磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

サマリー

彼らは機械的張力を送信し、組織の恒常性と開発に関与するシグナル伝達経路を開始するように、細胞表面の癒着は、メカノの中心です。ここでは、接着受容体へのリガンドで被覆された磁性マイクロビーズと力のアプリケーションを使用して、張力に応答して活性化される生化学的経路を切開するためのプロトコルを提示します。

要約

機械受容細胞表面接着複合体は、細胞がその周囲の機械的特性を感知することを可能にします。最近の研究では、接着部位での力感知分子、および系統特異的遺伝子の発現を調節し、表現型出力を駆動力依存性転写因子の両方を同定しました。しかし、生化学的経路に機械的張力を変換するシグナル伝達ネットワークは、とらえどころのないままです。細胞表面受容体に適用される機械的張力の際に係合したシグナル伝達経路を探索するために、超常磁性マイクロビーズを使用することができます。ここでは、細胞表面接着タンパク質に力を適用するために磁気ビーズを使用するためのプロトコルを提示します。このアプローチを使用して、様々な生化学的アプローチによってのみならず力依存性細胞質のシグナル伝達経路を調査することが可能であるが、リガンドでコーティングされたビーズに付着した接着複合体の磁気分離によってリモデリングを接着します。このプロトコルは、リガンド - コの準備を含んでいます超常磁性ビーズをated、と定義する引張力の適用は、生化学的分析が続きます。さらに、我々はインテグリンベースの接着に適用し、そのテンションを実証するデータの代表的なサンプルを提供する接着改造をトリガし、タンパク質チロシンリン酸化を変化させます。

概要

後生動物では、機械的張力は、増殖、分化および生存^1、2などの細胞プロセスの無数の調節を介して組織発達および恒常性を指示します。機械的張力は、細胞外マトリックスから生じ得るか、接着性細胞、サンプル細胞外マトリックス上に引っ張ると緊張に敏感な分子を介してその剛性をプローブアクトミオシン収縮機構を介して、それらの細胞外環境を生成することができます。張力に応じて、機械受容接着タンパク質は、複雑なシグナル伝達カスケードを誘発する立体配座の変化を受けます。次に、これらのシグナル伝達経路は、細胞外環境への細胞の挙動を調節、増殖、分化および生存を包含するmechanoresponseを調整します。このようなプロセスはすぐにメカのループにフィードバックするために短期的な期間（数秒から数分）で決済することができます機械受容の構造を変更することによってnotransduction。例えば、インテグリンベースの接着は、Rho GTPアーゼによって媒介される細胞骨格リモデリング^3、4、5を介して張力に応じて強化します。並行して、他のシグナル伝達経路は、最終的に細胞の運命^6に影響^を与える遺伝的プログラムを制御するための時間と日にわたって活性化されます。 、多くの研究は、細胞の決定論と病気の発症^1、2上にマトリックス剛性の効果を強調しているのに対し、接着媒介メカノの正確な分子メカニズムはまだとらえどころのないまま。

