クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

Summary

クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々 のサブユニットまたは蛋白質の複合体をクロマチンを一括の全体的な親和性でドメインの役割を評価する使用できます。

Abstract

クロマチン ターゲット蛋白質の結合特性の解明は、クロマチンの複雑な性質およびほとんどの哺乳類のクロマチン修飾錯体の異種の性質のために非常に挑戦することができます。これらのハードルを克服するために我々 は、クロマチン結合複合体の相対結合親和性を評価するためのシーケンシャル塩抽出 (SSE) アッセイを適応しています。結合 2 つ関連複合体、複合体サブユニットが失われたまたは個々 のドメインを無効にするとときの親和性の変化、変化の親和性の差を評価する非専門家によるこの簡単でわかりやすい分析を使用できます。親和性クロマチンの風景に変更しました。順番に塩の量を増やすことで一括クロマチン再懸濁、クロマチンから特定のタンパク質の溶出プロファイルできたら。これらのプロファイルを使用して、我々 はクロマチン修飾複合体の変化やクロマチン環境に変更が結合の相互作用に与える影響を確認することができます。他のin vitroとin vivoアッセイと SSE をカップリング、個々 のドメインとクロマチン環境の様々 な複合体の機能タンパク質の役割を判断できます。

Introduction

真核細胞における DNA の規制は、細胞内および細胞外刺激に対する応答を調整するタンパク質の品揃えによってしっかりと制御されている複雑で高度なシステムです。DNA がヒストン octamers フォーム ヌクレオソーム DNA に沿って分布やタイトなコイル¹に圧縮する疎にラップされました。DNA とヒストンのこの構造の配置は、クロマチン、読み取り、書き込み、およびヒストン²ポスト並進変更 (PTM) を消去するタンパク質のネットワークによって規制されていると呼ばれます。アセチル化などいくつかのヒストン Ptm、ヒストンと DNA の²間の相互作用を変更することで、沈殿するアミノ酸の料金を変更します。また、ヒストン Ptm は転写制御因子、クロマチンの remodelers、DNA 損傷修復機構とゲノム³の特定の領域に DNA 複製機械を採用になります。

クロマチンの相互作用を研究するためのほとんどのメソッドは小規模な相互作用プローブまたは大規模なゲノムワイドな解析を含みます。結合試験体外はしばしば電気泳動の移動性シフト試金 (EMSA)、等温滴定型熱量測定、蛍光偏光、ペプチド プルダウンなどのアッセイのヒストン ペプチドや DNA と個々 の遺伝子組換えドメインを利用します。これらの試金は通常個々 のタンパク質ドメインに焦点を当てる、彼らは、パズルの小さなピースの理解を容易にするが、多蛋白質の役割ではおろか、マルチ ドメイン蛋白質の共同の性質を理解する私たちを許可して複合体。ほとんどの哺乳類のクロマチン修飾錯体の異種合成による複雑さの別の層が追加されます。この蛋白質の不均一性クロマチン風景の動的な性質との組み合わせで難しく、体内へのバインド クロマチン蛋白質の相互作用クロマチン体外を要約します。

生体内での方法を行った進歩;ただし、彼らはしばしば高価な時間のかかる作業、技術的に困難です。⁴の大幅な最適化が必要ですしかし、クロマチン免疫沈降 (チップ seq) を配列することによって続いて、遺伝子、ヒストン修飾とタンパク質の局在を決定するため便利です。タンパク質が多い相互作用; を維持するクロマチンへの架橋しかし、これは人工の相互作用を作り出すことができる、⁵をマスキング エピトープを引き起こす可能性があります。さらに、特異性の高い抗体や DNA のせん断とチップ qPCR が頻繁に利用可能な事前既知のバインディングのサイトを使用して IP 条件の大規模な最適化 immunoprecipitations (IP) が必要です。チップの条件の最適化後、試料の加工は高価とシーケンス分析して数ヶ月に数週間が必要です。この方法は貴重なクロマチンの局在を特定するためゲノム、コストの間で蛋白質をバインドおよび時間のコミットメントでは、小さな変化が大域結合特性に与える影響についての仮説を生成するこのメソッドを使用する法外です.

