方法論記事

一次繊毛を研究するために一次ニューロスフェア培養物を使用して

DOI：

10.3791/55315

⸱

2017年4月14日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

主な繊毛は、神経前駆細胞の増殖、ニューロン分化、および成人の神経機能における基本的に重要です。ここでは、繊毛形成とプライマリニューロスフェア培養を用いて神経幹/前駆細胞および分化したニューロンにおける繊毛へのシグナル伝達タンパク質の輸送を研究するための方法について説明します。

要約

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一次繊毛は、神経幹細胞/前駆細胞の増殖と、胚期、出生後、および成人期におけるニューロンの分化にとって基本的に重要です。さらに、ほとんどの分化したニューロンは、Gタンパク質共役受容体などのシグナル伝達受容体と、アデニリルシクラーゼなどのシグナル伝達分子を収容する一次繊毛を持っています。一次繊毛は、胚性ニューロン発生中の音波ヘッジホッグ経路を含む複数の発生経路の活性を決定し、また、成体ニューロン機能中の区画化された細胞内シグナル伝達を促進する機能も果たします。当然のことながら、一次繊毛の生合成と機能の欠陥は、脳の発達異常、中枢性肥満、学習障害と記憶障害に関連しています。したがって、一次繊毛の生合成と繊毛輸送を神経幹細胞/前駆細胞と分化ニューロンの文脈で研究することが不可欠です。しかし、初代ニューロンの培養法には相当な専門知識が必要であり、凍結融解サイクルには適していません。このプロトコルでは、初代ニューロスフェアを使用して、神経幹細胞/前駆細胞の混合集団の培養方法について説明します。ニューロスフェアベースの培養法は、初代神経幹細胞/前駆細胞の研究の複合的な利点、すなわち、複数の継代および凍結融解サイクルへの適合性、ニューロン/グリアへの分化可能性、およびトランスフェクチャビリティを提供します。重要なことに、ニューロスフェア由来の神経幹/前駆細胞と分化したニューロンは、培養中で繊毛され、繊毛機能に関連するシグナル伝達分子をこれらのコンパートメントに局在させることがわかりました。これらの培養物を利用して、神経幹細胞/前駆細胞および分化ニューロンにおける繊毛形成および繊毛輸送を研究する方法をさらに説明します。これらのニューロスフェアベースの方法により、神経幹細胞/前駆細胞および分化ニューロンの文脈で、Gタンパク質共役受容体や音波ヘッジホッグシグナル伝達などの繊毛制御細胞経路を研究することができます。

概要

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一次繊毛は、成体神経機能3における胚神経発達1、2、及び区画細胞内シグナル伝達の間ソニックヘッジホッグ（Shhの）経路を含む細胞シグナル伝達経路の調整における感覚アンテナとして機能する微小管ベースの動的細胞内区画である4 。このような5にパッチを当てShhの受容体として、これらの経路のシグナル伝達成分、。経路アクチベーターあるSmoothened（SMO）6。そしてGpr161 7、負のShh経路を調節するオーファンGタンパク質共役型受容体（GPCR）は、動的に繊毛に局在します。複数のGPCRは、10脳7、8、9で神経細胞に繊毛に局在することが報告されていますSUP>、11、12、13、14、15、16。繊毛および繊毛で生成シグナル伝達経路における欠陥は、複数の組織に影響を与えると総称ciliopathies 17、18、19として知られています。繊毛病の疾患スペクトルはしばしば、頭蓋顔面異常20、21、22のような神経発達の欠陥を含みます。加えて、視床下部ニューロンにおける主要繊毛は、中央満腹経路を調節し、欠陥は、バルデーBiedel症候群24として症候群ciliopathiesにおける肥満をミラーリング、中心性肥満23をもたらします。また、繊毛シグナリング神経ペプチド受容体はCENTRを調節しますアル満腹14、11経路。毛様体アデニリルシクラーゼIII（ACIII）の局在化および海馬ニューロンにおけるそのようなソマトスタチン受容体3としてGPCRは、新規物体認識欠陥および記憶欠損25をもたらし26と毛様体の整合27の欠如に匹敵します。繊毛が生成したシグナルの発達的側面は密接に組織恒常性に結びついています。特に、繊毛は小脳28、29における顆粒前駆細胞から生じるのShhサブタイプの髄芽腫の進行に重要です。このように、主繊毛は、胚、出生後、および成人の神経細胞の発達と機能の間に重要な役割を果たしています。