様々なアプローチは^、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-tensionセンサ^7、流れシステムを含む細胞挙動に対する細胞発生力又は外力の影響を研究するために開発されていますLASS = "外部参照"> 8、コンプライアント基板^9、磁気ピンセット、光ピンセット¹⁰と、原子間力顕微鏡^{（AFM）11。}ここでは、特定の接着レセプターに適用引張力に応答してメカノ経路を特徴付けるために超常磁性ビーズを使用してプロトコルを提示します。超常磁性ビーズを磁場中に置かれたときに可逆的に磁化粒子です。いったん特定の受容体のリガンドでコーティングされ、これらのビーズは、細胞外加力の影響を研究するための強力なツールを提供します。 ^17、大部分は接着細胞の生化学的解析を容易にするための利点を提示する^-この方法は、いくつかの研究^3、5、12により確認されています。生化学分析に続いて同様のコラーゲンでコーティングされた磁気ビーズを使用して、初期の作品は、の増加を報告しましたテンション^5、18、19に応答して、タンパク質チロシンリン酸化およびRhoAの活性化。以下に記載される方法はまた、インテグリン³の張力から下流のシグナル伝達経路を特徴づけるために、フィブロネクチン（FN）でコーティングされたビーズを使用されています。本研究では、Guilluyら。テンションがインテグリン接着複合体への2つのグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、LARGとGEF-H1の募集を通じてのRhoAを活性化することを示しました。それ以来、他の研究は、GEF-H1は、ここに記載の方法のロバスト性を実証し、異なる方法^20,21を用いて、細胞生じる張力に応じて接着複合体に動員されることを示しました。その結果、活性化されたRhoAは、細胞骨格の再構築を介して、接着強化を促進することが示されました。このシステムはまた、Tの張力を探索するために使用されました細胞/細胞接着レセプターO。インテグリン関連する接着複合体¹²と同様にビンキュリン募集の増加を誘導したE-カドヘリンの細胞外ドメインで被覆した磁気ビーズ上に力を加えます。コリンズらは、PECAM-1に張力のアプリケーションは、インテグリンとRhoAの活性化^13を促進^することを観察しました。磁気ビーズを使用して、別の実験的なアプローチは、単離された核の張力の研究です。 nesprin-1核エンベロープタンパク質に対する抗体でコーティングされたビーズを使用して、核エンベロープ複合体は、それらが動的機械的張力²²に応答して調節されることを示すために精製しました。これらの結果は、メカノ経路の研究では、このメソッドの力強さをサポートしています。フローまたは牽引力システムは、一般的な細胞プロセスを刺激しながら、さらに、磁気ビーズは、具体的には、受容体リガンドのいずれかを使用して、細胞接着受容体を標的と 3、または細胞表面受容体^13、15に対するモノクローナル抗体。

この方法の別の利点は、簡単なリガンドアフィニティ精製手順を介して接着複合体の単離であります。よく、細胞に対するリガンドでコーティングされたビーズの添加は接着受容体に結合し、いくつかの接着タンパク質²³の動員を誘発することが知られています。リガンドでコーティングされた磁気ビーズへの力のさらなる適用は、さまざまなテンション依存性シグナル伝達経路^4、24を仲介^する巨大分子のプラットフォームにこれらの接着複合体をオンにします。磁石を用いてビーズ濃度に続く細胞溶解は、接着プラットフォームの単離を可能にします。接着複合体を精製するために使用される他の方法は、既に付着細胞に使用されてきました。それらは、タンパク質 - タンパク質相互作用を節約するために化学的架橋を組み合わせます洗剤および剪断流または超音波処理^{20、21、25、26、27、28}による細胞溶解ステップ。最後のステップは、接着複合体を含む得られた腹側形質膜のコレクションです。これらの方法とは異なり、磁気ビーズを選択的接着受容体の特定のファミリーを標的とすることにより、細胞接着複合体の高い精製度を可能にします。磁気ビーズは、既にリガンドでコーティングされたマイクロビーズ^29、30に取り付けられた非付着性細胞内接着複合体を精製するために使用されてきました。力は、短い持続時間（分秒）に適用される模倣生物学的状況下に記載の方法。したがって、精製された接着複合体の分子組成の両方を調査するための強力なツールを提供し下流の機械受容シグナル伝達経路。

ここでは、接着表面タンパク質に引張力を適用するために磁気ビーズを使用するための詳細な実験プロトコルを提示します。永久ネオジム磁石は、培養皿の表面の上に配置されます。シングル2.8μmの磁気ビーズ上の力は一定（約30〜40 ^PN）31となるように、磁石の磁極面は6ミリメートルの高さに配置されています。張力刺激の持続時間は、対象の分子と活性化のその時間スケールに応じてオペレータによって決定されます。細胞は、最終的に接着複合体は、磁石を用いてビーズ分離によって精製され、生化学分析が処理され、溶解されます。このプロトコルは、リガンドでコーティングされた超常磁性ビーズの準備、および生化学的分析に続いて、磁石を通して緊張のアプリケーションが含まれています。さらに、当社は、張力がインテグリンベースのADHに適用されることを実証するデータの代表的なサンプルを提供しますesions接着リモデリングを誘導し、タンパク質チロシンリン酸化を変化させます。

プロトコル

磁気ビーズに1リガンド抱合

注：リガンド結合は、2.8μmの直径（原液濃度が10 ⁸ビーズ/ mLで、30mgのビーズ/ mL）で超常磁性トシル活性化ビーズを使用して実行されます。以下のプロトコルを、60 mm組織培養プレートにおいて80％コンフルエンシーまで増殖させたMRC-5細胞に相当する約2×10 ⁵細胞のサンプルに基づいています。それに応じて異なる合流で異なるサイズまたは細胞のプレートを使用している場合は、ビーズおよび試薬の音量を調整します。セル当たり2ビーズを持っているために、超常磁性ビーズの量を使用してください。したがって、4×10 ⁵ビーズを60mmプレートに必要とされます。

