ゼブラフィッシュにおけるPseudocapillaria のキリ、マイコバクテリウム属、アエロモナス サルモニシダ環境スクリーニング

研究と動物福祉^1,2を保護するために病原体の存在は、動物施設内で監視されます。ゼブラフィッシュ、状態監視の^{3,4,5,6,7,8,9,10,11 の場合}しばしば分析動物死後病理、細菌文化、または分子法に依存しています。植民地動物だけをテストは、魚や低有病の病原体を検出する必要がある関連費用の数のために推奨される方法ではありません。したがって、汚染物質の高い負荷に動物の小さなグループを公開するをお勧めします。これらの魚は、プレろ過歩哨と呼ばれます。この露出ヶ月続く、それは動物介護のワークロードおよび/またはいくつかの特化したエンジニア リング ソリューションの増加を伴います。別の挑戦は、肥沃な動物は維持されるが、これは死体にルーチン試金と互換性がない検疫でインポートされた行のスクリーニングです。

我々 はここでスクリーニング水生システムの環境で (A. サルモニシダ マイコバクテリウム属とユスラウメ) 特定のゼブラフィッシュの病原体を検出するいくつかの方法について説明します。目的は、稼働状態の監視に使用される魚の数を減らすし、売り上げ高、コスト、および検出の感度を最適化します。このようなメソッドの動物の使用に代わるとスクリーニングの輸入検疫にいくつかのテクニックを適用できます。たとえば、Mocho⁹は (歩哨を含む)、ゼブラフィッシュではなく排水綿棒で PCR を行いより多くの病原性抗酸菌種を識別することができる、これは少ないサンプル数で得られました。浮選と顕微鏡を用いた槽汚泥をスクリーニングしてより感度とユスラウメ卵が検出された、同調査は、PCR および病理組織学的に魚をテストするのではなく。

表 1は、sentinel プログラム^{3,4,5,6,7,8,9,10 のさまざまな特性をまとめたもの}ゼブラフィッシュ施設数で使用されます。プレろ過歩哨最初植民地魚タンクを通して回覧されている水を受け取るに対し、後ろ過歩哨は植民地魚と同じ方法で水を受け取る。たとえば、プレろ過歩哨は、排水の水を継続的に受けたのプロセス循環システムを設定できます。これは、1 つの部屋に多くの独立したシステムがある場合、オプションをできない場合があります。この場合、プレろ過歩哨の 1 つのタンクは、部屋全体を画面に使用できます。歩哨は、循環システムの静的なタンクとのみプレろ過水すなわち部屋内のすべてのシステムからの排水水使用して彼らの水を定期的に変更します。この手法は環境のスクリーニングの有効性との比較の基準として以下に示すです。提案のセットアップは、pH または窒素汚染の減少のような水質問題を制御する設計されています。

細菌環境スクリーニングの概念は、細菌はバイオ フィルムなどに水表面で排水の壁にある、下部タンクの汚泥検出仮説に依存します。サンプに思われる理想的なサンプリング ポイント循環養殖システム (水、糞便、飼料、および他の有機材料) は廃棄物収集からすべてタンク プレろ過から。油溜めの表面は容易に到達可能な多くの場合、拭き取りは高速で、(たとえば手袋) からサンプルのクロス汚染を避けるため無菌実行できます。コンセプトは、ゼブラフィッシュ システム^9,12流行病原性抗酸菌属を識別するために使用されます。テクニックは後述し、もゼブラフィッシュ排水表面綿棒と汚泥のA. サルモニシダの検出を報告しています。

寄生虫卵の環境スクリーニング、マレーらによって検出に基づく¹³浮選法は、寄生虫の糞便¹⁴寄生虫卵の顕微鏡的スクリーニング定期的に使用されます。Mocho⁹および魚ビオトープの他の種を検出する手法が使えるサンプリング プロセスに代わるものを提案します。感染したD. 学合格ユスラウメ彼らの糞便の卵と汚泥で、タンクの底に残る寄生虫卵。そこの密度が水より大きい収集できます。卵の密度があまりにも環境のサンプルを処理する使用されます。遠心分離と最初の浮上は、重い物質から水と光の破片を分離します。2 回目の遠心分離は、管の表面に出現する寄生虫卵を許可する飽和砂糖溶液 (ユスラウメ卵の密度よりも大きい密度) に依存します。