神経幹細胞（NSCは）、側脳室の脳室下帯（SVZ）に存在する海馬の歯状回の顆粒下ゾーン、及び哺乳類30、31、32における視床下部における第三脳室の脳室帯。 NSCは、多能ある自己複製能を有し、かつ脳の発達と再生医療30のために重要です。 SVZのほとんどのNSCは、静止していると、多くの場合、側脳室33に張り出し孤独主要繊毛を持っています。特にShhは、TGFβ、および受容体チロシンキナーゼ経路2、34、35、36に関連して、下流の細胞応答を誘導する様々な受容体の局在化を介して、一次繊毛信号。一次繊毛は、側脳室中に延びているので、一次繊毛は、脳脊髄液（CSF）のNSC 37を活性化するためにサイトカインを検出すると仮定されますアップ。最近の研究では、Shhのシグナル伝達経路と主な繊毛が嗅上皮、肺、腎臓および38を含む複数の組織の修復および再生における幹細胞の活性化のために重要であることを示唆している39、40、41。しかしながら、CSFは、NSCを用いて一次繊毛が関与しているかどうかを通信するメカニズムは知られていません。文化の中で付着NSCは繊毛されています。このような繊毛でのSmoとGpr161としてのShh経路成分を、ローカライズ。そして42応答のShhです。このように、NSCは、Shhの経路を研究するための重要なモデル系、毛様体人身売買、および神経分化経路としての役割を果たすことができます。また、NSCをから分化したニューロンはまた、繊毛輸送アッセイのために使用することができます。

ニューロスフェアはneuraの増殖から生じる浮遊細胞のクラスターで構成されています特定の増殖因子と非接着面43、44の存在下で増殖L幹/前駆細胞。ニューロスフェアは、正常な発達と病気31、45、46、47の神経幹/前駆細胞を研究するためにin vitro培養モデルのように重要な役割を果たす。ここでは、神経幹/前駆細胞を培養するためにニューロン/グリアへの分化のためのニューロスフェアベースのアッセイを説明します。我々は、特に神経幹/前駆細胞および分化したニューロン（ 図1）の繊毛へのコンポーネントのシグナリングの輸送を強調する。一次ニューロンの培養とは対照的に、一次ニューロスフェアは、培養するのが比較的容易である複数の継代および凍結 - 融解のサイクルに適している、およびニューロン/グリアへの分化を受けることができます。重要なのは、我々はそのニューロスフェア由来神経を決定しました幹/前駆細胞と分化したニューロンは、培養中の繊毛およびこれらの区画における繊毛機能に関連するシグナル伝達分子局在化しています。ニューロスフェアベースの培養方法は、NSCの分化及びニューロンにおいて繊毛形成と繊毛輸送を研究するための理想的なモデル系として役立つことができます。

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プロトコル

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成体マウス脳からのニューロスフェアの単離

  1. イソフルランの過剰投与により（約2ヶ月）成体マウスを安楽死させます。マウスが呼吸を停止し、死の直後に解剖したことをダブルチェック。
  2. はさみを使用して、頭蓋骨を開くために正中切開を行います。脳を削除します。
  3. 氷の上で10cmディッシュに冷たいPBSで脳を置きます。側脳室48からSVZを得るために全体のマウント解剖の方法に従ってください。
  4. 、1.5mlチューブに側脳室を配置し、0.05％トリプシン-EDTAをPBS中の500μLを添加し、水浴中で37℃で15分間チューブをインキュベートします。
  5. 15分後、停止中の500μLを加え、穏やかに20ピペット - 1mLの先端と30回。ピペット操作中に気泡を形成することは避けてください。
    注：この手順は、細胞の生存に重要です。
  6. 8分間、500×gで細胞をスピンダウン。 、上清を捨て、PBS 1 mLを加え、再懸濁さt穏やかに1 mLの先端で5回ピペッティングすることにより彼の細胞。
  7. 8分間500×gでスピンダウン。 1mLのチップを使用して上清を捨て、基礎培地1mLを加えます。
  8. （オプション）細胞破片が認められた場合、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞を渡します。
  9. 血球計数器を用いた細胞の数を数えます。一般的には、約30,000 - 60,000細胞/ SVZが得られます。
  10. プレートを5％CO 2、37℃でNSC培地及び培養の10mlで10cmディッシュに1つのSVZからの細胞。
  11. 球体49との間の融合を回避するために（オプション）、5％CO 2、37℃でNSC培地及び培養1.5mLの予め充填されている超低結合、6ウェルプレートの1ウェルに1,000細胞を置きます。
    注：5-7日後、神経球を観察することができる（ 図2A）。培養期間は、マウスの年齢や遺伝的背景と異なる場合があります。
  12. 文化を維持するために、3〜4日ごとにNSC培地2mlを追加（既存のメディアを削除しないでください）。

