遅行本鎖DNA合成の動態<em&gt;インビトロ</em&gt;バクテリオファージT7複製タンパク質によって

サマリー

私たちは、バクテリオファージT7の複製タンパク質を使用して遅延鎖開始の動態を調べるための高感度のゲルベースの不連続アッセイについて説明します。

要約

ここでは、バクテリオファージT7の複製タンパク質によるin vitroでの遅延鎖DNA合成の速度論的検査のためのプロトコルを提供します。T7レプリソームは、知られている最も単純な複製システムの1つであり、わずか4つのタンパク質で構成されており、これは生化学実験にとって魅力的な特徴です。特に、DNAポリメラーゼがDNA合成を開始するために使用するT7プリマーゼ-ヘリカーゼによるリボヌクレオチドプライマーの合成に重点が置かれています。DNA複製のメカニズムは進化を通じて保存されるため、これらのプロトコルは、他のモデルシステムを使用する研究者に適用可能または概念的な出発点として有用であるはずです。ここで説明するプロトコルは非常に感度が高く、経験豊富な研究者であれば、これらの実験を行い、分析用のデータを約1日で取得できます。必要な特殊な機器は急速急冷流装置だけですが、この機器は比較的一般的で、さまざまな商用ソースから入手できます。ただし、これらのアッセイの主な欠点には、放射能の使用と比較的低いスループットが含まれます。

概要

DNAの複製は、すべての細胞の生命の保存機能です。アイデンティティおよびレプリケーション・コンポーネントの数は広く変化するが、一般的なメカニズムが進化¹間で共有されています。ここで、我々は、T7レプリソームのコンポーネントによってインビトロでラギング鎖DNA合成の動態を理解することを目的とした放射性基質を使用して、ゲルに基づく、不連続動態実験を記載します。バクテリオファージT7の複製機構は、4つのタンパク質（DNAポリメラーゼ、GP5、そのプロセッシング因子、 大腸菌チオレドキシン、二官能性プライマーゼ、ヘリカーゼGP4、及び一本鎖DNA結合タンパク質、GP2からなる非常に簡単です。 ^5）2。この機能は、DNA複製に関与する保存された生化学的機構を研究するための魅力的なモデルシステムになります。

特別重点は、プライマーゼT7 DNA、criticaによりリボヌクレオチドプライマーの形成に配置されていますDNA合成の開始におけるL段階。また、一つは、反応混合物に含めることにより、T7 DNAポリメラーゼ、または他の複製タンパク質によって、これらのプライマーの使用を調べることができます。 T7プライマーゼ、ヘリカーゼ、GP4は、プライマーゼ認識部位、またはPRS（5'-GTC-3 '）と呼ばれる特定のDNA配列においてDNA合成のた....

プロトコル

注：このような手袋、安全メガネ、白衣、および適切なアクリルの盾として、を含むがこれらに限定されない、個人用保護具の使用を放射性物質の安全な使用、廃棄に関するすべての機関の規制に従ってください。

注：標準緩衝液は、40mMのHEPES-KOH、pHは7.5、50 mMのグルタミン酸カリウム、5mMのDTT、0.1mMのEDTA（このバッファは5倍の濃度で予備製）との各dNTP 0.3 mMの構成されています。 ^{8、9、10に}記載されるようにT7複製タンパク質が精製されます。単一T7プライマーゼ認識部位（5'-GGGTC-3 '、5'-GTGTC-3'、5'-TGGTC-3 '）を含む一本鎖DNAは、DNA合成会社の様々な（長さから購入することができます一本鎖DNAは、T7プライマーゼのために、選択した酵素に依存し得る、ペンタマーは、全長プライマーを合成するための最小テンプレートの長さである¹潜在Cが必須であるように、プライマーは、ポリメラーゼによって伸長される場合に1が、しかし、追加のヌクレオチドが鋳型の3 '末端に存在しなければなりません。反応を10mMのMgCl ₂....

結果

手動多代謝回転条件下GP4によって触媒されるプライマーの合成反応をサンプリングすることによって、 すなわち 、プロトコルのステップ1に記載したように、図1Aに示した結果が得られました。ここで、ゲル電気泳動後の製品の範囲は、プライマー合成反応（ 図1A）内のα位の³² Pで標識されたCTPを用いて観察することができます。標識前駆体、CTPは、最も高い移動度を示し、GP4によって合成遅い移行ジ、トリに対応する種、およびtetraribonucleotidesに続くゲルの底部に向かって移動します。インキュベーションの長さ、および鋳型配列の文脈に応じて、より高いオリゴマー（pentaribonucleotides、 等 ）に対応する付加的な標識された製品を観察することができます。反応進行曲線は、最初の完全長のプライマーの濃度（即ち、テトラを決定することによって、プロットされそして、pentaribonucleotides）.......

ディスカッション

これらの実験を行う際に最も重要な要因は、高活性精製された酵素の利用です。 GP4との作業中に、例えば、我々は、-20℃で50％グリセロールを含むそのバッファ中の精製酵素の貯蔵（20 mMリン酸カリウム、pH7.4中、0.1mMのEDTA、1mMのDTT）に見出さはの減少をもたらします数ヶ月にわたる準備の具体的な活動。したがって、我々は今、精製25mMトリス - 塩酸、pH7.5の、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA、1mMのTCEPでGP4、および10％グリセロールのフラッシュ凍結小分けし、液体窒素を使用して、-80℃で保管してください。特に、最初のいくつかのサンプルの取得中に、急速クエンチフロー機器を使用しながら、その反応物は、反応前に開始し、反応温度（室温）に到達させることが重要です。また、細心の注意を十分に残っている消光試薬として、各時点の後、チューブ（プロトコールのステップ2.2.4）をきれいにするために取られるべきですラインが大幅に誤った結果をもたらす、酵素活性を阻害します。別の考慮事項は、ポリアクリルアミドゲルとその取り扱いの組成物を含みます。 GP4によって触媒プライマー合成反応中の.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリスプリセットクリスタル pH 7.5	SIGMA	T4128
トリスベース	SIGMA	93362
L-グルタミン酸カリウム塩一水和物	SIGMA	G1501
塩化マグネシウム六水和物	マリンクロット・ケミカルズ	5958-04
1,4-ジチオスレイトール	J.T.ベイカー	F780-02
ドデシル硫酸ナトリウム	MP バイオメディカルス	811030
(エチレンジニトリロ) 四酢酸、二ナトリウム塩、二水和物	マリンクロット・ケミカルズ	4931-04
[&α;-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	放射性、保護対策を講じる
[γ-32P] ATP	PerkinElmer		BLU502A放射性、保護対策を講じる
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	4 dNTPs set
100 mM ATPおよびCTP	Epicentre		RN02825 NTPセットの一部
ssDNAコンストラクト	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
メタノール	マクロンファインケミカルズ	3017-08
ホルムアミド	サーモサイエンティフィック	17899
ブロモフェノール	ブルーSIGMA	B8026
シリーン・キシアノール	シグマ	X4126
アクリルアミド	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-メチレンビスアクリルアミド	SIGMA	M7279	毒性
尿素	ボストンバイオプロダクツ	P-940
ホウ酸	マリンクロットケミカルズ	2549
急速急冷流装置	キンテック(株)	RQF-3
Kintekエクスプローラー	Kintek(株)	N/A
カレイダグラフ	シナジーソフトウェア	N/A

の一部