCR混合物を加熱し、50℃で15秒間プライミングし、72℃で4分間、合計35サイクル伸長する。
  2. 特定の鈍器をゲル精製するPCR産物を、市販のゲル精製キットを使用して、製造者のプロトコールに従って精製した。
  3. 製造業者のプロトコールに従って、DNA断片をpCMV-SC平滑末端ベクターにクローニングする。
  4. HuCプロモーターの以下の挿入のために、マーメイド陽性プラスミド（pCMV-SC_Mermaidと名付けた）をSmaI制限酵素で線状化する。
    1. 以下のように制限反応を設定する： Sma I制限酵素0.5μL（10U）、キット10x緩衝液2μLおよびプラスミドDNA5μgを総容量20μLで加える。反応液を25℃で1時間インキュベートする。
  5. 製造業者のプロトコールに従い、市販のゲル精製キットを用いて消化したプラスミドをゲル精製する。
  6. 1対のHuC特異的プライマー（HuCprom-forw1_SalI：5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCAおよびHuCpro）を用いて、鋳型としてPfu DNAポリメラーゼおよびゼブラフィッシュゲノムDNAを用いてHuCプロモーター（pHuC）をPCR増幅する。m-rev1：5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG）およびATGの3,150bp上流領域にわたる。
    1. 以下のスキームを使用してPCR混合物をセットアップする：0.5μLのPfu DNAポリメラーゼ、7.5μLの特定の10倍緩衝液、1μLの10mM dNTP、2.5μLのDMSO、200ngのゲノムDNA、および1μLの20μM各プライマーのストック溶液を全量50μLで加える。
    2. 95℃で2分間の初期段階の後、95℃で15秒間PCR混合物を加熱し、50℃で15秒間プライミングし、72℃で4分間、合計35サイクル伸長する。
  7. 製造業者のプロトコールに従い、市販のゲル精製キットを用いて特異的な鈍化PCR産物をゲル精製する。
  8. 1μLのT4 DNAリガーゼおよび1μLの特定の10X緩衝液を用いて、等容積の精製したpCMV-SC_Mermaid（ステップ1.5）およびpHuC DNA（ステップ1.7）を総容量10μLでライゲーションする。反応を16時間インキュベートする。4℃。
  9. コンピテント細胞のアリコートを、ライゲーション反応（ステップ1.8）5μLで、製造者の指示に従って形質転換する。
  10. Sal I- Eco RV二重消化により適切な向きに挿入されたプロモーターを有するpHuC陽性クローン（pHuC_Mermaid）を選択する（ SalI制限部位は、ステップ1.6においてプロモーター断片の上流に挿入されているが、 Eco RV制限部位pCMV-SCプラスミドのポリアデニル化領域、ポリAの下流に位置する）。
    1. 以下のように制限反応を設定する： SalIおよびEco RV制限酵素0.5μL（10U）、キット10X緩衝液2μL、およびpHuC_Mermaid DNA1μgを総容量20μLで調製する。反応液を37℃で1時間インキュベートする。アガロースゲル上で反応を実行する。

2.胚マイクロインジェクション

  1. 受精したものを移す野生型（AB株）またはSod1-G93R成人ゼブラフィッシュ4から得られたgsをプラスチックピペットを用いて10mmペトリ皿に移した。
  2. 冷たい（4℃）魚の水で胚を洗い流し、マイクロインジェクターを用いて200μgのpHuC_Mermaidプラスミドで卵黄にマイクロインジェクションします（マイクロインジェクション手順の全体的および詳細な説明については参考文献7および8を参照）。
  3. プラスチックピペットを使用して、胚をペトリ皿に移し、以下の分析のために所望の発生段階（20-24時間の受精後、hpf）に達するまで28℃で魚の水中でそれらをインキュベートする。

