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方法論記事

結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

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DOI:

10.3791/55357

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2017年7月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

この記事について

サマリー

本発明者らは、腫瘍細胞またはオルガノイドをマウスの盲腸に注入することによる同所性結腸直腸腫瘍の確立およびこのモデルからの循環腫瘍細胞（CTC）のその後の単離について記載する。

要約

容易な適用性および費用対効果の利点にもかかわらず、皮下マウスモデルには重大な制限があり、腫瘍生物学および腫瘍細胞の播種を正確にシミュレートしない。これらの限界を克服するために、正三角形のマウスモデルが導入されている。しかしながら、そのようなモデルは、特に大腸のような中空器官において、技術的に要求されている。確実に増殖し転移する均一な腫瘍を作製するためには、腫瘍細胞の調製および注射の標準化技術が不可欠である。

我々は、非常に均一な腫瘍を発達させ、腫瘍の生物学的研究および治療的試験に使用できる結腸直腸癌（CR）の同所性マウスモデルを開発した。原発腫瘍、二次元（2D）細胞系または三次元（3D）オルガノイドのいずれかからの腫瘍細胞が盲腸内に注入され、注入された腫瘍細胞の転移能に応じて、高度に転移性の腫瘍を形成する。加えて、CTCsは定期的に見つけることができます。ここでは、2D細胞株および3Dオルガノイドならびに原発腫瘍組織、腫瘍移植マウスからの外科および注入技術ならびにCTCの単離ならびにトラブルシューティングのためのヒントを提供する。

概要

結腸直腸癌（CRC）は、西欧諸国における癌の死の最も一般的な原因の1つである。 1原発腫瘍はしばしば切除することができるが、遠隔転移の発生は劇的に予後を悪化させ、しばしば死に至る。腫瘍から切り離し2、3転移の生物学的相関循環している腫瘍細胞（CTCのは）、、、標的臓器に上皮に取り付け、循環の中で生き残る臓器に侵入し、最終的に新たな病変への脱却します。 4のCTCが予後関連性、5、6、7、8であることが知られているが、それらの生物学9は、部分的にのみCRCにおけるそれらの極端な希少性の結果として理解されます。 10

マウスモデルは強力なtです癌生物学のさまざまな側面を研究する古典的な皮下腫瘍モデルは、免疫担当者（同系マウス腫瘍細胞が使用される場合）または免疫不全のいずれかであり得るレシピエントマウスへの腫瘍細胞の皮下注射によって産生される。皮下腫瘍モデルは安価であり、データを迅速に生成する。それらのエンドポイント腫瘍増殖は容易かつ非侵襲的に測定することができる。しかしながら、そのようなモデルにおいて抗腫瘍活性を示した新規化合物の88％が臨床試験に失敗している。 11これは人間とマウスの種間の違いに一部原因があります。しかし、この失敗の大部分は皮下マウスモデルの予測値が低いためです。

したがって、腫瘍細胞が起源の器官に注入され、したがって元の微小環境で増殖する正所性のマウスモデルは、がん研究においてますます使用されている。 図11 、図 12 、 13、14の同所モデルは、局所的な腫瘍の成長条件をシミュレートしないだけでなく、腫瘍増殖の解剖学的に正しいサイトの結果として、同所マウスモデルはまた、転移の現実的なシミュレーションを可能にし、したがって、CTCの生物学8、15、16またはCRCの異なる治療への応答を研究するために使用されています。 13、17

同所性マウスモデルの主な欠点は、その技術的な複雑さです。細胞が注入される臓器に応じて、実験者が再現性のある腫瘍を誘導するまでの学習曲線はかなり長い。これは、腫瘍細胞を腸壁に注入する必要があるため、結腸直腸癌モデルに特に適用され、穿孔、腫瘍細胞漏出、または腔内腫瘍細胞の損失をもたらすことが多い。これは、原型組織サンプル、2D細胞株および3Dオルガノイド培養からの細胞調製方法およびマウスの盲腸へのそれらの注入を記載することを意図している。ここに記載されている技術は、高度に均一な腫瘍をもたらし、そして注射に使用される細胞系の腫瘍生物学に応じて、レシピエントマウスにおける遠隔転移およびCTCの再現性のある形成をもたらす。 15

