フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

Summary

ここでは、主なヒト T 細胞と抗原提示細胞の間の免疫シナプスの定性・定量分析の完全なワークフローをについて説明します。メソッドは、取得および時間の比較的短い期間内に数千の細胞像の評価イメージング cytometry 流れに基づいています。

Abstract

免疫シナプスは、T 細胞と抗原提示細胞 (Apc) の間の領域です。T 細胞では、表面の受容器および安定したバインディングを保証し交換を知らせる免疫シナプスに向かって蛋白質を分極しなさい。クラシック共、全反射、または超解像顕微鏡は、免疫シナプスを研究に使用されています。これらの方法は、マニュアルの画像の獲得および時間のかかる数量を必要とするので、稀なでき事のイメージングは困難です。ここでは、セルの数万人の形態素解析を可能にするワークフローについて述べる。による免疫シナプスは、Apc として汎白血球の準備で主な T 細胞や黄色ブドウ球菌エンテロトキシン B SEB ロードらじお細胞間。画像取り込みは、フローサイトメトリー、流れの cytometer と蛍光顕微鏡の機能を組み合わせたフローで顕微鏡とも呼ばれますをイメージングで実行されます。T 細胞/APC カップルを特定して免疫シナプスを分析するための完全なゲート戦略を提供しています。このワークフローにより、免疫の解析は unpurified 汎白血球準備でシナプスし、故に血の量が少なく、必要として (すなわち, 1 mL)、それは患者からのサンプルに適用することができます。重要なは、いくつかのサンプル準備、測定、および分析できる並行。

Introduction

T 細胞は適応免疫システムの主要なレギュレータ、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) のコンテキストで提示される抗原ペプチドで活性化します。完全な T 細胞活性化は、2 つの信号を必要とする抗原特異的 T 細胞受容体 (TCR) を介して能力信号/CD3 複合体とアクセサリーの受容体を介した共刺激シグナル。両方の信号の生成は T 細胞抗原提示との直接相互作用を通じて細胞 (APCs)。成熟した Apc はペプチッド MHC 複合体を介して T 細胞活性化の能力の信号を提供し、彼らの共刺激リガンドを発現 (例, CD80 や CD86) T 細胞活性化¹の進行を保証します。共刺激が引き起こすの 1 つの重要な機能は、アクチン細胞骨格^2,3,4の再配置です。皮質の F-アクチンは T 細胞の休息で比較的静的です。T 細胞刺激抗原軸受 Apc によるアクチン細胞骨格の深遠な転位につながる.アクチン ・ ダイナミクス (すなわち,高速アクチン重合・脱重合円) は、たとえばタンパク質や細胞小器官の輸送に使用される力を作成する T 細胞を有効にします。また、アクチン細胞骨格は、T 細胞と Apc は、免疫シナプスと呼ばれる特別な接触領域を開発するため重要です。免疫シナプスにアクチン細胞骨格の重要性、原因は、T 細胞^5,6,7,8のアクチン細胞骨格の変化を定量化する手法の開発に不可欠になっています^,9。

アクチン細胞骨格の援助による表面受容体とシグナル伝達タンパク質は、免疫シナプス内の分子活性化クラスター (図形) で分離されます。アクチン細胞骨格の弾力性を高める F アクチン束に受容体の結合によって免疫シナプスの安定性が保証されます。免疫シナプス形成は適応免疫応答の生成に重要であること示されています。生体内で不完全な免疫シナプス形成の有害な影響は最初からウィスコットアルドリッチ オールドリッチ症候群 (WAS) で、どのアクチン重合の病を患っている患者で実現した、免疫シナプス形成を邪魔する付随して、¹⁰.された患者さんは、アトピー性皮膚炎、重症の再発性感染症、自己免疫疾患、黒色腫に苦しむことができます。この見つけることにもかかわらず、それは現在知られていない免疫シナプス形成が健常者および免疫の欠陥や自己免疫疾患患者の T 細胞の異なるかどうか。

超解像顕微鏡や全反射、蛍光顕微鏡、共焦点を含む免疫シナプス^11,12,13,14のアーキテクチャを明らかにする使用されました。これらのシステムの高解像度と住セルイメージ投射を行う可能性は、アクチン細胞骨格の表面や細胞内タンパク質免疫シナプスの正確な時空についてのコレクションをできます。ただし、多くの結果は T 細胞の数の分析に基づいて作成します。また、蛍光顕微鏡のこれらのタイプの T 細胞は浄化されなければなりません。多くの研究の質問の unpurified セルではなく、可能な限り最高の解像度の使用は、最も重要であります。これは献血された血液の量が限られ、並列で多くのサンプルを処理する必要がある可能性がありますので、患者の T 細胞を分析する場合。