ニューロスフェアの分化能と繊毛形成試験の2分析

  1. 分化能を分析するために、分化培地中の付着条件の下での神経球を分析します。
  2. オートクレーブまたは使用前にUV照射で12ミリメートルラウンドカバースリップを滅菌します。接着細胞培養のために、無菌条件下で24ウェルプレートのウェルに滅菌12ミリメートル丸いカバーガラスを置きます。
  3. 0.002％ポリ-L-リシン（PLL）の500μLで10秒間コートカバーガラス。ソリューションを吸引し、10〜15分間、それを乾燥させます。
  4. ラミニン溶液500μL（5μgの/μL）を追加します。 37℃で1時間、カバーガラスをインキュベートします。
  5. ラミニンを吸引し、分化培地またはNSC培地（未分化対照）500μLを加えます。
  6. 顕微鏡下で200μLチップで200ミクロン球 - 分化アッセイのために、100を拾います。加えます分化培地で7〜10日間、24ウェルプレート培養の各ウェルに5-10神経球。
  7. 未分化神経球を分析するために、NSC培地中で1〜2日間、24ウェルプレート培養の各ウェルに5-10ニューロスフィアを加えます。添付の神経球を広げ、単層（ 図2B）として成長します。
  8. 注意深く培地を除去した後、室温で15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて細胞を固定し、その後、室温で5分間、PBSで二回洗浄します。プレートを1~2ヶ月間4℃で保存することができます。
    注：（神経幹/前駆細胞マーカー）ネスチンに対して免疫染色を行い、NSC培地中で神経幹/前駆細胞と分化培地中で分化した細胞を可視化するために、βチューブリンIII（TUJ1モノクローナル、ニューロンマーカー）、GFAP（グリア線維酸性タンパク質、星状細胞のマーカー）、及びO4（オリゴデンドロサイトマーカー）（ 図2B-E）。 （Arl13bに対する一次CIを免疫染色を行い、繊毛を分析するためにリア・マーカー）とGpr161（毛様体GPCR）（ 図3）。
  9. スライドガラス上に溶液を取り付けるとカバーガラスをマウントします。過剰の溶液を除去するためのスライドガラスを傾けます。

ニューロスフェアにおける繊毛形成の3分析

  1. 免疫染色によって、無傷のニューロスフェア中の細胞を分析するために、培養培地の転送1mLを1.5mlチューブに複数のニューロスフェアを含有し、8分間、500×gでスピンダウン。 15分間、培地を除去した後、4％（PFA）で球体を固定し、PBSで洗浄します。 、8分間、500×gで球をスピンダウンし、上清を除去し、そして4℃で30％スクロースと球O / Nインキュベートします。
  2. 1mLのチップを使用して上清を捨て、カット1mLのチップを用いたOCT溶液の500μLを加えます。 10月が粘性であるように、開口部を広くする先端の縁を切りました。
  3. 使い捨てプラスチック凍結モールド（10ミリメートル×10ミリメートル×5ミリメートル）にニューロスフェアを含有するのOCT溶液を移します。
  4. メートルをフリーズ少なくとも15分間ドライアイス上の古いです。
  5. （オプション）実験を停止し、最大1年間-80℃の冷凍庫内の金型を格納します。
  6. クライオスタットを持つセクションをカット。セクションの厚さは15〜30ミクロンでなければなりません。
  7. ニューロスフェア中の一次繊毛を視覚化するために、Arl13bに対する免疫染色（ 図4）を実行します。