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プロトコル

ここに提示された動物実験は、機関および政府の動物保護および使用委員会によって独立して審査され、許可され、 実験動物連合連盟 （FELASA）のガイドラインに従って実施された。すべての可能な措置は、麻酔および鎮痛、または必要な場合には早期安楽死を含む苦痛を最小限にするためにとられた。

1.細胞およびオルガノイドの調製

注：1回の注入につき100,000細胞で20μLの容量を使用してください。漏出を防止し、標準化された注射を確実にするために、基底膜マトリックス（BMM）を使用する。再現可能な結果を確保するために、一定の間隔で（STRプロファイリングを介して 、 例えば ）細胞株認証アッセイを行います。

  1. 新鮮な組織からの一次細胞懸濁液の調製
    注：常に無菌条件下で作業してください。新鮮なものの即時転送手術室から氷上で実験室に切除された組織は、細胞の高い生存性を確実にするために必要とされる。
    患者の健康と最適な治療が常に最優先事項でなければなりません。したがって、研究のための組織試料は、切除された腫瘍のその後の病理学的検査および病期診断を妨害しない方法で得なければならない。従って、ほとんどの場合、病理学的診断との非干渉を確実にするために、訓練された病理学者によって得られた研究のためのサンプルを有することは合理的である。
    1. 切除標本（理想的には1cm 3 ）から滅菌除去した直後に、20〜30mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を予め充填した50mLチューブに組織サンプルを入れる。チューブを氷上に保管し、すぐに検査室に移す。
    2. ペトリ皿に組織を入れ、十分なPBSで2回洗浄して残りの血液を除去する。
    3. 組織をscaで小片（〜2〜4 mm）に切断するlpel（ 例えば 、＃20または＃36ブレード）。
    4. 腫瘍組織を単細胞懸濁液にさらに解離させるために、解離剤を製造者の指示に従って使用する。あるいは、酵素消化の他のプロトコールを使用する。
    5. 得られた単一細胞懸濁液の細胞を計数する（ 例えば 、コールターカウンターまたは血球計で）。
    6. 遠心分離（1,500 xgで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。
    7. BMMに5×10 6細胞/ mLの濃度で細胞を再懸濁し、氷上に保ちます。
  2. 注射用細胞株の調製
    1. 標準的な培養条件（37℃、5％CO 2 ）下ですべての結腸直腸癌細胞株を増殖させ、手術の日に調製する。
    2. 標準的な細胞培養プロトコールに従って細胞を採取し、細胞を計数し（ 例えば 、コールターカウンターまたは血球計算盤で）、reqを計算する注射される動物の数に依存して、すべての注射のための尿量。
    3. 実際に必要とされる量の3-5倍を準備して、ピペッティングロスと注入シリンジのデッドボリュームを考慮してください。
    4. 遠心分離（1,500gで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。
    5. BMMに5×10 6細胞/ mLの濃度で細胞を再懸濁し、氷上に保ちます。
  3. オルガノイドの調製
    注：すべての3Dオルガノイド培養物は、標準的な培養条件（37℃、5％CO 2 ）下で増殖させる。オルガノイド培養の詳細なプロトコールはこれまでに公開されている。従来の細胞株と同様に18、19、20、我々 は注射当たり100,000細胞で20μLBMMのボリュームをお勧めします。オルガノイドは、手術の日に次のように調製される：
    1. 以下の培地を調製する（以下、（DMEM）/ F12 + 1％HEPES（1M）+ 1％グルタミン（200mM）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を含むDMEM / F12 +
    2. 15 mLチューブに1 mLのDMEM / F12 +++をあらかじめ充填する。
    3. 注意深くオルガノイドを培養プレートの表面から吸引し、3〜5ウェルの内容物を1つの15mLチューブに移す。
    4. 細長いガラスピペットで上下にピペッティングすることにより、有機体を慎重に小さな断片に砕きます。
    5. 管に5mLのDMEM / F12 +++を添加し、続いて1000xgで5分間遠心分離する。
    6. 遠心分離後、上清を除去し、ペレットを600μL酵素解離緩衝液に再懸濁し、懸濁液を6ウェルプレートの1つのウェルに移す。
    7. 37℃で1〜5分間インキュベートし、オルガノイドを溶解するために懸濁液を上下に慎重にピペッティングする。
      注：消化は顕微鏡で確認してください。すべての細胞クラスターが解離したときに完了する単一細胞へのd。
    8. うまく消化し​​たら、消化を停止するために1.4mLのDMEM / F12 +++を加える。その後、消化されたオルガノイドのすべてのウェルを50mLチューブに移す。
    9. 細胞を数え、すべての注射に必要な量を計算する。
    10. 分注ロスと注入シリンジのデッドボリュームを考慮に入れて実際に必要とされる量の3〜5倍を準備する
    11. 遠心分離（1,500 xgで5分間）し、細胞懸濁液をPBSで2回洗浄する。
    12. BMM中の細胞を5×10 6細胞/ mLの濃度に再懸濁し、それらを氷上に保つ。