本稿で我々 は逐次塩抽出 (SSE) 試金を使用してクロマチン結合蛋白質の大域結合プロファイルを確認し、蛋白質、複雑なまたはグローバル PTM のプロファイルに変更することができます相互作用を変更する方法を区別する方法について説明します。塩抽出の一般的に、広く使用されている手法ですが、この逐次法が高い再現性で汎用性の高い方法を示す.SSE の複雑なまたは単一のドメインも 1 つサブユニットが一括クロマチン複合体の全体的な親和性に貢献する方法を特徴付けることができます。蛋白質の結合はヒストン マーク ターゲット チップ seq と他のゲノム広い調査を使用して確認することができます興味深い仮説を提供するクロマチン環境の変化によって影響がかどうかを決定するため、SSE を使用もできます。

我々 はもともとこのメソッドから Wu et al., Polybromo1 の機能を調べるため、適応 (PBRM1) PBAF クロマチン remodeler^6、7の結合に。この手法を使用すると、我々 は複雑な改造 PBAF クロマチン内クロマチンの結合のための PBRM1 の役割を決定、[この関数⁷六つの個人 bromodomains の相対的な寄与を決定します。

ここで化学剤によるクロマチンからタンパク質の変位を確認する似たようなクロマチン複合体の変更の相対結合親和性を評価するために、異なったセルタイプにクロマチンの結合を探索するこのメソッドを最適化する方法について説明し、クロマチンの風景に変更後のクロマチンの結合の効果を決定します。

Protocol

1。 準備

0.5%、60 mM Tris pH 8.0、2 ミリメートルの EDTA、60 mM KCl

1. 準備 100 mL の低張性溶液バッファー a: 0.3 M ショ糖 NP 40。4 ° C でストア
   。 注: HEK293T など、いくつかの細胞溶解のより少なく厳しい条件が必要です。核は簡単に分離、変更バッファー a: 25 mM HEPES pH 7.6、25 mM KCl、5 mM MgCl ₂、0.05 ミリメートルの EDTA、0.1 %np-40、および 10% グリセロールを使用します
。
2. 2 x mRIPA ソリューションの 250 mL の原液を準備: 100 mM Tris pH 8.0、デオキシ コール酸ナトリウム NP-40、および 0.5% 2% します
。
3. 5 M nacl 100 mL 原液を準備します
。
4. ごとに六つの塩の集中の 1 x mRIPA 溶液 50 mL を準備 2 x mRIPA と 5 M NaCl 水溶液を使用して: 0 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM と 500 mM の NaCl。実験を開始する前に氷のすべてのソリューションをクールな
希望の条件の下で細胞の
5. 成長します
   。 注: 蛋白質をノックダウンの効果を判断するには場合、ノックダウンのラインのための SSE は野生型細胞と比較する必要があります。これらの SSE は、サイド バイ サイド実行する必要があります。化学剤や刺激を使用しての例については、セクション 3-5 を参照してください
。

2。基本的なシーケンシャル塩抽出

1. 収穫 800 万セルそれぞれの条件し、5 mL の氷冷 PBS で 2 回洗って
   。 注: 同等のタンパク質濃度を持っている細胞の数と同じ数を持つことが重要です。セルの正確な数は、個々 のセルの行または特定の蛋白質のために最適化する必要があります。持っていることが重要だ、蛋白濃度の増加は平衡バインディングに依存して溶出曲線の観察を防ぐため、あまりにも多く。ただし、あまりにも少数の細胞とされない場合があります、曲線を検出する十分なタンパク質とクロマチン ペレットは困難に分離し、分数間に失われることができます
。
2. 1 mL のバッファー A + プロテアーゼ阻害剤で細胞を再停止、1.5 mL のマイクロ遠心チューブ、および 4 ° C で 10 分間で下回転トップに転送
3. は 4 ° C で 5 分間 6000 × g で遠心分離によって核を分離します
   。 注: この手順後核封筒まだそのままでなければなりません。ペレットが完全に中断されます再核封筒がそのままの場合ただし、封筒を分離するか、クロマチンが解放されると、ペレットは再度中断します。核封筒がない場合そのままバッファー A インキュベーション後、バッファー A の変更を使う
ペレットを再懸濁の前に核ペレットに
4. 追加 200 μ mRIPA 0 mM NaCl + プロテアーゼ阻害剤。15 回を 1 mL ピペットでピペッティングによって各サンプルを均質化します。ペレットを容易に中断する再、戻それは厚さと粘着とピペットに困難なサンプルになると、核が溶解させます。 ただし。
   の先端に餌を描く、遠心分離機管の底面に対してピペット チップの端をタップするために
   1. 。一度、核からの DNA をリリース ピペッティングことが壊れますので、ペレットは完全に分解しない
5. 3 分の氷の上のすべてのサンプルをインキュベートすべての試料をホモジナイズ時
   メモ: インキュベーション時間を興味の蛋白質によって最適化する必要があります
。
6. 4 ° C で 6500 x g で 3 分のサンプルを遠心分離によって分離クロマチン ペレット
。
7. きれいな 1.5 mL 遠心分離機に転送清管。これは 0 mM 分数になります。この 0 mM mRIPA ソリューションの核溶解洗浄ステップとして機能およびクロマチンに関連付けられていない任意の緩やかな蛋白質を削除できます
。 クロマチン ペレット ペレットを再懸濁の前に
8. を追加 200 μ L mRIPA 100 mM の NaCl + プロテアーゼの阻害剤。上下に 15 回ペレットをピペッティングによるクロマチン ペレットを分割します
   。 注: でペレット戻回数と一致する重要です
。
9. 3 分間氷の上加温。この潜伏ステップにより、複数のサンプルがある場合、特に重要である平衡状態に到達するすべてのサンプル
。
10. 6500 x g で 4 ° C ときれいな 1.5 mL チューブに上清転送で 3 分間遠心します
。
11. は残りの塩濃度 2.6 2.10 を繰り返します
    。 注: 400 mM の NaCl 後、mRIPA ペレットべきはっきりと取れ、管の下部に滞在されません。ペレットを分離した上清中の遠心分離機管の蓋に配置できます
。
12. 蛋白質のローディング x 4 の追加 70 μ L 各分画に染めるし、西部のしみの分析の SDS アクリルアミドゲルに各画分の 30 μ L をロードします
    。 注: 蛋白質の結合プロファイルを決定する、それが重要ライセート、ロードよりもむしろ等しい蛋白質濃度と同等のボリュームをロードします
。
13. 膜に転送することによって標準的な西部のしみを実行し、興味の蛋白質の一次抗体を使用します
。
14. は、クロマチンから溶出する蛋白質を量的に表わすことでは、赤外蛍光 IRDye 二次抗体にしみと、撮像素子と画像のしみを孵化させなさい。開発の他のメソッドを使用できますが、お勧めします蛍光や赤外線撮像、自然の中より定量的である
。
15. 使用 ImageJ または同様のソフトウェアごとの塩分濃度で溶出蛋白質に対する強度を計算します。塩分濃度に対するバンド強度をグラフ化、興味の蛋白質の溶出パターンを判定できます
。