タンクの底からユスラウメバイオ フィルム中の細菌のスクリーニングは、最初の遠心分離後に得られた底質汚泥試料のすべてのこれらの病原体のための PCR を実行することによって結合できます。これは、サンプリング時間を最適化します。メソッドを以下に示します。また、検疫のコンテキストでこれらのテクニックを使用する提案します。生きている保たれる必要が輸入のアダルト ゼブラフィッシュを画面に繁殖デバイスが検疫タンクに挿入されます。1 週間後糞便および繁殖デバイスで他の廃棄物を収集し、顕微鏡または PCR によって上映します。手法を以下に、いくつかのユスラウメの卵がこのコンテキストで顕微鏡検査によって検出されました。

1 プレろ過の暴露についての循環システムの番兵します。

1. 循環システムからクリーンな 8 L タンクを設定します。サンプから水でそれを埋めます。2 セラミック ビーズを追加またはシステムから画面 (図 1) のバイオ-メディアのキューブをスポンジします。1-2 D. 学/L (すなわち、12 魚) を追加します。施設、たとえば株式会社の支配的な遺伝的背景の野生型魚を使用します。
   1. 次のように少なくとも 6 魚を選択: 少なくとも 1 人の女性と 6 ヶ月以下の年齢、一人の女性と生後 18 カ月の上の 1 人の男性と 1 人の女性 6 と 18 ヶ月の間 1 人の男性の男性 1 人。
2. 一日一回をフィードします。(例えば、乾燥ダイエット、ブラインシュリンプ) 歩哨がゼブラフィッシュ飼育施設で使用されているすべての食事にさらされているかどうかを確認するダイエットを異なります。4 ヶ月間週に 3 回月曜日、水曜日、および金曜日、すなわち、上の水を変更します。
   1. 水の変更を行うには、するには、一時的にタンクに歩哨とバイオ メディアを転送します。センチネル タンクを完全に空し、それをきれいに。排水水だけでセンチネル タンクを補充します。歩哨とバイオ メディアを戻します。
3. 4 ヶ月水を排水するため歩哨を公開します。2-フェノキシエタノール (3 mL/L) の過剰摂取溶液中浸漬などの承認された方法で魚を安楽死させます。
4. 死を確認するためには、蓋の動きの停止後 10 分を待ちます。
   1. 死体をピンセットでつかむし、識別されたコンテナーで-80 ° C で完全フリーズします。これは PCR^12,15で使用されます。
   2. また、カット、tailat 尾柄、腹部壁をニックし、4% ホルマリンで設定。
      注意: は、手袋を使用し、病理のドラフターします。サンプル容器にラベルを付けます。

2. 排水綿棒

1. プラスチック製のシャフトで滅菌乾燥綿棒を使用します。手袋を着用します。綿棒 (水の表面に壁排水) に表面を見つけて、表面に簡単にアクセスを防止するすべての項目を削除します。低流量での排水面を選択します。
2. 外側の包装を外して綿棒を抜くし、空気に滅菌綿棒を公開します。綿棒のクロス汚染を避けるため、テストされていない表面に触れないように注意することによって。
   1. サンプ壁水と排水の水表面のレベルにバイオ フィルムを吸収する 5-10 cm 以上、綿棒します。
   2. バックの綿棒をシースまたは滅菌遠心管に先端を破る。サンプルのラベルまたは PCR テストを送信する-80 ° C で凍結