2.正射マウスモデル

  1. 手術のためのレシピエント動物の調製
    注：6-8週齢のNOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wj1 / SzJ（NOD scidガンマ、NSG）マウスをレシピエントとして使用する。 21 NSGは、最も免疫不全のマウスのうち、成熟したB、TおよびNK細胞を欠いており、他の複数の免疫性のdeフェクト。 21彼らは確実に低い細胞数が注入されている場合でも、腫瘍を成長させ、遠隔転移に非常になりやすいです。 NSGマウスは優れた育種家であり、従来の特定病原体不使用（SPF）単位で維持することができます。
    1. 最初の切開の前に、0.05mg / kgのブプレノルフィンを皮下注射する。
    2. 全身麻酔の場合、セボフルランを3-3.5容量％で使用する。つま先ピンチ反射の喪失は、十分な麻酔を示す。
    3. 角膜の乾燥を避けるために、眼科用軟膏で麻酔したマウスの眼を覆う。
    4. 小さなテーブルの上で仰向けにマウスを拘束します。
    5. 腹部を電気シェーバー（脱毛クリームを代わりに使用することができる）で剃り、少なくとも3回クロルヘキシジン/ヨウ素と70％アルコールで消毒する。
    6. 手術野を滅菌ドレープで覆う。
      注：周術期抗生物質の使用はオプションであり、制度上のガイドラインの対象となります。
  2. 中線開腹術および盲腸曝露
    1. はさみ（メスを交互に使用することができます）を使用して、下腹部の皮膚の小さな正中線切開（3〜5 mm）を行います。鉗子で腹部の筋肉組織を拾い、慎重にはさみで切開して、腹腔を開きます。
    2. 盲腸を特定し、慎重に外傷性鉗子で外形化する。盲腸のブラインドエンドパウチを腹部に配置し、頭蓋骨を指します。
    3. 体外に出すと、常に温かい生理食塩水綿棒を使って盲腸を湿らせてください。
  3. 眼内注射、腹部閉鎖および術後回復
    1. 内腔内注射のためには、30Gカニューレを備えた標準的な1mL注射器を使用する。このシリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付け、マイクロインジェクションポンプをマイクロマニピュレーターに取り付けます。
    2. 慎重に非鉗子鉗子で盲腸の先端をつかみ、それを穏やかに滑らかにする温かい生理食塩水で湿らせた鉗子の第2のセットでd。
    3. カニューレを盲腸の真上に配置する。
    4. 双眼の外科用顕微鏡で視覚制御下で次の手順を実行します。