4.文化とニューロスフェアと接着NSCのパッセージ

  1. パッセージの神経球球のサイズは100〜200μmの間にありながら、ニューロスフェアは、（300ミクロン以上）大きすぎるとき、彼らは実験のための理想的ではありません。
  2. 1mLのチップを使用して、50mLのチューブに神経球を移し、8分間、500×gでスピンダウン。
  3. アスピレータを用いて上清を捨て、PBS中の0.05％トリプシンEDTAの500μLを添加し、37℃で5分間インキュベートします。トリプシンの量は、球の数によって異なります。
  4. 血清中の500μLを加え、穏やかにパイプ1mLの先端とT 20回。
  5. 8分間500×gでスピンダウン。 1mLのチップを使用して上清を捨て、基礎培地1mLを加えます。
  6. （オプション）細胞残屑や非解離神経球が見られる場合、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞を渡します。
  7. 通路NSC培地中10,000細胞/ cm 2の密度で10cmディッシュ中の細胞。細胞は、一週間後の次の通過のための準備が整います。
  8. （任意）50万1,000,000細胞/ mL懸濁液を生成するために、凍結培地追加、細胞を凍結します。クライオ冷凍容器を用いて細胞を凍結します。解離していないの神経球はまた、凍結することができます。
  9. 接着培養のために、1~2日間NSC培地、および培養とPLL-ラミニン被覆カバースリップ上に50,000細胞/ cm 2に細胞をdillute。

5.飢餓と繊毛の分析

  1. 飢餓培地（ 表1）を調製。
  2. 1~2日、最初のPL後別のウェル（実験）で解離、1つのウェル（対照）におけるNSC培地に変更し、飢餓培地後の接着細胞のating。
  3. 文化24時間接着細胞。
  4. RTで15分間、PBS中の4％PFAで細胞を固定し、室温で5分間ずつPBSで2回洗浄します。
  5. （オプション）実験を停止し、1~2ヶ月間、4℃でPBSでカバーガラスを含む24ウェルプレートを格納します。
  6. 7、50を染色するための免疫プロトコルを実行します。
  7. マウントソリューションを使用してカバースリップをマウントします。暗所でRTでスライドガラスO / Nを乾燥させます。
  8. 必要な倍率の複合顕微鏡で画像を取得します。同行のソフトウェアを使用して制御顕微鏡、カメラ、および目的（40X / 1.3油および63X / 1.4油）を、使用してください。 0.5〜0.8μmの間隔（ 図5）において十分なZ-セクションを取ります。
  9. で毛様体局在の定量分析のために接着細胞を、DAPIチャネルに調べることによってコンフルエント細胞と3-8の連続するフィールドからの画像スタックを取得します。 ImageJの/フィジーを使用して、プライマリ繊毛の数を定量化します。一般的に、ImageJのプラグインで「セルカウンタ」ツールを使用する> GPCR陽性繊毛で細胞をカウントするためのダイアログボックスを分析します。画像のスタックからの最大突出はまた、目的をカウントし、エクスポートするための同一の実験からのすべての画像のためのImageJ / Fiji.Use同様の画像輝度及びコントラストパラメータからエクスポートすることができます。

ニューロスフェアの6トランスフェクション

  1. 24時間カバーガラスに解離細胞を接着。 24ウェルプレートの単一のウェルに500μLNSCの培地中で、典型的には75,000との間の150,000細胞の細胞密度を使用します。
  2. 5秒間ボルテックスすることにより低減血清培地および0.5 mLのマイクロチューブにトランスフェクション試薬の1.5μLの25μLを混合します。
  3. 別個0.5mLのmicrotubにエンドトキシンフリープラスミドDNA2.5μgのを追加eは減少血清培地の25μLを含有し、5秒間ボルテックスして混合します。
  4. DNAを含む第二のマイクロチューブにトランスフェクション試薬の1μLを添加し、5秒間ボルテックスすることにより混合します。
  5. DNAを含有するチューブから最初のマイクロチューブに混合物を添加し、ピペッティングにより混合します。
  6. RTで10〜15分間混合物をインキュベートします。インキュベーション後、穏やかNSC媒体の上面（500μL/ウェル）でウェルにトランスフェクション混合物を滴下して加えます。
  7. 培地（NSC培地）又は飢餓培地（500μL/ウェル）を制御するために媒体24時間後、トランスフェクションを変更します。
  8. 24時間後に4％PFAに培地を交換することによって細胞を固定し、免疫染色を行います。典型的には、10％のトランスフェクション効率までこのプロトコルを使用して得られます。

