Method Article

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

DOI:

10.3791/55301

⸱

August 15th, 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

In This Article

Summary

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植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd ターゲット蛋白質のローカリゼーションのシグナルを識別するための戦略について述べる。

Abstract

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原形質 (Pd) は、小規模および大規模な分子は植物細胞間輸送されるゲートウェイとして機能する細胞間の接続です。生体高分子、このようなタンパク質の細胞間輸送がほとんどの特定ターゲット信号を含むアクティブなメカニズムを介して発生しますイオンと水などの小分子の Pd トランスポートは、受動的に発生すると推定されているに対し、分子を輸送しました。識別された原形質 (Pd) のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の希少性蛋白質の並べ替えについて厳しく制限している経路に関与する植物細胞間高分子輸送と通信します。植物の富から Pd は、通過するトラフィックに知られている内因性やウイルスの蛋白質のみ 3 PLSs 報告されているまでに、内因性の植物タンパク質からそれらのすべて。したがって、それは、必要かつ十分な生活の中で直接、Pd のターゲット機能 PLS のシーケンスを識別するために信頼性の高いかつ体系的な実験的戦略を策定する重要な植物細胞。ここでは、私たちはパラダイムとしてタバコ モザイク ウイルス(TMV) の細胞間移行タンパク質 (MP) を使用して 1 つのような戦略をについて説明します。これらの実験は、識別され、最初の特徴は、植物の PLS のウイルス、最も Pd ターゲット蛋白質の PLS シーケンスの発見のために適応することができます。

Introduction

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原形質 (Pd) は、植物の成長と形態形成、転写因子 mRNA と小さな RNA 分子に至るまでの主調整装置の細胞間輸送のための導管として機能します。さらに、Pd のこの高分子輸送能力を用いてほとんどの植物ウイルスの細胞間伝播感染;具体的に Pd1,2,3,4,5,6にターゲット移行タンパク質 (Mp) と呼ばれる特殊な蛋白質を進化してきた植物ウイルス Pd を通過するには,7. Pd 輸送の分子経路が最も可能性の高いこれらの経路に運ばれたタンパク質を対象とする特定のシーケンスと密接に相互接続されました。したがって、これらの Pd のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の識別は、対応する Pd 輸送経路の診断可能性があります。これは Pd 輸送8、類推によって異なる核輸入道に、異なる核局在化信号 (NLS) シーケンス9,

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Protocol

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1. 植物材料

  1. 植物の選択
  2. 関心、すなわち、内因性のタンパク質のこのタンパク質をエンコード、またはウイルス蛋白質の病原体の自然宿主を表す 1 つの蛋白質へのネイティブ植物種を使用します。さらに、選択した植物種は選択した一過性形質転換法に従う必要があります。
    注: 研究日常的に採用ベンサミアーナ タバコ、TMV の良いホストを表しますし、アグロバクテリウム形質転換技術、すなわち、agroinfiltration によって効率的に変換されます (手順 3 を参照)。(名) 形質転換植物はまた容易に育つ、アグロバクテリウムを簡単に接種され、共焦点顕微鏡を用いて簡単に大型の葉を持っています。
  3. 植物の成長
    1. 高密度でぬれた土で(名) ベンサミアーナ種子を植物します。20-25 ° C ~ 75 µmol 光子 m-2の-1での光の下で 16 時間と闇の 8 h で環境試験室でそれらを保ちます。Euphyll の直径は、0.5 cm に達した後慎重に大きいポットに苗を転送し、同じ条件下で同じ部屋で成長を続けます。
    2. 4 週間に最大葉がでは、直径 4-6 cm 以内 4 8 葉期になるまでの植物を維持します。この時、彼らは、agroinfiltration を使用できます (....

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Results

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忠実に記述されていたプロトコルから期待される結果を説明し、TMV MP PLS を識別する、代表的なデータは元らから適応されます。21.図 1 aは最初フルレングス TMV MP (1-268) TMV MP PLS (蛋白 1 50 最初 50 アミノ酸残基から成る) を表現する主要な構造を要約し、CFP (として生成するスキャン V4A 誘導体、アラニンが融合しました。手順 2.2 5.2 および 6 で説明されている) 一方、図 1 bを要約し、これらのタグ付きタンパク質の細胞内局在を定量化します。図 1特性周辺点状 Pd 局在観察されるパターン TMV MP-CFP との TMV MP PLS-CFP 同様 PDCB1 DsRed2 coexpressed Pd マーカーに関してを示しています (ステップ 5.1 を参照してください)。図 2 aは、Pd ターゲット.......

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Discussion

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このプロトコルは 4 つのコア成分: が必要であり、Pd、興味の蛋白質のフラグメントの長さは、徐々 に小さく分割体系的なテストの融合へ十分なシーケンスを識別する概念フラグメントとしても役立つタグとして高分子貨物と Pd が生活の中でターゲット機能試金される蛋白質を植物の次のテストの融合タンパク質の一過性発現組織。一過性発現のアグロバクテリウム仲介されたがの時間、すなわち数日間、類似の研究15でよく使用される遺伝子組換え植物の生産に必要な数ヶ月に比べて比較的短い期間内にデータを生成することに注意してください。

共発現細胞内局在性マーカーと興味の蛋白質の例えば、PDCB1 または無料 DsRed2 通常が行われる多重遺伝子発現ベクターから。ただし、1 つのベクトルへのいくつかの式のカセットの転送が技術的に問題がある場合、共発現も行える液体文化の同等のボリュームを組み合わせることにより、各カセットを転送する別のバイナリ構造に、agroinfiltration の結果として得られるアグロバクテリウム菌株。こ.......

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Disclosures

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利害の対立が宣言されていません。

Acknowledgements

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スペースの不足は、我々 はほとんどレビュー記事を引用し、その元作品が引用された私たちの同僚に申し訳。仮想研究所の仕事は、仮想に BSF、バード、米国農務省/NIFA NSF NIH からの補助金によってサポートされ、S.G.L. 研究所 NIH と S.G.L. に植物微生物学植物病理学の部門からの資金でサポートされて

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)ZeissLSM5同様の機能を備えた任意のCLSMが適切です
共焦点顕微鏡イメージング用のZenソフトウェアZeiss2009バージョンを使用したCLSMと互換性がある必要があります
 Agilent200523
アセトシリンゴンSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
注射器 針なしBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
スペクチノマイシン Sigma-AldrichS4014
RifampicinSigma-AldrichR3501
Ampicillin シグマ・アルドリッチA0166
ソフトウェアは、Quickchange IIサイト指向突然変異導入キット

References

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  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre....

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Plasmodesmata LocalizationProtein Targeting SignalsAgrobacterium InfiltrationConfocal MicroscopyFluorescent Protein TaggingTobacco Mosaic VirusPlant Cell CommunicationMolecular TransportPlasmodesmata TargetingCell to Cell Transport

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