3.自発的テールコイルリング解析

注：20-24 hpfの胚で、薬物リルゾールの有無にかかわらず、自発的な尾巻作用を評価する。

  1. 胚を、0.2％DMS​​Oを含有する魚の水で満たした90mm丸型ペトリ皿（リルゾール賦形剤）に移し、手動で脱蝋する。o鋭い先端を持つ宝石商の鉗子。胚を5分間インキュベートする。
  2. 実体顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラを使用して1分間のビデオ録画中にRTで尾巻を検出する。 30フレーム/秒の時間分解能で時系列を取得する。
  3. 時間単位あたりの屈曲の数（対側および同側の両方）を数えることによって、自発的な尾巻コイルの頻度を計算する。
  4. 薬物リルゾールの効果を評価するために、穏やかにプラスチックパスツールピペットを使用して、胚を5μMリルゾールを含む魚の水で満たされた新しい90mmペトリ皿に移す。
    1. 胚を5分間インキュベートしてから、1分間のビデオを記録し、上記のように行動分析を行う。

4.生きた胚におけるマーメイドバイオセンサーの可視化のためのイメージングセットアップ：ドナーシグナルとアクセプターシグナルの同時検出

  1. 魚水中の1％低融点アガロースに20〜24 hpfの胚をマウントする。35mmガラス底のイメージングディッシュ内で37℃。胚を両側に向けます。アガロースが室温で凝固するまで待つ。
  2. イメージングディッシュを、倒立顕微鏡に取り付けられた倒立共焦点のステージに移す。 488 nmアルゴンレーザーラインでmUKGを励起し、その発光を495〜525 nmの間で記録することによって、20X対物レンズ（0.7開口数、NA）でバイオセンサーを発現する運動ニューロンを同定する。
  3. FRET測定のために、FRETペアのドナーであるmUKGを488 nmレーザーラインで励起します。双方向モードで8,000Hzで動作する共鳴スキャナで、ドナーから放出された蛍光（495〜525nm）とmKOkアクセプター（550〜650nm、FRETチャネル）によって放出された蛍光とを同時に検出する。可能であれば、473 nmレーザーを使用してください。
    注：ドナーの励起効率はわずかに低下する（488nmで93％の代わりに85％）が、アクセプタの交差励起は（473nmレーザーラインでは488nmで17％から9％に減少する）。
  4. 光毒性および蛍光色素漂白を低減するためには、（収集ソフトウェアのビーム経路ウィンドウ上の）レーザーラインの出力を減少させることによって、試料の照射を最小化する。
  5. 実験の始めに設定され、セッション中一定に保たれるゲインとオフセットのパラメータを一致させるために、励起を最適化します。オフセットを設定するには、イメージの色を（Qルックアップテーブルを使用して）強度値に変更し、レーザーオフでスキャンしながら、オフセットノブ（スマートオフセット）を回して、背景ピクセルの強度がわずかになるようにしますゼロより高い。同じルックアップテーブルを使用して、スキャン中にレーザーをオンにすると、飽和ピクセルを避けるように注意しながら、ゲインノブ（スマートゲイン）を回して信号対ノイズ比を最大にします。
  6. 開いたピンホール（2エアリーユニット）を使用して、16ビット画像を取得して定量化に十分なダイナミックレンジを提供しますeを分析する。平均化を避けて取得速度を上げ、光退色を最小限に抑えます。
  7. ソフトウェア取得ウィンドウで、ドロップダウンメニューから512 x 64ピクセル（ピクセルサイズ：605 nm）のイメージフィールドサイズを選択します。
  8. 取得モードウィンドウから、ドロップダウンメニューからxyt （単一のxy平面上の時間経過）を選択し、単一のxy平面を取得し、取得パラメータを設定して1つの画像を30ごとに記録することによって、胚の脊髄ニューロン電圧の変化を記録するmsで1分間。
  9. 同じニューロンにおける膜脱分極に対するリルゾールの投与の効果を評価するために、5μMのリルゾールを含有する魚の水を添加して5分後に新しいデータセットを取得する。
  10. FRET分析のために、ImageJマクロBiosensor_FRET（一本鎖FRETバイオセンサーを発現する）を使用する。
  11. （（FRET平均FRETバックグラウンド）/（ドナー平均 - ドナーバックグラウンド））として、各ニューロンの基底膜FRET比をt 1で評価する。ここで、FRETおよびドンまたは平均強度は、取得された各チャネルについて細胞周囲に描かれた同じ関心領域（ROI）で計算された平均蛍光強度であり、ドナーバックグラウンドは、蛍光サンプルなしの視野のROIで計算された平均蛍光強度である。
    注記：プラグインの使用方法の詳細な説明は、 www.medc.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fretウェブサイトを参照してください。
  12. グラフ化ソフトウェアを使用して、異なる実験パラダイム間の脱分極の頻度、振幅および持続時間を比較する。ペアのないスチューデントのt検定を用いて2つの群を比較し、P <0.05のときに平均値を統計的に異なると考える。