3。存在下で連続塩抽出、" リーダー " 阻害剤

1. 細胞 (400 万) の 2 つのセットを収穫し、標準の SSE のように核を分離します
。
2. は再 mRIPA 0 mM の NaCl を 200 μ l 添加の両方のセットを中断し、3 分間インキュベートします。これは、核内蛋白質の除去のため、します
。
3. 追加 200 μ L mRIPA 0 mM NaCl ペレット。コントロール セットに 1 つのサンプルと DMSO に阻害剤 (1 mm (+) JQ1 2 μ L) を追加します
。
4. 撹拌機、ペレットで 15 回をピペッティングし氷上で 5 分間インキュベート
5. 6500 x g で 4 ° C ときれいな 1.5 mL チューブに上清転送で 3 分間遠心します
。
6. すべての塩濃度に 3.3 4 を繰り返し、標準的な西部のしみを実行します
。

4。逐次塩抽出の存在下、" ライター " 阻害剤

1. (10 μ M サハ) 阻害剤で細胞を治療または 3 h の DMSO
2. 各治療のため 400 万セルを収穫します
。
3. 阻害剤のすべてのバッファーに追加でサンプルの標準 SSE を実行します
。

5。シーケンシャル塩抽出次 DNA 損傷

1. 1 のための 1 μ M ドキソルビシンとセルを扱う
2. 3 h を回復するようにしセル上のメディアを変更
3. 800 万セルを収穫し、基本的な SSE を実行します
。

6。非逐次塩抽出

1. 1200 万セルを収穫し、PBS で洗浄します
。
2. 分割細胞マイクロ遠心チューブあたり 200 万セルが存在するようにします
。
3. 再バッファー A の 500 μ L で中断し 10 分間インキュベート
4. 6000 x g に遠心分離によって核を分離
5. MRIPA バッファー + 塩化ナトリウムの各 200 μ L でペレット再中断します
。
6. 1 mL ピペット チップで 15 回のピペッティングによって各サンプルをホモジナイズしてください
。
7. 氷上 3 分加温
8. は、クロマチンを 6500 × g で遠心分離によって分離し、チューブをきれいに清を転送します。ローディングの染料の 70 μ L を追加し、西部のしみの分析のための SDS ページのゲルの 30 μ L を実行します
。

Results

本稿では、利点と我々 は文学⁶から適応している一般的に使用される連続塩抽出 (SSE) メソッドのアプリケーションを示しています。図 1ARID1a と PBRM1 の溶出パターンを検出することにより非連続的にタンパク質を抽出する SSE の再現性を比較する.一貫して、ARID1a、BAF サブユニットが 200 mM で主に塩化ナトリウムと PBRM1、排他的な PBAF サブユニットを示して、主に 300 mM の NaCl を示して遵守します。図 1 aは、800 万 OVCA429 細胞と SSE の 3 つの独立した複製を示しています。図 1 bは、200 万セルから分離した核が塩バッファーで再懸濁非シーケンシャル塩抽出を示しています。両方の方法を締結 ARID1a た 200 mm と 300 mM で PBRM1 を示して、SSE は...

