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方法論記事

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

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DOI:

10.3791/55301

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2017年8月15日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

この記事について

サマリー

植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd ターゲット蛋白質のローカリゼーションのシグナルを識別するための戦略について述べる。

要約

原形質 (Pd) は、小規模および大規模な分子は植物細胞間輸送されるゲートウェイとして機能する細胞間の接続です。生体高分子、このようなタンパク質の細胞間輸送がほとんどの特定ターゲット信号を含むアクティブなメカニズムを介して発生しますイオンと水などの小分子の Pd トランスポートは、受動的に発生すると推定されているに対し、分子を輸送しました。識別された原形質 (Pd) のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の希少性蛋白質の並べ替えについて厳しく制限している経路に関与する植物細胞間高分子輸送と通信します。植物の富から Pd は、通過するトラフィックに知られている内因性やウイルスの蛋白質のみ 3 PLSs 報告されているまでに、内因性の植物タンパク質からそれらのすべて。したがって、それは、必要かつ十分な生活の中で直接、Pd のターゲット機能 PLS のシーケンスを識別するために信頼性の高いかつ体系的な実験的戦略を策定する重要な植物細胞。ここでは、私たちはパラダイムとしてタバコ モザイク ウイルス(TMV) の細胞間移行タンパク質 (MP) を使用して 1 つのような戦略をについて説明します。これらの実験は、識別され、最初の特徴は、植物の PLS のウイルス、最も Pd ターゲット蛋白質の PLS シーケンスの発見のために適応することができます。

概要

原形質 (Pd) は、植物の成長と形態形成、転写因子 mRNA と小さな RNA 分子に至るまでの主調整装置の細胞間輸送のための導管として機能します。さらに、Pd のこの高分子輸送能力を用いてほとんどの植物ウイルスの細胞間伝播感染;具体的に Pd1,2,3,4,5,6にターゲット移行タンパク質 (Mp) と呼ばれる特殊な蛋白質を進化してきた植物ウイルス Pd を通過するには,7. Pd 輸送の分子経路が最も可能性の高いこれらの経路に運ばれたタンパク質を対象とする特定のシーケンスと密接に相互接続されました。したがって、これらの Pd のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の識別は、対応する Pd 輸送経路の診断可能性があります。これは Pd 輸送8、類推によって異なる核輸入道に、異なる核局在化信号 (NLS) シーケンス9,10のために特定することができますたとえば。概念的には、NLSs と PLSs は、必要かつ十分な対象は、非分解の細胞内ターゲット シーケンスを表します。ただし、NLSs11とは異なり、シーケンスについては、PLSs は厳しく制限されています。具体的には、Pd をターゲットに関与する唯一の 4 つのタンパク質配列は、内因性の植物タンパク質から派生したそれらのすべての報告されています。最初の 1 つは、KN112 -内側の細胞層から植物葉13の表皮に移動する転写因子-そのノックス同族体14のホメオ ドメインによって表されます。また、2 つ目は、モチーフ15を転写因子、Dof、これは細胞間人身売買 (IT) として記載されている推定 PLS が含まれているからです。3 番目のシーケンス PDLP1 1 原形質常駐型膜タンパク質から、膜貫通ドメイン16によって表されます。最後に、シーケンスをターゲット 4 Pd の一種 (GPI) の報告された最近の固定された蛋白質、それは一種 (GPI) 変更信号17で表されます。

興味深いことに、ごく最近まで PLSs が報告されていないウイルスの MPs のため。以前の研究に植物ウイルス MPs18,19、すなわち、必要と Pd を無関係な貨物分子 (ターゲットに十分な最小限のアミノ酸配列などない真 PLS で推定 PLS シーケンスの存在が示されています。例えば。、CFP) ウイルスの MP で確認されました。まだこれらの蛋白質は、タバコ モザイク ウイルス(TMV) の MP の Pd の局在と輸送が実証20されている最初でした。