    5. 盲腸の外郭部分の両端にある2つの非外傷性鉗子で盲腸を慎重に把握し、わずかに引き伸ばし、ゆっくりとそれを平行にかつ真上に位置するカニューレ上にゆっくりと引き寄せる。漏出および腹膜播種につながる可能性があるので、腸壁全体を穿孔しない（したがって、細胞を管腔に注入する）ことは重要であり、穿孔の初期点を超えて漿膜を穿孔しないことも重要である。
      1. 腸をカニューレの方に移動し、カニューレを腸の方へ移動させないでください。ホックと2つの鉗子の間に腸を伸ばします。外科医の手は、振戦を軽減するために表面上に静止していなければならない。
    6. 漿膜の間に細胞を注入する（上の非常に薄い、半透明の裏地eの壁内の血管）および筋肉痛。したがって、カニューレは、血管の上および薄い半透明膜の下に視覚的に配置されなければならない。
    7. カニューレが腸壁の内側にある間に振戦を軽減するために、注射を開始するためにフットスイッチを使用してください。
    8. カニューレが所定の位置に来たら、注射を開始する。 20秒間を使用すると、ポンプのコントロールユニットに1μL/ sが設定されます。
      注：損傷した血管の中または近くへの注射は、直接的な血管内伝播および遠隔転移を招き、したがって避けるべきである。
    9. 注射が完了した後、カニューレを慎重に後方に引っ張って外す。
    10. 乾燥した綿棒を盲腸の下に置き、漏出した細胞を溶解して人工腹膜の播種を防ぐために盲腸を蒸留水で十分にすすいでください。
  4. 腹部の閉鎖および術後の回復
    1. rの後盲腸を静かに腹腔に戻してください。
    2. 急速吸収性の6 - 0の縫合糸で腹壁を閉鎖する。
    3. 外科用創傷クリップで皮膚を閉じます。
    4. 麻酔から完全に回復するまで38℃に設定されたヒーティングマップ上にマウスを置きます。
    5. 48時間後のマウスの術後状態を密接に観察する。苦痛の場合は、ブプレノルフィン0.05 mg / kgを12時間毎に投与する。
    6. 腫瘍の成長による苦痛の徴候について少なくとも1日1回、マウスをモニターする。

全血試料からの循環腫瘍細胞の単離

注：麻酔したマウスの経皮的心臓穿刺により血液を採取し、その後安楽死させる。理想的には、100μLの抗凝固剤（エチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはヘパリン）をあらかじめ充填したシリンジに、1,000μLの血液を採取します。抗ヒトEpCAM（上皮細胞接着分子）抗体を用いてCTCを同定した。ヒト上皮細胞株がマウスモデルで使用される場合、これは非常にうまく機能します。他の器具については、異なる抗体が必要とされ得る。