私たちは、人間システム^15,16,17免疫シナプスのアクチン細胞骨格の分析を許可する顕微鏡の方法を確立しました。これらのメソッドは、フローサイトメトリー、フローで顕微鏡¹⁸とも呼ばれますをイメージングに基づいています。マルチ スペクトル流れフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡との間のハイブリッド、フローサイトメトリーをイメージングは形態学的パラメーターとから汎白血球などの異種細胞集団におけるタンパク質局在の分析に強み、末梢血。時間がかかり、高価な精製手順¹⁷を必要とせず、全血のサンプルからの人間の T 細胞の T 細胞/APC 抱合体のアクチンを定量化することを可能にする方法論を紹介しました。ここで紹介しているテクニックは、免疫シナプスの F-アクチンの定量化への血液サンプルから、ワークフロー全体を構成されています。

Protocol

1. 汎白血球の準備

1. ヘパリンの注射器、健康なドナー (または患者) から末梢血 1 mL を描画します。献血活動に責任がある倫理委員会の承認を持っていることを確認します。
2. ひと末梢のミックス 1 mL と 30 mL 50 mL のチューブで ACK 換散バッファー (150 mM NH₄Cl、1 mM KHCO₃、および 0.1 ミリメートルの EDTA、pH 7.0) の血し、室温で 8 分間インキュベートします。
3. PBS と 6 分吸引清 300 × gで遠心管を埋めるし、ACK 換散バッファーの 30 mL にペレットを再懸濁します。
4. 上清がクリアされるまでは、1.2 と 1.3 の手順を繰り返します。最後に、300 × g

7. 
   

7. 
   

Results

ここで説明したメソッドの主要な目的は、タンパク質濃縮の定量化 (例, F アクチン) の間の免疫シナプスの Apc (らじお細胞) と少量 (1 mL) ヒトの血液サンプルから unpurified 汎白血球の T 細胞を代理します。図 1のスクリーン ショットでは、このメソッドの重要なゲートの戦略の概要を示します。それは左と右 (図 1) の解析領域のイメージ ギャラリーを示しています。イメージ ギャラリーには、「フォーカス」ゲートが表示されます。描かれたイメージは、主に顆粒球と 2 つの T-細胞/APC カップル。F-アクチンと CD3 細胞カップル数 30272 濃縮されています。このような濃縮細胞カップルの量を定量化するゲートの戦略解析領域に表示され、プロトコルで説明されている (手順 5.8 参照) または他の^17,19。最後のドット プロット解析領域で CD...

Discussion

ここで紹介するワークフロー (ex vivo) 人間の T 細胞と Apc の間の免疫シナプスの定量化が可能にします。特に、赤血球によって汎白血球は不可欠である T 細胞の精製ステップを作る T 細胞ソースとして使用されました。B 細胞リンパ腫細胞株らじおは、Apc の代理として提供しています。これはそれは免疫シナプスの T 細胞側の血液ドナー間の比較を可能にするので重要な利点を負いません。さらに、自家の Dc がほとんど人間の末梢血から直接利用できます。単球由来樹状細胞 (moDCs) の生産は数日間、臨床研究への応用の挑戦を作るします。ただし、イメージング フローサイトメトリーとここで紹介する分析戦略は、他の Apc (例えば好中球, transdifferentiated)²⁰に適用できます。また、イメージングのフローサイトメトリーを用いたマウスの ex vivo Dc⁹または B 細胞²¹と CD4 T 細胞間の免疫シナプスが評価されることが示された.したがって、このメ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
ポリスチレン丸底チューブ	Falcon	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8662
ウシ血清アルブミン	Roth	#8076.3
サポニン	Σ	S7900
パラホルムアルデヒド	Σ Aldrich	#16005
FACS ウォッシュ サポニン		PBS 1% BSA 0.15 サポニン
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
スピードビーズ	Amnis	#400041
ミニシェーカー MS1	IKAワーク	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Enterotoxin SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Phalloidin-AF647	Molecular Probes	A22287	1:150
IS100	Amnis		イメージングフローサイトメーター
IDEAS	Amnis		Software
INSPIRE	Amnis		ソフトウェア