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方法論記事

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

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DOI:

10.3791/55321

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2017年3月1日

 , 
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

この記事について

サマリー

我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。

要約

SJL / Jマウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、再発寛解型多発性硬化症（RRMS）のモデルです。運動機能障害を記述する臨床EAEスコアは、脊髄の免疫媒介炎症の基本的な読み出しです。しかし、スコアおよび体重は脳の炎症と視神経炎のin vivoで評価することができません。後者は、約2/3のMS患者の早期かつ頻繁な症状です。ここでは、 インビボイメージングシステムを用いて、生きているマウスにおける生物発光およびEAEの視神経炎を誘発評価するための近赤外ライブイメージング、脳の炎症、及び血液脳関門（BBB）破壊するための方法を示します。酸化酵素によって活性化された生物発光基質は、主に視神経炎を示しました。信号は特異的であり、臨床スコアを並列薬の効果や病気の時間のコース、の可視化を可能にしました。 vasculatur内に留まったペグ化蛍光ナノ粒子長時間eがBBBの完全性を評価するために使用しました。近赤外イメージングは​​、疾患のピーク時BBB漏れを明らかにしました。信号は、目の周りの最も強かったです。マトリックスメタロプロテアーゼのための近赤外基質は、EAE誘発炎症を評価しました。自家蛍光は、定量化のためのスペクトルアンミキシングを必要とし、信号を妨害しました。全体として、生物発光イメージングは​​、EAEに関連する視神経炎および薬物の効果を評価するための信頼性の高い方法であり、シグナルの特異性、堅牢性、定量化の容易さ、及びコストの観点から近赤外の技術よりも優れていました。

概要

多発性硬化症は、自己免疫を介した脳と脊髄のミエリン鞘の破壊によって引き起こされます1。女性では年間10万人あたり約3.6件、男性では約2.0件の全体的な発生率を持つMSは、外傷性損傷に次いで若年成人の神経障害の2番目に多い原因です2,3。この疾患の病理は、遺伝的および環境的要因によって寄与されています4ですが、まだ完全には理解されていません。自己反応性Tリンパ球は中枢神経系に入り込み、炎症カスケードを引き起こし、脳、脊髄、視神経の白質に限局性浸潤を引き起こします。ほとんどの場合、これらの浸潤は最初は可逆的ですが、再発の数とともに持続性が増します。この疾患の病理を研究するために、多くのげっ歯類モデルが開発されています。SJL/Jマウスの再発寛解型EAEとC57BL6マウスの一次進行性EAEは、最も一般的なモデルです。

運動機能障害の程度を表す臨床EAEスコアと体重は、EAEの重症度を評価するためのゴールドスタンダードです。これらの臨床徴候は、脊髄における免疫細胞の浸潤とミエリン破壊の程度と一致し、ヒトにおける薬物治療の有効性を中等度に予測します 5.ただし、これらの兆候は主に脊髄の腹側線維路の破壊を反映しています。現在、生きたマウスのin vivo脳浸潤と視神経炎を評価するための、簡単で非侵襲的、信頼性、再現性のある方法はありません。

in vivoイメージングは、動物実験のR配置、R教育、およびRの精密化を主張するRussel and Burch（1959）の3つの「R」原則と一致しています6、なぜならイメージングはいくつかの時点で1匹の動物の読み出しを増やし、全体の数を減らすことを可能にするからです。現在、炎症またはミエリンの状態は、主に免疫組織化学、FACS分析、またはさまざまな分子生物学的方法7を介してex vivoで評価されており、すべて特定の時点で安楽死させたマウスが必要です。

皮膚、関節、血管系の炎症を評価するために、多くのin vivoイメージングシステムプローブが開発されています。この技術は、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)8、およびカテプシン9またはシクロオキシゲナーゼ2を含む組織ペルオキシダーゼによる生物発光または近赤外蛍光基質の活性化に依存しています。これらのプローブは、主に関節炎またはアテローム性動脈硬化症のモデルで検証されています9,10。カテプシン感受性プローブは、EAE11の蛍光分子断層撮影イメージングにも使用されています。MMP、特にMMP2とMMP9は、EAEのプロテアーゼ媒介性BBB破壊に寄与し、免疫細胞浸潤部位でアップレギュレーションされます12、これらのプローブがEAEイメージングに有用である可能性を示唆しています。ペルオキシダーゼまたはカテプシンベースのプローブについても同じことが言えます。技術的には、頭蓋骨や脊椎が生物発光信号や近赤外線信号を吸収するため、脳や脊髄の炎症のイメージングは大幅に困難になります。