  1. CTC濃縮：
    1. 15mLのチューブに5mLの密度勾配培地をあらかじめ充填し、注意深く血液を15mLのチューブに移す。
    2. 遠心分離（ブレーキなしで300xgで30分間）し、慎重に上清を除去する。
    3. 残りを新しい15 mLチューブに入れ、遠心分離機にかけます（15分間、ブレーキで300 xg）。
    4. 単核細胞を含む中間相を回収し（残りを捨てる）、細胞をPBSで2回洗浄する。
    5. ペレットを200μLPBS / 1％EDTAに再懸濁し、4μLのEpCAM抗体を加える。暗所で氷上で20分間インキュベートする。
  2. スクリーニングとピッキング
    1. 以下の緩衝液（以下、ピッキング緩衝液と称する）を調製する：PBS + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ Sトレプトマイシン（1％）+ 0.8％EDTA。
    2. PAPペンを使用して、6cmの滅菌ペトリ皿（液体が皿に分散するのを防ぐ）に約1cmの円を描き、この円の中にピペットバッファー700μLをピペットで入れる。
    3. 円内の700μLのピッキングバッファーに50μLの細胞懸濁液を添加する。顕微鏡で細胞の密度をチェックする。濃すぎる場合は、サンプルを別の料理に分割します。
    4. 細胞が沈降するのを待ちます（約5分）。
    5. 染色された（= EpCAM陽性）細胞の細胞懸濁液の滴をスクリーニングする。
    6. セルが発見されると、マイクロマニピュレータを用いて細胞を選択し、意図下流分析（ 例えば 、RNA抽出緩衝液または培養培地）に応じて、50μLのバッファに入れ。
    7. 目的とする下流分析に応じて、陰性対照としてEpCAM陰性細胞および/または培地を単離する。
    8. 下流の分析（ 例えば 、細胞培養、PCR）を続ける。

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結果

このモデルにおける結腸直腸腫瘍の成功し、再現性のある世代は、漏出または漏出のない細胞の正確な注入に決定的に依存する。これが達成されれば、このモデルは非常に信頼性が高く、人工腹膜播種の結果は非常にまれです。腫瘍の成長動力学ならびにそれらの拡散様式は、使用されるオルガノイドおよび細胞の生物学に依存する。 15 HCT116細胞は確実に、このモデルでは肝臓に転移SW620細胞の形同所腫瘍が、転移していませんが。 15

このモデルにおけるHCT116細胞の使用は、腫瘍細胞注射の35日以内に瀕死のマウスを確実にもたらす。原発腫瘍のサイズは約10mm（ 図1Aおよび図2A ）、肝臓転移（ 図1B

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ディスカッション

皮下マウスモデルでのその前臨床的に証明された活性にもかかわらず、新規化合物の大部分は臨床試験に失敗し、決して診療所に到達しない。 11皮下マウスモデルのこの明らかな不足を正確に腫瘍の生物学および増殖パターンは、直接元の臓器への腫瘍細胞の注射に基づく同所性マウスモデルの開発につながっているシミュレートします。

オルソトープマウスモデルは、皮下モデルよりもはるかに正確に固形腫瘍の生物学および普及をシミュレートすることができる。 15しかし 、主な欠点は、特に、中空の器官だけでなく、腫瘍の成長の技術的要求の厳しい監視などの技術的要求の厳しい臓器に再現性が低いです。我々のモデルでは、我々は、反復撮像法ではなく、あらかじめ定義された時点で腫瘍サイズに焦点を当てており、技術的な数精巧で動物のストレステストのために。ここで説明したモデルは、腫瘍細胞株の特徴づけ、腫瘍生物学と普及ならびに治療試験の15の調査のような様々な用途に使用することができます。