1. 徹底的に少なくとも30秒をボルテックスすることにより、元のバイアル中のビーズを再懸濁します。 1.5 mLのマイクロチューブに小分けし再懸濁し、超常磁性ビーズ（4×10 ⁶ビーズに相当）の40μLを。
2. 磁気separatiにチューブを置きます溶液から磁気ビーズを分離するためにスタンドに。 、上清を捨て磁気分離スタンドからチューブを取り外し、1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4の中でビーズを再懸濁します。
   1. 1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウム（pH7.4）で二回繰り返して洗浄ステップ。
3. 最終洗浄後、1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4の中でビーズを再懸濁します。
4. ビーズを含有する1 mLの0.1 Mリン酸ナトリウムpH7.4に100μgのウシフィブロネクチン（FN）、または任意の他の細胞接着受容体リガンドを結合し、ピペッティングにより混合します。
5. FNまたは陰性対照のためのBSA、ポリ-D-リジンまたはアポトランスフェリンと他の特異的リガンドを置換することによって、前の手順を繰り返します。
6. 必要に応じて、ゲル分析のために、架橋効率の分析のためのリガンド溶液の10μLのアリコートを取り、濃縮Laemmliサンプルバッファーの適切な量と混合。
7. ロータに37℃で12〜24時間のためのソリューションを含むリガンドとビーズをインキュベートします。
8. 反応はせいぜい10から20秒間、超音波処理（連続39 Wの電力）を発生した後、ビーズ凝集体が現れた場合。
9. 磁気分離スタンドを用いてビーズを分離し、残りの溶液を吸引し、1mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6ソリューションを追加します。 37℃でローター上で1時間インキュベートします。
10. 1mLのPBS / 0.2％BSAをpHが7.6で二回磁石を用いた洗浄ビーズ。 1 mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6で再懸濁ビーズ。
11. 超音波処理ビーズは、凝集物はせいぜい20〜30秒間表示されます。
12. 必要に応じて、（濃縮されたLaemmliサンプルバッファーの適切な量と混合）ウエスタンブロットによって結合効率を分析するために、10μLのアリコートを削除します。
13. 1ヶ月まで4℃で細胞アッセイまたはストアビーズに​​進みます。
14. 必要に応じて、磁気ビーズにFN架橋を分析するためにクーマシーブルーでSDS-PAGEゲルおよび染色を実行します。

背に接着受容体に結合したリガンドでコーティングされたビーズ上の張力軍の適用に関する事項細胞の表面

1. 適切な成長培地（10％FCSを補充したDMEM通常4.5グラム/ LのD-グルコース）、60ミリメートルの組織培養皿上で培養接着細胞が80％コンフルエントに達するまで。
2. 調製非変性非イオン性溶解緩衝液（20mMのトリスHCl pH7.6の、150mMのNaCl、2mMのMgCl ₂を、0.1％NP-40）及びチルマイクロチューブ。
3. 1 mLのPBS / 0.2％BSAのpHは7.6でセクション1.10を再懸濁からリガンドでコーティングしたビーズをペレット化。暖かい培地と渦の5ミリリットルへのリガンドでコーティングしたビーズ溶液100μLを加えます。
4. 60mm培養皿中の培地を吸引し、5mLにビーズを補充した暖かい増殖培地を追加します。
5. ビーズが沈降し、細胞に接着することを可能にする細胞培養条件（37℃、5％CO _2）下で20分間インキュベートします。ビーズは、食作用によって内在化することができるので、20分を超えないことが重要です。
6. 必要に応じて、10倍または20倍オブジェを使用して光学顕微鏡でビーズを観察ctiveと少し取り付け、フローティングビーズとを区別するための皿を振とうすることにより、ビーズの付着を確認してください。
7. インキュベーター内で培養皿を維持しながら、上面に取り付けられたラウンド38ミリメートルのネオジム磁石と蓋のための通常の皿のふたを交換します。磁石は、蓋の下面に配置された2つの小さい13ミリメートルネオジム磁石によって適所に保持されます。磁石は非常に強力であるため、慎重に操作します。
8. 細胞培養条件で所望の時間ポイントの張力（37℃、5％CO _2）に供した細胞をインキュベートします。
9. 処理後、氷の上に皿を置き、慎重に皿から媒体全体を吸引。
10. 細胞溶解緩衝液の300μLを追加し、氷上で10分間インキュベートします。予め冷却し1.5 mLのマイクロ遠心チューブに細胞スクレーパーと転送を使用して、溶解物を収集します。
11. 磁気分離スタンドを用いた磁気ビーズをペレット化し、新しいプレチルに、全細胞溶解物を転送1.5 mLのマイクロ遠心チューブを編。さらなる分析のために-20℃でこの画分を保管してください。
12. 1mLの氷冷溶解緩衝液でビーズを3回洗浄。 、ビーズペレットに50μLのLaemmliサンプルバッファーを追加し、乾燥ブロックヒーターを使用して、95℃で5分間ピペッティングし、沸騰によって混ぜます。この画分は、単離された接着複合体が含まれています。 -20℃での生化学的解析や店舗に進みます。
13. ビーズ分離（約300μL）後に得られた全細胞溶解物から、ウェスタンブロット分析のために、50μLのアリコートを削除します。
    注：そのようなタンパク質 - タンパク質相互作用の研究（免疫沈降、GSTプルダウンアッセイ）またはGTPアーゼ活性実験などのさらなる生化学的研究のために使用することができる左250μL（溶解緩衝液を変更は、関心のGTPアーゼに応じて必要であり得ます）。