炎症指標に加えて、ミエリンに特異的に結合し、髄鞘形成13の定量化を可能にする可能性のある蛍光化学物質が記載されています。近赤外蛍光プローブである3,3'-ジエチルチアトリカルボシアニンヨウ化物(DBT)は、有髄線維に特異的に結合することがわかり、原発性髄鞘形成欠損のマウスモデルおよびキュプリゾン誘発性脱<髄 class='xref'>14で定量的ツールとして検証されました。EAEでは、DBTシグナルはむしろ増加しており、これはミエリン繊維の炎症を反映しています5。

EAEとMSのさらなる特徴は、BBBの分解であり、その結果、血管透過性が増加し、血液細胞、細胞外液、および高分子がCNS実質に血管外漏出します。これは浮腫、炎症、乏突起細胞の損傷、そして最終的には脱髄につながる可能性があります15,16。したがって、蛍光色素標識ウシ血清アルブミン5などの蛍光プローブを使用してBBBリークを可視化することは、通常、血液から組織に非常にゆっくりと分布するため、EAEの評価に役立つ可能性があります。

本研究では、EAEのさまざまなプローブの有用性を評価し、最も信頼性が高く堅牢な生物発光技術の手順を示しました。さらに、MMP活性とBBBの完全性に関する近赤外線プローブの長所と短所についても説明します。

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プロトコル

SJL / Jマウスにおける1 EAEの誘導

  1. マウス
    1. 11週齢の雌SJL / Jマウスを使用し、それらは約7日間の実験室に馴化することができます。グループあたりのn = 10匹のマウスを使用してください。
    2. 薬物の効果を評価するために、免疫後3又は5日出発連続飲料水を介してまたは餌ペレットを介して制御グループの薬物およびプラセボを投与する（群あたりn = 10）。疾患のピーク時には、牛乳または3％の砂糖水に浸したコーンフレークと薬またはプラセボを投与します。
  2. 予防接種材料
    1. 完全フロイントアジュバント（CFA、熱殺菌された結核菌H37 Ra）が2バイアル（各5μg）とエマルジョン中の抗原からなるEAE誘導キット（プロテオリピドタンパク質のペプチド、PLP139-151、1mg / mlのエマルジョン）を使用します凍結乾燥した百日咳毒素（PTX）の。
    2. すなわち、<; 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBSにPTX（2μg/ ml）を溶解させ/ em>の）、各PTXチューブにPBSの1.5 mLを加え、よく混ぜ、同じピペットチップで除去し、50 mLチューブ中の1mLのPBSに追加します。よく混ぜます。
  3. 免疫
    1. 尾の基部に、2箇所にそれぞれ100μL、両方をPLP / CFAの皮下に注入します。背中上部または首の皮膚内の任意の免疫反応が頭のイメージングおよび脊髄の障害になるので、首の後ろに注入しないでください。
    2. 免疫後2時間および24時間で二 - 、二回マウス当たり、腹腔内（ip）第1のPTXの100μLを注入します。
    3. 対照マウスでは、PLPなしPLPなしCFA（100μLの2箇所）を加えたPTXを注入します。
  4. マウスは免疫後の取り扱い
    1. 7日目に一日おきにマウスを計量し、その後、毎日それらの重量を量ります。
      注：マウスは約1失う - EAE間に体重を2g。減少は、EAEの発症をマーク。
    2. 7日目アコードから毎日臨床症状を評価します運動機能に明らかな変化を、0.5スコア：標準スコアリングシステムにる（ すなわち、スコア0ない尾の先端麻痺を;スコア1：完全な尾の麻痺を、1.5スコア：1または両方の後肢の軽度の不全麻痺;スコア2：後ろ足の深刻な麻痺;スコア2.5：1後肢の完全麻痺;スコア3：両方の後肢の完全麻痺; 3.5スコア：後肢と1前脚の麻痺の完全な麻痺が3.5以上のスコアのためにマウスを安楽死させます> 12時間。
  5. EAEコースや撮影時
    1. 免疫後12 - マウスは10日目の周りに発生するスコア> 1に達したときに、疾患の発症時に最初の撮影を行います。
    2. 3日 - 初期症状が発症する1または2日後に到達され、1持続しますピーク時の第2の撮像を実行します。
      注：その後、マウスは完全に7〜10日以内に回復します。インターバル中のイメージングは​​、依然として、血管の漏れを示すことができますしかし、炎症の指標が負でなければなりません。