このギャップに対処する私たちは TMV MP PLS を識別する実験的戦略を開発しました。この戦略は、3 つの概念に基づいていた。(i) 我々 は必要かつ Pd21に標的蛋白質の十分な最小限アミノ酸として PLS を定義しました。(ii) ため、TMV MP をまず Pd をターゲットからこれらのチャンネル22移行し、これらの 2 つのアクティビティの連結を解くことと、善意の PLS は、Pd がターゲットだけとないため以降のトランスポート機能を識別するを目指した。(iii) は、Pd かどうか、構造的または機能的活動をターゲットに重要なアミノ酸残基の同定された PLS を分析しました。このアプローチを使用すると、我々 を善意の PLS として TMV MP のアミノ末端の 50 アミノ酸残基のシーケンスで区切られました。これは蛋白質の全体の長さを飽和 TMV MP フラグメントのシリーズを生産、CFP と彼らのカルボキシル末端のタグ付け、一過性植物組織でそれらを表現することによって行われました。各テストのフラグメントの Pd ローカリゼーションは、Pd マーカー蛋白質、PDCB1 (Pd カロース結合蛋白質 1)23でそれらを coexpressing によって決定されました。まだ pd、ローカライズが Pd を通過した最小フラグメントは、PLS を表すと考えられていた。最後に、PLS は、その構造や機能に必要な重要なアミノ酸残基を決定するアラニン スキャンでした。

ここで TMV MP PLS の同定を記述することによってこのアプローチを説明、一方それ使用されるかもしれない他の Pd 対象のタンパク質で PLSs を発見する植物病原菌、植物自体をエンコードするかどうかこれは本手法は Pd にターゲットする能力に関してウイルス MPs の固有の機能の利点を取らないので。

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プロトコル

1. 植物材料

  1. 植物の選択
  2. 関心、すなわち、内因性のタンパク質のこのタンパク質をエンコード、またはウイルス蛋白質の病原体の自然宿主を表す 1 つの蛋白質へのネイティブ植物種を使用します。さらに、選択した植物種は選択した一過性形質転換法に従う必要があります。
    注: 研究日常的に採用ベンサミアーナ タバコ、TMV の良いホストを表しますし、アグロバクテリウム形質転換技術、すなわち、agroinfiltration によって効率的に変換されます (手順 3 を参照)。(名) 形質転換植物はまた容易に育つ、アグロバクテリウムを簡単に接種され、共焦点顕微鏡を用いて簡単に大型の葉を持っています。
  3. 植物の成長
    1. 高密度でぬれた土で(名) ベンサミアーナ種子を植物します。20-25 ° C ~ 75 µmol 光子 m-2の-1での光の下で 16 時間と闇の 8 h で環境試験室でそれらを保ちます。Euphyll の直径は、0.5 cm に達した後慎重に大きいポットに苗を転送し、同じ条件下で同じ部屋で成長を続けます。
    2. 4 週間に最大葉がでは、直径 4-6 cm 以内 4 8 葉期になるまでの植物を維持します。この時、彼らは、agroinfiltration を使用できます (手順 3 を参照)。
      注: 重要なは、決して植物を使用、彼らは花のため、この発達の段階で葉アーキテクチャ ステッピング24,25、時々 矛盾した結果につながるようになった場合。