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

この研究は、ドイツの研究財団（WE 3548 / 4-1）とローランド・エルンスト・シュタップゥン・ファール・ジェシードハイツェン（Roland-Ernst-StiftungfürGesundheitswesen）（1/14）によって支持された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>細胞培養培地およびコンポーネント
アドバンスド DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ 培地
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ 培地
グルタマックス-I サプリメント (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++ 培地
ペニシリン/ストレプトマイシン(ペンストレップ)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ medium
DMEMLife Technologies GmbH619650262D細胞株の基本培地(DMEM/10% FCS)
ウシ胎児血清(FCS)BIOCHROM AGS 01152D細胞株の基本培地(DMEM/10% FCS)
TrypLE Express 酵素解離バッファーLife Technologies GmbH12604021
マトリゲル基底膜マトリックス (BMM, フェノールレッドフリー)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red)Life Technologies GmbH25200072
6-/48-well plates with lidCORNING3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mLVWR International GmbH734-2066
細胞培養フラスコ 150 cm², 600 mLCorning B.V. Life Sciences355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
15 mL、50 mL 遠心分離管Greiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 計数スライド (TC20 計数機用)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
パスツールピペット (ガラス、150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251ンゼンバーナーを使用して薄く引っ張る
トルMACS DissociatorMiltenyiBiotec130-093-235原発腫瘍組織調製用
MACSmix チューブ ローテーターMiltenyi Biotec130-090-753原発腫瘍組織調製用
gentleMACS C チューブMiltenyi Biotec130-093-237原発腫瘍組織調製用
ヒト腫瘍解離キットMiltenyi Biotec130-095-929発腫瘍組織調製用
ファルコン70&マイクロ;m Cell StrainerCorning B.V. Life Sciences352350for Primary Tumor Tissue preparation
名前会社カタログ番号コメント
Surgical Equipment
SevofluraneAbbVie Germany GmbH &(株)KG-
医療酸素エアリキードメディカル
Temgesic-Bepanthen
- 眼軟膏エルバイタルGmbH10047757
正常生理食塩水0.9%(E154)Serumwerk Bernburg AG10013
広告injectabiliaBraun235144
1 mLシリンジ(デッドボリュームなし) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
30G 注射針BECTON DICKINSON304000
セルロース スワブLohmann &Rauscher Deutschland13356
Micro-Adson ForcepsFST - ファイン サイエンス ツール11018-12
アイリス シザー - ToughCutFST - ファイン サイエンス ツール14058-11
オルセン ヘガー ニードル ホルダーFST - ファイン サイエンス ツール12002-12
オートクリップ キットFST - ファイン サイエンス ツール12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (外科用縫合)ジョンソン&ジョンソンメディカルGmbHZ1012H
テーブルトップ研究麻酔器、O2フラッシュおよびセボフルラン気化器付きパークランドサイエンティフィックV3000PS/PK
UltraMicroポンプ、Micro4コントローラー付きWorld Precision InstrumentsUMP3-4機器、高度に制御された同所性注射用
機器 SYS-Micro4コントローラー用フットスイッチWorld Precision Instruments15867高度に制御された同所性注射用機器
3軸手動マイクロマニピュレーターワールド精密機器M325高度に制御された同所性注射用機器
マイクロマニピュレーター用マグネットスタンドワールド精密機器M10高度に制御された同所性注射用機器
M10用機器 M10用スチールベースプレート マグネットスタンドワールドプレシジョン機器5479高度に制御された同所性注射のための機器
ホットプレート 062Labotect13854
Isis - 毛髪かみそりAESCULAP - ブラウン双
眼手術顕微鏡Parkland ScientificVS-2Z
名前会社名strong>カタログ番号Comments
CTC isolation
EDTARoth8040.1
密度勾配 中 –FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) 抗体クローン 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) 抗体クローン G8.8BioLegend118210
ペトリ皿, ø 60 x 15 mm, 21 cm², VentGreiner bio-one628102
蛍光細胞培養顕微鏡ライカ
Transferman 4r マイクロマニピュレーターエッペンドルフ
セルトラム エアエッペンドルフ吸引ポンプ マイクロマニピュレーター
に接続 Dmz ユニバーサルマイクロ電極プーラーダガン社セル吸引用マイクロキャピ
リズムガラスキャピラリーダガン社
PAPペンAbcamab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169ピッキングバッファー
Fetal Calf Serum (FCS)BIOCHROM AGS 0115ピッキングバッファー
ペニシリン/ストレプトマイシン (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122ピッキングバッファー
EDTARoth8040.1ピッキングバッファー
名前会社カタログ番号Comments
ImmunohistochemistryPurified
anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4BioLegend324201EpCAM immunohistochemistry(図2C参照)
HRP ウサギ抗マウス IgGAbcamab97046EpCAM 免疫組織化学 (図2C参照)
ブ ジェン 原GmbH-Buprenorphine バイアクア シングルラリーの製造に必要な ダガン社 プ

参考文献

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