2.生物発光と視神経炎と脳炎症の近赤外イメージング

  1. イメージング・システムのセットアップ
    1. 生物発光と近赤外信号の解析を可能にする機器をin vivoイメージングに行います。
    2. 全てのイメージング手順の間に2.5％イソフルラン麻酔 - 2の下にマウスを保管してください。
    3. 中央のガス供給を使用して、装置内で互いに横に位置1または2匹のマウス。中心部の上部脊椎を置きます。
    4. 薬の効果の評価は、ペアを比較するために、同時に2匹のマウス、グループごとに1つを使用してください。これは、生物発光イメージングのために重要です。
    5. 黒い布を用いた免疫化の部位を遮蔽し、マウス/マウスの正確な位置決めを評価するために写真とベースライン画像を取ります。すべての画像のためのカメラに6.5 cmの距離でB-フォーカスを使用してください。
  2. 生物発光炎症プローブの注射とイメージング
    1. in vivoイメージングシステム設定を使用：8ビニングエピBLIは、エムがオープンフィルタリング、例のフィルタブロック、FSTOP 1、B = 6.5センチメートル、広告露出120秒を集中。ベースライン画像を取ります。
    2. すぐに使用できる化学発光試薬（40ミリグラム/ mL）を100μLの腹腔に注入します。注射器を充填する前によく混ぜます。
    3. 生物発光画像5、10、および注射後15分をキャプチャします。生物発光ピークの時間経過は、動物間で異なります。
      注：ピークは5発生します - 注射後の10分。 15分での減少はそれ以上の画像が必要とされないことを示しています。異なる時間のコースのためにマイナーなバイアスを排除するためにコントロール群と処置群のマウスのペアを使用してください。
    4. 実験に関連する説明を記入します。自動的にポップアップダイアログボックスを観察し、そのようなマウス系統、性別、時刻、プローブ注射、グループなどの時間などの情報を含みます。ファイルのすべての中のOを保存neのフォルダ;彼らは、時間タグとすべての記述があります。
  3. BBBの整合性のための近赤外蛍光ナノ粒子の注射とイメージング
    1. B-フォーカス（：6.5センチメートル距離）に近赤外落射蛍光イメージングを使用してください。ペグ化蛍光ナノ粒子の励起/発光最大値は690分の675 nmです。 Ex640 / Em700およびEx675 / Em720で、異なる波長で2つの画像をキャプチャ。 8ビニング2-のエクスポージャーを、使用、およびFSTOP 2は、ベースライン画像を取ります。
    2. 尾静脈を介してペグ化された蛍光赤外線ナノ粒子の70μLの静脈注入し、マウスを3時間と、上記の設定を使用して、注射後24時間を想像してみてください。注射器を充填する前に、溶液をよく混ぜます。
    3. シグナルの特異性を評価するために必要とされる対照マウスにおける0.9％塩化ナトリウム、注射。
  4. 注入及びMMP活性の近赤外蛍光プローブのイメージング
    1. 剃るか、頭を脱毛するとuベースライン画像を撮影する前に、慎重に1日PPERの脊椎領域。皮膚が負傷してはいけません。
    2. B-フォーカス（：6.5センチメートル距離）に近赤外落射蛍光イメージングを使用してください。 MMPの活性化プローブの励起/発光最大値は700分の680 nmです。 Ex640 / Em700およびEx675 / Em720で、異なる波長で2つの画像をキャプチャ。 8ビニング1-sの露出を、使用、およびFSTOP 2は、ベースライン画像を取ります。
    3. それは、10匹のマウスのために十分になるようにすぐに使用できる溶液（1×PBS中で20ナノモル/ 1.5 mL）を1.5 mLチューブに1×PBSの200μLを加えます。注射器を充填する前によく混ぜます。
      注：提供するボリュームは、いくつかのボリュームがシリンジ充填および注入中に失われていることを考慮に入れていません。
    4. 24時間イメージングの前に尾静脈を介してプローブivの150μLを注入します。シグナルの特異性を評価するためにのみ対照動物にPBSを注入します。
    5. 注射後24時間の時点で、少なくとも二つの波長、Ex640 / Em700および実施例675 / Eでエピ-FLの画像を撮影しますM720は、設定で（8、およびFSTOP 2ビニング1-sの露出、フォーカスB）上記で説明しました。
      注：2波長の使用は、非特異的シグナルを差し引くことによって、スペクトルアンミキシングを可能にします。