2. 発現用ベクター構築

  1. 発現系の選択
    1. 式システム、すなわちベクトル、ベクトル配信方法、植物研究の興味の蛋白質の表現に最適なを選択します。
      注: 時折、テスト蛋白質/植物の種のような特定の組み合わせ可能性があります特定のベクトルを必要として最適な表現と興味の蛋白質の機能の配信方法をベクトルします。最も双子葉植物でただし、表現のベクトルおよび配信システムとして agroinfiltration としてバイナリ プラスミドを選択します。
  2. タンパク質蛍光タグ
    1. 蛍光タグの各表現された蛋白質細胞内分布の22、Pd などの分析のため。
      注: CFP、DsRed2 などの蛍光タンパク質をタグとして採用。CFP とテスト蛋白質のタグは、無料 DsRed2 と coexpress。CFP 機能タグとウイルス関連のない貨物分子の両方。一過性発現の全体的な効率を調整する DsRed2 機能、それは最初に変換されたセルを識別するために、セル自律この後者の機能は、可能性のある非-セル-自律テストされた蛋白質の細胞間移動を評価する際に重要です。また細胞自律的である、PDCB1、Pd マーカーとの共発現の CFP と DsRed2 と PDCB1 テスト蛋白質をタグします。
    2. 親指のルールとして発現蛋白のカルボキシル末端を蛍光タグを融合します。ただし、Pd をターゲットしてタグ付きのフルレングス テスト蛋白質展示が侵害された場合は、タンパク質のアミノ末端にタグを転送します。
    3. 適した植物発現ベクターにテストする蛋白質のコード配列のクローンを作成します。
      注: 蛍光タグ付けを許可する多くの異なった植物発現ベクターがあります。我々 は pSAT プラスミド26のシリーズやアミノ酸の両方に推奨されるタグ (2.2.1 の手順を参照してください) フレーム内で直接興味のシーケンスのクローニングのために適している、誘導体27,28のいくつかを使用- とカルボキシル基末端方向。
    4. アグロバクテリウム バイナリ ベクトルに各式カセットを転送します。
      注: pSAT ベースの構成が agroinfiltration、植物の組織に直接 biolistic 配信に適したは変換メソッド (手順 3 を参照)、ここで推奨されている必要があります T DNA の間に位置する式カセットバイナリのボーダーはベクトル29をです。
      注: すべての pSAT ベクトル私 CeuI-SceI、から珍しい切削核酸アスキーを使用してクローン作成シングル ステップで pPZP RCS2 多重遺伝子発現ベクター26,30このような転送を許可する設計されています PI PspI と PI TliI26. 研究者 recombinatorial のクローンを活用することを好むなど、異種loxサイト31を使用して pSAT ベクトル変形26,27を使用できます。
    5. 共発現、両方式カセットを転送、例えば、テスト蛋白質 CFP DsRed2 またはテスト蛋白質 CFP と PDCB1 DsRed2 (参照ステップ 2.1)、同じ pPZP RCS2 バイナリ ベクトルに。
      注: また、アグロバクテリウム文化の個々 のバイナリ構造をかくまっていることが一緒に混合する(名) ベンサミアーナ浸潤の (ステップ 3.1 参照)。

3. Agroinfiltration

  1. アグロバクテリウムひずみ EHA105 または GV3101 として記述されている32の有能なセルのステップ 2.2.5 に 100 μ L の文化からの pPZP ベース RCS2 プラスミド 1 μ g を追加、氷上で 30 分間インキュベート、1 分の液体窒素で急速凍結し、15 分の 28 ° C の孵化させなさい。
    1. その後、有能なセルの混合物に 1 mL の LB 培地 (10 g/L トリプトン、5 グラム/L の酵母エキスと 10 g/L の NaCl) を追加 2, スピン 1 分 3,000 × g で細胞を 28 ° C で孵化させなさい、再 0.2 mL の lb にそれらを中断、それらを (例えば、100 mg/L スペクチノマイシン、ベクトルの pPZP ベース RSC226,3050 mg/L リファンピシン) 適切な抗生物質を添加した LB 寒天プレート。個々 のコロニーが表示されるまで 48 時間 28 ° C で成長します。
  2. ピックアップし、新鮮な LB 寒天培地プレート上にいくつかの個々 のコロニーをプレート (ステップ 3.1 を参照)、48 h、28 ° C で成長し、コロニー PCR33特定のバイナリ構造の存在を確認する分析のための細菌の少量を取る。
  3. (手順 3.1.1 参照) 適切な抗生物質を添加した LB 培地 5 mL に 28 ° C で一晩関心の構築と各アグロバクテリウム コロニーを成長します。3,000 × g で細胞を遠心し、再外径600それらを一時停止 = 0.5 agroinfiltration バッファー (10 mM MgCl2、10 mM MES (pH 5.6)、150 μ M の acetosyringone)。2 時間室温で孵化させなさい。
    1. タンパク質の共発現の単一の多重遺伝子発現プラスミドではなくバイナリ プラスミドの混合物を使用している場合は、浸透する前に 1:1 v/v 比で対応する細胞培養をミックスします。その後、2 h 28 ° C でセルを孵化させなさい。
  4. 完全に成熟した(名) ベンサミアーナの下 (裏面) 表皮に対して注射器 (針なし) のノズルの葉 1 mL プラスチック注射器押しに接種をロードします。手袋をはめた指で葉を向軸面34,35にしがみつきます。
    1. 低速注入による浸透中アグロバクテリウムをご紹介します。統計的な有意性、それぞれの植物の葉をいくつかに潜入します。
      注意: 彼らは一貫性のある表現のレベルを得られないよう古い葉に使用されないこと。
    2. すべての葉原を接種します。前述のステップ 1.2 観測まで浸透した植物を維持します。