3. タンクの下部にユスラウメ卵の検出

1. 顕微鏡による汚泥の分析
   1. 60 mL シリンジ⁹を使用して、排水または歩哨を含む魚を保持、タンクの下部に汚泥を吸引します。15 mL チューブにサンプルを分割します。スクリュー キャップ式のチューブを閉じてチューブをラベルします。
   2. 糖飽和溶液を準備 (比重 = 1.27) マグネチックスターラー¹⁴177 mL のお湯にグラニュー糖の 227 g を混合することによって。
   3. 175 250 x g スイング バケツ、遠心分離機で 10 分で 15 mL チューブを遠心します。チューブをデカントし、管内の堆積物を維持します。
   4. 糖飽和溶液を半管を埋めます。スクリュー トップ チューブを閉じて、ソリューションに堆積物を徹底的にミックスします。
   5. 遠心分離機スイング バケツにチューブを置き、上に飽和糖溶液でそれらを埋めます。1 つのカバー ガラス各チューブの上にゆっくりと飽和糖溶液との接触を設定します。
   6. 175 250 x g で 10 分いくつかのカバーのガラスが落ちると破るための遠心分離の間に、遠心分離、各 60 mL サンプルの 4 つの管です。カバーのガラスを持ち上げ、スライド ガラス上に設定。鉛筆やマーカーのペンを使ってスライドにラベルを付けます。
      1. あまりにも多くのカバー ガラス破損が発生した場合に備えて糖飽和溶液、175 250 x g で 10 分間遠心管のほとんどを埋めるため糖飽和溶液を先頭にいっぱい、カバーガラスをそっと置きます。30 分待ちます。
   7. (図 2およびビデオ 1) 顕微鏡¹³ ユスラウメ卵を探します。倍率 400 ×⁶でバイポーラ プラグを識別します。
      注: 卵のサイズは 57 78 μ m 長と 27 39 μ m 径^16,17。1 つの肯定的なスライドは肯定的な宣言する 60 の mL のサンプルのために十分に注意してください。
2. スクリーニング輸入動物検疫ユスラウメの卵のための
   1. タンクの男性と女性のD. 学を設定します。タンクに通常収穫が生み出された卵を保持、糞便 (図 3) を収集するためにここでそれを使用するためのデバイスを追加します。
      注: たとえば、フル 1 L 飼育槽 (外部タンクとおろしの底と内側のタンク) は水没 13 リットル タンク、繁殖装置出入りする魚のための無料アクセスを許可します。
   2. 1 週間後繁殖デバイスを削除し、ステップ 3.1「汚泥分析顕微鏡」で説明するように繁殖装置で回収した汚泥を収穫

4. 汚泥堆積物の PCR

1. 下部のタンクまたは 60 mL シリンジ⁹排水汚泥を吸引し、60 mL チューブにサンプルを転送します。そのスクリュー トップ チューブを閉じてチューブをラベルします。注射器を処分します。
2. 60 mL チューブを振るし、15 mL を 15 mL チューブに転送します。そのスクリュー トップ チューブを閉じてチューブをラベルします。
3. 175 250 x g スイング バケツ、遠心分離機で 10 分で 15 mL チューブを遠心します。チューブをデカント、チューブで沈殿物を保ちます。
4. 外側の包装を外して綿棒を抜くし、空気に滅菌綿棒を公開します。綿棒のクロス汚染を避けるため、テストされていない表面に触れないように注意することによって。
   1. 15 管内堆積物を綿棒 s。
   2. バックの綿棒をシースまたは滅菌遠心管に先端を破る。サンプルのラベル、-80 ° C で凍結し、PCR テスト送信します。
      注: 45 mL 60 mL チューブ内に残ります。これは、保管できるユスラウメ卵の検出のため汚泥による顕微鏡による 3.1 の例では、PCR の結果を確認するための手順で説明するよう。汚泥の PCR は次のステップ 3.2 輸入動物をスクリーニングするために実行されます。

魚試料と比較して流行のミコバクテリウム属を識別するために油溜め綿棒の利点は、図 4の結果によってサポートされます。テスト 115 魚のM. chelonae , M. haemophilum検出されたサンプルの 3% と 5% でそれぞれ.その他の病原性抗酸菌種は確認されませんでした。同じシステムから 49 排水綿棒は、5 種の抗酸菌の存在を明らかにしました。M. chelonaeとM. 合併した非定型が検出されたことより頻繁 PCR による魚のサンプルよりも表面の油溜め綿棒で仮説とオッズ比が計算されます。これは 11 の各オッズ比の統計的に有意な (95 %ci: 29 に 4;p < 0.0001) と 306 (95 %ci: 18 に 5208;p = 0.0001)。結果は、表面排水綿棒テクニックがミコバクテリウム属のゼブラフィッシュ飼育施設の画面に歩哨の唯一の使用の貴重な代替であることを示す環境試料はまた使用されたA. サルモニシダの画面に。これらの細菌は、魚、汚泥や表面のサンプル (図 4) で検出されました。これはまた魚ビオトープを選別する提案手法の能力をサポートしています。