3.画像の解析

  1. 生物発光分析（BLI）
    1. それを開くためにソフトウェアをダブルクリックします。
    2. 上部のメニューバーで、実験のフォルダのディレクトリに移動し、それを選択し、 ファイルブラウザのアイコンをクリックしてください。これは、テーブル内のフォルダ内のすべてのファイルを開きます。
    3. 実験に関連する記述を示す列を設定します。
    4. 品質管理のために、EAE信号の特異性を確認するために、EAEおよび/またはナイーブマウスの症状がなく、非レスポンダーマウスのファイルをダブルクリックします。
      注：非応答マウスではないナイーブマウスの信号と最小の信号があってはなりません。
      1. プロの注入前のベースライン画像をチェック信号の特異性のさらなる対照として、各マウスについてです。それが負でなければなりません。
    5. 画像を選択するには、最初のEAEマウスの最初のファイルをダブルクリックし、生物発光強度（LUTバー範囲）と局在を確認してください。すべての画像を一枚ずつ確認してください。各マウスの最安強度（ すなわち 、各マウスのための3つの画像のうち、2を保持）を使用してファイルを閉じます。
    6. 画像調整と輸出
      1. 定量化される最初のファイルをダブルクリックします。新しいウィンドウポップアップを確認します。 「オプション」（上部メニュー）の下では、各画像に表示するラベルをカスタマイズします。
      2. 右側のツールパレットでは、に行く「画像調整」。デフォルトでは、最小値と最大強度は、「オート」に設定されており、虹の擬似カラーで表示されています。必要に応じて設定を変更するには、「手動」を選択します。
        注：たとえば、エクスポートされたすべての画像が簡単に匹敵する同一のLUTバー（同一の最小値と最大値）を有していてもよいです。最小値と最大値の調整は、定量的な結果には影響しません。
      3. 画像のエクスポート、選択PNG形式、ディレクトリ、およびイメージ名をクリックして
    7. 関心領域の定量化（ROI）
      1. ツールパレットで「ROI」ツールに移動します。 ROI法（円、長方形、自動、また​​はフリーハンド）とROIの数を選択します。画像ウィンドウでポップアップROIウィンドウを確認します。
      2. マウスを使用して、サイズと位置を調整します。自動ROIツールを使用する場合は、すべての画像に対して同一のROIのしきい値を使用します。 ROIのサイズと位置を手動で（ 例えば、円形のROI）が定義されている場合は、すべての画像に対して同一の領域を使用してください。
      3. RO.I.が新しいウィンドウポップアップを観察し測定する」をクリックします。列をカスタマイズする（ 例えば、ファイル名、動物番号、グループ、実験、面積、総カウント、平均カウント、SD数、minとmaxはカウント、面積、時間ポイント、プローブ注入など ）の時間。カスタマイズされた設定を保存します。場合には、再ADYは、全てます（Ctrl + A）を選択し、スプレッドシートに表をコピーして貼り付けます。
      4. 代わりにROIを持つPNGなどの画像をエクスポートします。保存した画像ファイルを閉じます。
    8. 定量化する必要があるすべての画像ファイルのために - （3.1.7 3.1.6ステップ）の手順を繰り返します。スプレッドシートにすべてのROIの定量化をコピーします。
      注記：ここでは、結果等のグループ、時刻によってソートされ、統計的に分析することができます。統計分析のためのROIにおける生物発光シグナルの合計カウントを使用してください。
  2. 蛍光ナノ粒子の近赤外（NIR）分析
    1. ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。
      注：これは、定量的な結果には影響を与えません。
    2. 視覚信号の特異性を評価するために、EX /エム720分の675及びEX /エム700分の640で撮影した画像を比較します。
    3. 定量分析のためにEX /エム720分の675で撮影した画像を使用してください（最大励起：680 nm）を。自動ROIツールを使用することができるためのROIを規定します。自動ROIのしきい値を調整し、すべての画像のためにそれを使用しています。関心領域内の総放射効率を定量化する（ステップ3.1参照）。
  3. プロテアーゼ感受性プローブの近赤外（NIR）分析
    1. ソフトウェアのコントロールを使用して、画像のしきい値を調整します。
      注：これは、定量的な結果には影響を与えません。自家蛍光のスペクトルアンミキシングを行います。アンミキシングツールはイメージリビングに実装されます。自動アンミキシングは、自家蛍光画像などの特定および720分の675としてEX /エム700分の640を使用しています。
    2. 混合されていない画像を選択し、上記のように、関心領域を定義します。定量的および統計分析のためのROI内の総放射効率を使用してください。