4. 共焦点顕微鏡

  1. 静脈間のフラグメントに各葉をカットする刃を使用して (に応じて特定のテストされたタンパク質の一過性発現の効率); 浸潤後 24-48 h各組織スライスのサイズは、スライスは顕微鏡用カバーガラス (22 mm × 40 mm) で完全に覆われているようなことをする必要があります。
  2. 場所オブジェクトの葉片スライド、米粒葉面葉スライスに水の滴を配置、カバーガラスでそれをカバーします。それぞれの側にテープの小片とカバーガラスを固定します。
  3. レーザー共焦点顕微鏡の下 agroinfiltrated の組織を観察し、結果の画像を記録します。
    1. まず、10 X 対物レンズを使用して信号の細胞を特定しより詳細な観測のため 63 x 対物レンズを使用します。
    2. CFP と 543 を励起するアルゴン イオン レーザーから使用、458 nm 波長 nm DsRed2 を刺激します。画像の獲得、すなわち、レーザー強度と実験間の光電子増倍管 (PMT) 設定のすべての設定を保持します。平均では、実験条件ごとに 100-120 細胞を検査します。

5 の同定 PLS

  1. 共焦点顕微鏡 (セクション 4) を使用してテストされた蛋白質の局在を診断します。テスト蛋白質に特徴的な末梢点状パターン ・25,36,37,38,39,40,41かどうかに、colocalizes をチェックします。Pd マーカー PDCB123。これは、テスト対象のタンパク質が最も可能性の高い PLS シーケンスに含まれていることを示します。
  2. テスト蛋白質の PLS の活動の確認は徐々 により小さいフラグメント、autofluorescently、(例えばCFP、) にそのオープンリーディング フレーム (ORF) (genbank 受入番号 BAF93925.1) を分割した後、それぞれのタグし、分析、内局の手順 4 に記載されています。当初は、細分化されたフラグメントごとに 100 アミノ酸残基のサイズをお勧めします。
  3. 切り捨てられたフラグメントを PLS の活動があるし、まだ Pd に局在する最小フラグメントまで前述の手順 4 で、内局をチェックをさらに細分化、すなわち蛍光タグ貨物を輸送するのに十分です。Pd には識別されます。このフラグメントは、PLS のシーケンスを表すと推定されます。
  4. 蛍光タグに推定 PLS なしテスト蛋白質の残りの部分を実物大のテスト蛋白質、すなわちヒューズから推定 PLS を削除し、手順で説明するように結果変異体タンパク質の細胞内局在を決定4. 推定 PLS を欠いているが、この変異タンパク質が Pd に合わせてローカライズする失敗した場合特定 PLS ではないことだけ十分な (を参照してくださいステップ 5.3)、テスト蛋白質の Pd 輸送にも必要なが、これがわかります。
  5. Agroinfiltrate の PLS の CFP タグし、無料 DsRed2 (ステップ 3.3 を参照) 式をかくまっているアグロバクテリウム文化の混合物と葉を構築します。10 ステップ 4.3 と同じ設定を使用して倍の対物レンズを用いた共焦点顕微鏡浸潤組織を観察します。
  6. 細胞初期浸潤細胞と CFP と DsRed2 の両方の信号が含まれて、その展示運動と CFP 信号のみを含まれている隣接するセルのスコアを獲得します。
    注: この手順を調べその潜在的な細胞間移動能力の識別された PLSこれ Pd (含むほとんどの植物ウイルスの MPs) を対象とする多くの蛋白質はまた隣接セルに Pd を移動するためです。アグロバクテリウムの浸透のために使用の濃度はそれぞれ異なる構造の発現効率に依存します。Agroinfiltration の確実に変形されてないセルを残し、単一のセルの変換 (i)、(ii) 式のような効率を実現する細胞文化希釈を使用することを確認します。たとえば、我々 の実験はそれぞれ外径600 0.01 と CFP タグ PLS の無料 DsRed2 式の 0.005 を利用します。