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結果

FRETに基づくマーメイドバイオセンサーコード配列を有する発現ベクターは、pHuC汎ニューロンプロモーターの制御下で、神経系においてのみタンパク質の合成を駆動し、単一細胞の受精卵に、マイクロインジェクションによって送達された一過性のトランスジェニック胚を得るために（ 図1 、 左パネル）。マイクロインジェクション技術を習得した後、マーメイド陽性胚の割合は100％に近かった。これらの中で、原形質膜で適切な量のマーメイドバイオセンサーを発現する胚のみがFRET分析/画像取得のために考慮された。

自発的巻上げ、尾の先端を頭部9,10 にもたらす全身収縮のみからなる運動応答を、20日の段階で記録した通常の魚培地（ 図1 、中央パネルおよびビデオ1 ）中で...

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ディスカッション

このプロトコールは、ゼブラフィッシュ胚脊髄運動ニューロンの電気的特性と、胚発生の約17hpfに現れ、24hpfまで持続する最も初期のステレオタイプ運動活性である自発的巻き取り行動との間の関連性を探索することを可能にした10 。

私たちのアプローチは、開発中の機能ネットワークにおける細胞間の相互作用の複雑さを完全に保ちながら、インタクトな胚の神経系を研究するツールを研究者に提供します。ゼブラフィッシュ胚のインビボイメージングは​​、低融点アガロース中に浸漬することによってそれらを単に固定化することによって実施されている。バイオセンサーの使用による細胞膜電位の変化の研究は、この方法の主な利点の1つである。エンベロープ組織11を除去することによってニューロンに物理的にアクセスしなければならないカノニカル電気生理学的アプローチは、検査中の細胞の電気的特性を変える可能性がある。さらに、FRETベースのバイオセンサーアプローチは、麻酔薬（ すなわち、ナトリウムチャ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、FRETイメージング解析に対する彼女の貴重なサポートに対してSimona Rodighieroに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
低融点アガロース シグマ・アルドリッチA9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzoleSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ DNAポリメラーゼ Agilent Technologies - Stratagene 製品事業部600389
T3 ユニバーサルプライマー Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up systemPromegaA9280
Universal SmaI primer Eurofins
StrataClone 哺乳類発現ベクターシステム / pCMV-SC 鈍器ベクトル アジレント・テクノロジーズ - ストラタジーン製品事業部 
SmaI ニューイングランドバイオラボR0141S
T4 DNAリガーゼプロメガM1801
SalIニューイングランドバイオラボR0138S
EcoRVニューイングランドバイオラボR0195S
、ガラス底イメージング皿 同上81151
鉗子Sigma-AldrichF6521
実体顕微鏡カマイクロシステムズM10 F
デジタルカメラライカマイクロシステムズDFC 310 FX
ライカアプリケーションスイート4.7.1ソフトウェア ライカマイクロシステム
QuickTime Player, v10.4Apple
共焦点顕微鏡 (倒立型)ライカマイクロシステムズTCS SP5
マイクロインジェクター エッペンドルフ Femtojet
ImageJマクロ Biosensor_FRET 
GraphPad プリズム 6.0c GraphPadソフトウェア株式会社
240228 35ミリメートルライズ

参考文献

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
  2. Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
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FRET

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