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結果

視神経炎の生物発光の時間コース

炎症プローブの生物発光信号は、目の周りの最も強かったと視神経炎でEAEマウスでのみ発生しました。信号は非EAEマウスや炎症プローブを注入していないマウスでもないに発生しました。マウスが回復したときに信号が消失しました。したがって、信号は、視神経炎に特異的であり、信号のピークが臨床EAEスコアのピークに匹敵します。 図1は 、EAE誘導後10日目および14で撮像されたSJL / Jマウスの2つの例を示しています。生物発光シグナルは、10日目で最高だったとマウスが回復し始めたときに姿を消しました。臨床スコアの時間コースは生物発光シグナル（例-1）またはスコアの前に（例-2）下落の消失と一致しました。

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ディスカッション

現在のビデオは、SJL / JマウスにおけるEAEのin vivoイメージングにおける生物発光と近赤外蛍光のための技術を示しています。我々は、炎症感受性プローブを用いた生物発光イメージングは​​、主に視神経炎を示し、そして定量化はEAEの重症度の臨床評価および薬物の効果と一致することを示します。信号は脊柱によって吸収されるためしかし、生物発光イメージング法は、おそらく、EAEの症状17の主要部位である腰部脊髄の炎症を検出することができませんでした。

近赤外イメージングは​​より敏感であるが、生物発光発生しません自己蛍光、との高い干渉を犠牲にして。 NIR急速に変化する信号強度を持つ時系列のための好ましい方法になります - （5分2）、BLIと比較して - （2の1）NIRの露光時間ははるかに短いです。

との重要なステッププロトコルおよび技術の限界で

予防接種のサイトの信号は、EAEにおける脊髄イメ...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

この研究はドイツ学術協会（CRC1039 A3）と研究助成プログラムヘッセン州の「LandesoffensiveツアEntwicklung wissenschaftlich-ökonomischerExzellenz」（LOEWE）、トランスレーショナル医学・薬理学TMPとそうでないクローネ-フレゼニウス財団研究センターによってサポートされていました（EKFS）、研究研修グループトランスレーショナルリサーチイノベーション - ファーマ（TRIP）。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AngioSpark-680Perkin Elmer, Inc., Waltham, USANEV10149イメージングプローブ、ペグ化ナノ粒子、血液脳関門完全性のイメージングに有用
MMP-sense 680Perkin Elmer, Inc., Waltham, USANEV10126イメージングプローブ、マトリックスメタロプロテイナーゼによって活性化可能、炎症のイメージングに有用
XenoLight RediJect Inflammation ProbePerkin Elmer, Inc., Waltham, USA760535酸化酵素によって活性化可能なイメージングプローブ、炎症
PLP139-151/CFAエマルジョンHooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123EAE導入キット
Pertussis ToxinHooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123EAE導入キット
IVIS Lumina SpectrumPerkin Elmer, Inc., Waltham, USA生物発光および赤外線イメージングシステム
LivingImage 4.5 ソフトウェア Perkin Elmer, Inc., Waltham, USACLS136334IVIS analysis software
IsofluraneAbbott Labs, Illinois, USA26675-46-7麻酔
のイメージングに有用 薬

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