6. アラニン スキャン42を使用して残基キー PLS の同定

  1. 標準 PCR のプロトコルを使用して、望ましい突然変異、すなわちアラニン、各プライマーの中央部の周りにターゲットのアミノ酸残基の置換が含まれて説明するように設計したプライマーのペアを用いたシーケンスを符号化 PLSを増幅するには21. プライマー設計や製造元の指示に従ってサイト指示された突然変異誘発用サイト指示された突然変異誘発キットを運ぶ。
  2. 任意標準 DNA 精製キットを使用して結果 PCR の製品の浄化し、保護者による制限をなくす DpnI 37 ° C にそれらを消化 (すなわち、非変異) メチル化と hemimethylated DNA。(氷) ではなく室温で 5 分間これをクールダウンします。エシェリヒア属大腸菌の有能なセル43, 混合物に直接変換し、ステップ 3.2 で説明されているように目的の突然変異体の構造に植民地を識別します。
  3. 2.2.4 の手順で説明するようバイナリのベクトルに突然変異体の構造を導入、手順 3 で説明されているように、agroinfiltration を実行、Pd ターゲットに前述の手順 4 で 5.1 を評価します。

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結果

忠実に記述されていたプロトコルから期待される結果を説明し、TMV MP PLS を識別する、代表的なデータは元らから適応されます。21.図 1 aは最初フルレングス TMV MP (1-268) TMV MP PLS (蛋白 1 50 最初 50 アミノ酸残基から成る) を表現する主要な構造を要約し、CFP (として生成するスキャン V4A 誘導体、アラニンが融合しました。手順 2.2 5.2 および 6 で説明されている) 一方、図 1 bを要約し、これらのタグ付きタンパク質の細胞内局在を定量化します。図 1特性周辺点状 Pd 局在観察されるパターン TMV MP-CFP との TMV MP PLS-CFP 同様 PDCB1 DsRed2 coexpressed Pd マーカーに関してを示しています (ステップ 5.1 を参照してください)。図 2 aは、Pd ターゲット...

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ディスカッション

このプロトコルは 4 つのコア成分: が必要であり、Pd、興味の蛋白質のフラグメントの長さは、徐々 に小さく分割体系的なテストの融合へ十分なシーケンスを識別する概念フラグメントとしても役立つタグとして高分子貨物と Pd が生活の中でターゲット機能試金される蛋白質を植物の次のテストの融合タンパク質の一過性発現組織。一過性発現のアグロバクテリウム仲介されたがの時間、すなわち数日間、類似の研究15でよく使用される遺伝子組換え植物の生産に必要な数ヶ月に比べて比較的短い期間内にデータを生成することに注意してください。

共発現細胞内局在性マーカーと興味の蛋白質の例えば、PDCB1 または無料 DsRed2 通常が行われる多重遺伝子発現ベクターから。ただし、1 つのベクトルへのいくつかの式のカセットの転送が技術的に問題がある場合、共発現も行える液体文化の同等のボリュームを組み合わせることにより、各カセットを転送する別のバイナリ構造に、agroinfiltration の結果として得られるアグロバクテリウム菌株。こ...

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開示事項

利害の対立が宣言されていません。

謝辞

スペースの不足は、我々 はほとんどレビュー記事を引用し、その元作品が引用された私たちの同僚に申し訳。仮想研究所の仕事は、仮想に BSF、バード、米国農務省/NIFA NSF NIH からの補助金によってサポートされ、S.G.L. 研究所 NIH と S.G.L. に植物微生物学植物病理学の部門からの資金でサポートされて

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)ZeissLSM5同様の機能を備えた任意のCLSMが適切です
共焦点顕微鏡イメージング用のZenソフトウェアZeiss2009バージョンを使用したCLSMと互換性がある必要があります
 Agilent200523
アセトシリンゴンSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
注射器 針なしBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
スペクチノマイシン Sigma-AldrichS4014
RifampicinSigma-AldrichR3501
Ampicillin シグマ・アルドリッチA0166
ソフトウェアは、Quickchange IIサイト指向突然変異導入キット

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