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結果

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週間NSC培地中のSVZからの細胞をプレーティングした後、浮遊ニューロスフェアは、（ 図2A）が観察されました。球のサイズは、50と200μmの間で変化しました。球が神経幹/前駆細胞に由来するものであったかどうかを調べるために、ニューロスフェアは、2日間PLL-とNSC培地中のラミニンでコーティングしたカバーガラス上にプレーティングしました。これらはその後、神経幹/前駆細胞マーカー、ネスチンに対して免疫染色しました。二日は球がカバースリップに接続すると、細胞の単層として成長できるようにするために必要でした。細胞の単層は、ネスチン（ 図2B）について陽性でした。ニューロスフェアの分化能を調べるために、我々は、7〜10日間PLL-の上のセクション2で説明したステップと解離せずに分化培地中でラミニンコーティングしたカバースリップを、以下にそれらをメッキ。それは差別のために少なくとも1週間かかります。ニューロスフェアは、カバースリップに取り付けられ、拡張しますedは、細胞の単層として成長します。我々は、細胞を固定...

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ディスカッション

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ここでは、成体マウスのSVZからニューロスフェア培養を生成し、維持するための方法について説明します。次のように文化に関するいくつかの適切なポイントがあります。 200ミクロン - まず、球の大きさは、通常50の間です。ニューロスフェアは、直径がより大きく300μm以下を取得し、私たちの経験では、継代のための最適な時間が見逃されています。これらの大きな球は、コア内の死細胞を含んでいます。ニューロスフェアは、一般的に神経幹/前駆細胞を研究するために使用されているように、第2、これらの細胞の幹細胞性を維持するために、EGFとFGF-基本（のbFGF）を使用することが重要です。したがって、例えばFBS等の分化を誘導する因子は、ニューロスフィアのメンテナンス時に避けなければなりません。 10％FBSがアストロサイト47への神経球を区別することができることが示されています。第三に、神経分化の程度は、マウスの年齢に依存する場合があります。 1は、神経球からより多くの神経分化を希望する場合は、若いマウス（生後ダY 0）を使用することができます。新しい文化を開始する場合には第四に、神経球の分化能を調べるため...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M.の研究室での作業は、CPRIT(R1220)とNIH(1R01GM113023-01)からの募集助成金によって賄われています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12mm丸型カバーガラスフィッシャーブランド12-545-80 
24ウェルプレートFalcon353047
4% パラホルムアルデヒド (PFA)Affymetrix19943
50 mL チューブFalcon352098
95 mm x 15 mm シャーレ、滑り式蓋フィッシャーブランドFB0875714G10 cm ディッシュ
70 & マイクロ;m cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), 無血清ThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
極低温バイアルコーニング430488
DAPIシグマD9542-10MG
ウシ膵臓からのデオキシリボヌクレアーゼ IシグマD5025-15KUドナーゼ I
ジメチルスルホキシドシグマD8418-100MLDMSO
使い捨てビニール検体金型Sakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 10X、修飾、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし、液体、滅菌ろ過、細胞培養に適していますシグマD1408-500MLDPBS
デュモン #5 鉗子ファインサイエンスツール11254-20
ウシ胎児血清 (FBS)シグマF9026-500ML
フルオロマウント-G ソリューションSouthern Biotech0100-01埋込ソリューション
GFAPDAKOZ0334
ヤギ抗マウスIgG1二次抗体、Alexa Fluor 555 コンジュゲートサーモフィッシャーサイエンティフィックA-21127ヤギ抗マウスIgG1、Alexa 555 二次抗体
ヤギ抗マウスIgG2a二次抗体、Alexa Fluor 555 コンジュゲートサーモフィッシャーサイエンティフィックA-21137ヤギ抗マウスIgG2a、Alexa 555二次抗体
Gpr161自家製N/A
ヒト bFGFシグマF0291FGF
血球計算盤ハウサー サイエンティフィック0.100 mm 深さ改良型 ノイバウアー
アイソセシアヘンリー・シャインNDC 11695-0500-2イソフルオラン
ラミニン エンゲルブレス・ホルム・スウォーム肉腫 基底膜シグマL2020ラミニン
L-グルタミン (200 mM)SigmaG7513
リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬サーモフィッシャーサイエンティフィックL3000
フロスティ・ナルゲン氏 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
ポリ-L-リジン (PLL)SigmaP4707
組換えヒトEGFタンパク質、CFRおよびDシステム236-EG-200EGF
はさみファインサイエンスツール14060-10
スーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィッシャーサイエンティフィック12-550-15
トリトンX-100ラッド161-0407
トリプシン-EDTA溶液 (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-well plate, with lidd flat-bottom ultra-low attachment surface polystyrene, sterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1
スライド バイオ

参考文献

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