ユスラウメの卵を検出する汚泥分析に関する Mocho9卵が同じシステムから分析された汚泥の 93% で検出されたに対し PCR と病理組織学による魚肉の 27% で寄生虫が検出。ここでは、テクニックは、検疫審査を再現する挑戦されました。この中で、輸入動物サンプリングできず、バイオ セキュリティ管理に役立ちます、タイムリーに自分の健康状態を評価します。ユスラウメの肯定的な施設から不明な状態の魚がデバイスを繁殖 8 タンクに設定された: 16 魚/13 L タンク、7 遺伝子組換えと混在性別、野生型の 1 ラインの最大歳 4-24 ヶ月。汚泥は、デバイスから 1 週間後に収穫され、顕微鏡による分析します。ユスラウメの卵は、7 (88%) のサンプルで見られました。最後に、寄生虫の PCR 検出された排水綿棒と汚泥堆積物に試験的。4 のうち 6 汚泥試料 PCR 陽性と結果はすべて陰性であり表面の綿棒。汚泥スクリーニングがタンクの底に落ちる卵の能力に依存しているために、これは驚くべきことではありません。これはユスラウメの侵入のためD. 学水族館とメソッドがインポートされた動物のスクリーニングのために適応することができます画面に汚泥分析手法を使えることを示しています。

図 1: 循環システムからプレろ過センチネル タンクします。8 L タンクは水とバイオ メディア システムの油溜めから画面をいっぱいに。2 つの白いセラミック バイオ メディア ビーズ (写真) の真ん中にタンクの下部に座る。12 魚は性別、ひずみ、年齢に従って選択され、センチネル タンクに追加されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 顕微鏡による汚泥の分析中に検出されたユスラウメ卵。使用倍率は、400 X だった。矢印は、バイポーラ プラグを示します。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 分析のための汚泥を収集するために魚の保有物タンクに沈んでデバイスを育種します。画像の目的のためのベンチにこのタンクを設定します。それは循環システムのそれ以外の場合に設定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 魚、マイコバクテリウム属、 A. サルモニシダ、および PCR によるユスラウメの同定率表面排水綿棒と排水汚泥。割合は、各病原体種の肯定的な結果の数をテストされたサンプル数で除算によって取得されます。肯定的な結果の割合として魚、サーフェス、または汚泥サンプルの種類によって与えられるあり細菌の名前後示されます。ミコバクテリウム属菌の同定のため PCR によってテストされた 115 魚と 49 の表面排水綿棒データは、この研究の延長だから Mocho の9結果でコンパイルされます。魚がプロトコルのセクション 1 に従って主にプレろ過歩哨です。まれに、歩哨が利用できなかった場合の逃亡者と旧植民地魚 (> 18 ヶ月) サンプリングされました。ミコバクテリウム属のすべてのテストされたシステムは、魚、油溜め綿棒でテストされました。M. chelonaeとM. 合併した非定型が検出されたことより頻繁 PCR による魚のサンプルよりも表面の油溜め綿棒で仮説とオッズ比が計算されます。これは 11 の各オッズ比の統計的に有意な (95 %ci: 29 に 4;p < 0.0001) と 306 (95 %ci: 18 に 5208;p = 0.0001)。結核菌 marinumPCR のすべてのサンプルに対する否定的だった、従ってこれらの施設から欠席とみなされる、分析に含まれません。6 排水汚泥、14 の表面排水綿棒 12 魚がA. サルモニシダの存在を PCR で調べた。6 油溜めは、汚泥表面にユスラウメの存在を調べた。PCR のポリメラーゼ連鎖反応を =。CI = 信頼区間。* と * *; 統計的有意性を示すその他の比較は、統計的に有意でした。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ビデオ 1: スキャンの卵ユスラウメ顕微鏡と。スライドは、3.1 の手順で説明するように、汚泥分析から取得されます。フィールドは、ユスラウメの卵を検出するスキャンされます。構造が認識されるより高い解像度で識別を確認するために拡大されます。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

表 1: ゼブラフィッシュ施設でセンチネル設定の比較。センチネル魚は、自分の年齢、性別、ひずみによると選択可能性があります。一定期間内に、公開され、前または後のろ過システムの水を受けます。2016 ゼブラフィッシュ ジャーナル3,4,5,6,7,8,9,の健康特集からコンパイル データ10。

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