結果

技術の概略は 、 図1Aに示されています。リガンド結合後、磁気ビーズを20分間、細胞と共にインキュベートされ、その後、永久磁石は、時間の様々な量を約30〜40 pNでの引張力を適用するために使用されます。 図1bは、MRC5細胞接着受容体に結合した2.8μmのFNで被覆した磁気ビーズを示します。

細胞溶解後の超常磁性ビーズの洗浄ステップは非常に重要であり、精製度を決定します。 3回の洗浄の最小値が推奨されます。長時間露光でGADPHのイムノブロットは、接着複合体（図2a）の純度をテストすることが有用であり得ます。

FNでコーティングされたビーズは、張力に応じて接着複合体において経時的に起こるメカノプロセスを研究するために使用されました。接着複合体画分の磁気分離した後、溶解液および接着複合体画分をすることによって分析しましたウエスタンブロット。予想されたように...

ディスカッション

ここで説明する方法は、細胞表面接着受容体に張力を適用し、それらのその後の精製を可能にする簡単な方法を構成しています。しかし、いくつかのステップは、効率的な接着精製および潜在的な最適化を行うことが重要である標的接着受容体に依存して行うことができます。私たちは、ユーザーが以下の発生する可能性のある潜在的な問題を提示します。

我々は、2.8μmの直径磁気ビーズを使用するが、より大きなビーズは、4.5μmの直径として使用することができます。食作用は、30〜60分間のインキュベーションと、より大きなビーズの間に、より迅速に発生する可能性があるので、ビーズ径は、ビーズの変位が磁場^34、35の下に制限されるように、強い接着性を有する2-5ミクロンに制限する必要があります。したがって、短時間にインキュベーション時間を制限し、適切なビーズサイズを使用することが重要です。セル当たりのインキュベートビーズの数がfの量に影響を与えます単一細胞によるORCE体験。 1を効率的張力で細胞を刺激...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ネオジム磁石(60mmディッシュ上面)	K&Jマグネティックス株式会社	DX88-N52	グレード N52寸法:直径1 1/2インチ x 厚さ1/2インチ
ネオジム磁石(60mm皿下面上)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	グレード N42 寸法: 直径 1/2" x 厚さ 1/4" ブラック プラスチック コーティング
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	超常磁性ビーズ
DynaMag-2 マグネット	サーモフィッシャー	12321D
フィブロネクチン	シグマ-アルドリッチ	F1141-5MG	ウシ血漿ポリ
-D-リジン	シグマ-アルドリッチ	P7280-5MG
アポトランスフェリン	シグマアルドリッチ	T1428-50MG	ウシアポトランスフェリン
ウシ血清アルブミン	シグマアルドリッチ	A7906-500G
DMEM高グルコース、GlutaMAXサプリメント、ピルビン酸	ライフテクノロジー	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60 * 15 mm培養皿	ファルコン	353004