Discussion

塩の抽出でタンパク質とクロマチンの相互作用の評価は何十年も^14,15; に採用されている一般的な方法ただし、それが最適化されていない体系的にする前に、フル ・ ユーティリィティを明らかにします。このフレームシーケンシャル方式が蛋白質または環境が変更されるとき、クロマチンの結合の変化を区別するために迅速かつ安価な方法を提供する方法を示します。SSE は高い適応性、最適化、および重要なは、それは技術的には簡単で、特殊な機器は必要ありません。開始する前に最適化する必要がある重要な側面は、: 細胞数、低張バッファー条件とインキュベーション時間を開始します。

細胞数の最も重要な側面は、すべてのサンプルとの間に整合性があることです。BAF 錯体を見るとき、; これらの複合体の連結方法の良いプロファイルを与える 800 万の細胞を用いたただし、セルの数 (またはバッファーの量) は興味の蛋白質の豊富さによって調整する必要があります。少ない細胞を用いた 400 mM と 500 m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
塩化ナトリウム、結晶2.5 Kg AR(ACS)	Avantor / Macron	7581-06
ショ糖、結晶500 G AR¨(ACSの)	Avantor/Macron	8360-04
塩化カリウム、粒状 500 g AR¨(ACSの)	Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R)塩基、一次標準および緩衝液、>=99.9%(滴定)、結晶性	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA(エチレンジニトリロ)四酢酸、二ナトリウム塩、二水和物125 G AR(ACS)	Avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRATE、100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES緩衝液溶液 (1M)	Gibco	15630-080
塩化マグネシウム、6-水和物、結晶 500 g AR¨(ACSの)	Avantor/Macron	5958-04
グリセロール、1L	アムレスコ	0854-1L
デオキシコール酸ナトリウム塩、100g	アムレスコ	0613-100G
エッペンドルフ リサーチプラスピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-690-032
エッペンドルフ 5424 R 冷蔵微量遠心機	エッペンドルフ	5424 R
二次マウス IgG HRP リンク	細胞シグナル伝達	7076
二次ウサギIgG HRP結合	細胞シグナル伝達	7074
BMI-1抗体	ミリポア
PBRM1抗体	ベチル	A301-591A
ARID1a抗体	サンタクルーズ	sc-32761
BRD4抗体	ベチル	A301-9852a
(+) JQ1	ケイマン・ケミカル・カンパニー	11187
SAHA	ケイマン・ケミカル・カンパニー	10009929
ドキソルビシン	AK サイエンティフィック	25316-40-9
ジメチルスルホキシド (DMSO)	マクロン	4948-02
ミニトランスブロットセル	BioRad	1703930
ミニゲルタンク	サーモフィッシャー	A25977
アルブミン、ウシ (BSA)	Amresco	0332-100g	PBS-T の 5% 溶液としてウェスタンブロットのブロッキング溶液として使用
Bolt MOPS SDS ランニングバッファー (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder、10 to 250 kDa	ThermoFisher	26619
メチルアルコール、無水マクロ	ン	3041-10
トリプシン kEDTA、1X	Cellgro	25-053-CI
アジ化ナトリウム、250g UN1687	アムレスコ	0639-250G
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 500g UN1325	アムレスコ	0227-500G
グリシン、電気泳動用、>=99%	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTopマイクロ遠心チューブ、ポリプロピレン	VWR	20170-333
1000 µL ピペット チップ	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris プレキャスト ゲル 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
ロイペプチン ヘミスルフェート、5 MG	RPI 研究製品	22035-0.005	プロテアーゼ阻害剤溶液に使用されます。
アプロチニン、10 MG	RPI研究製品	20550-0.01	テアーゼ阻害剤溶液に使用されます。
PEPSTATIN A、5 MG	RPI研究製品	30100-0.005	テアーゼ阻害剤溶液に使用されます。
OVCA429細胞	カレン・カウデン・ダール博士からの贈り物
HEK293T	ATCC	CRL-3216
HeLa細胞	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A 培地	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Minimum Essential Medium (MEM), Powder	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X)非必須アミノ酸	Gibco	11140-050
FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. 出典	Omega Scientific	FB-11
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液	Life Technologies	15140-122
Glutamax Life	Technologies	35050-061
ピルビン酸ナトリウム	Life Technologies	11360070
VWR Powerソース	VWR	13-690-032