頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化

サマリー

ここでは、血管形成生体内可視化するプロトコルを提案と多光子顕微鏡による 3 D 足場でリアルタイム。重要な性マウス頭蓋骨骨欠損モデルにおける血管新生遺伝子組み換え足場を調べた。コントロールの治療群よりもより新しい血管を認めた.

要約

批判的に大きさで分類された骨欠損の再建では、組織設計の足場内悪い血管新生のための十分な血液供給不足を生じ、新しい組織の壊死を引き起こす修復中に深刻な臨床問題が残ります。急激な血管新生は、新しい組織の生存と既存のホスト組織との統合のための重要な前提条件です。足場でのデノボ生成は、骨再生の足場に成長する組織を修復できるように効率の最も重要な手順の 1 つです。この問題に取り組むため、骨形成と血管新生を促進する生体材料足場の遺伝子組み換えを使用します。可視化して体内の追跡血管形成をリアルタイムかつ 3次元 (3 D) 足場または新しい骨のティッシュでは、まだ骨の組織工学のための障害。多光子顕微鏡 (MPM) は、高解像度かつ低侵襲に生物学的構造から体積データを集録することができます新しいバイオ イメージング モダリティです。本研究の目的は、多光子顕微鏡による生体内で頭蓋骨の重要な骨欠損修復用遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場内血管新生を視覚化するだった。PLGA/nHAp 足場は血管新生を促進するために、骨の再生を強化するレンチウイルスベクター (LV-pdgfb) を運ぶ成長因子pdgf b遺伝子の持続的な配達のため修飾されました。足場を注入した頭蓋骨重要な骨の欠損マウス モデル、PHp 足場で血管領域 (変更できます |) PH 足場よりも有意に高かった。また、 pdgf bとvWFとVEGFR2、血管新生関連遺伝子の発現はそれに応じて増加しました。:Microct 分析は、飛躍的に PHp グループの新生骨の形成が他のグループに比べると示されました。私たちの知る限りこれは多光子顕微鏡は生体内で3 D の生物分解性の足場とリアルタイムでは血管新生を調べる骨の組織工学で使用されたの初めて。

概要

骨は、個々 の¹の有効期間中に改造を続けている高度に血管組織です。大きな骨欠損偽関節、外傷、腫瘍切除、または顔面の奇形に起因の迅速かつ効果的な骨再生は、複雑な生理学的なプロセスです。骨欠損修復のため従来の治療アプローチは、自家および同種移植が彼らの使用を含むいくつかの問題や制限などの限られた可用性、大幅にドナー サイト罹患率、感染症のリスクが高いと免疫拒絶^2,3をホストします。ただし、人工骨移植は、これらの制限を軽減するために効率的な代替手段を提供しています。彼らは生分解性材料から作ることが、簡単に適した細孔サイズを作製して、遺伝子組み換え^4,5をすることができます。

現在、様々 なティッシュ工学足場は組織設計の骨^6、7の開発に採用されています。骨の修復と再生をより効率的に誘導するために設計された生体成長因子の併用は登場して良い結果^8,9を達成しました。残念なことに、半減期が短い、簡単に失うアクティビティ、および治療の成長因子の生理学的用量の限界、臨床応用¹⁰。これらの問題を克服するために代わりに、成長因子の成長因子遺伝子の配信は骨欠損と疾患^11,12の治療のための生物活性を維持するために効果的な方法として実証されています。ウイルスのベクトルが有望な配信、高効率¹³を表現による組織再生のためのツール。

成長要因のうち、マイトジェンと間葉系と骨の細胞走化性因子のみならず、血管新生^14,15覚醒剤だからは、本研究で血小板由来成長因子 (PDGF BB) の選ばれました。.前臨床および臨床研究は示したこと PDGF-BB が安全かつ効果的に修復を促す骨、歯周骨欠損^16,17。最近の研究では、やる気にさせる内皮細胞の移行および拡散体内^18,19PDGF-BB が血管新生を刺激することを明らかにしました。さらに、PDGF BB もレンダリングできます間葉系幹細胞 (MSCs) 内皮細胞²⁰、およびこのさらにハイライトに血管新生における MSCs の潜在的な役割を分化。したがって、骨再生の足場に成長して組織の修復のための重要なステップは、PDGF-BB の足場で血管のde novoの形成を誘導します。

骨欠損の治癒は、調整された骨形成と修復位置²¹で血管新生が必要な動的組織形成プロセスです。注入の組織設計の足場に促進、細胞栄養素と老廃物を除去するための成長と生存に酸素を供給するための不可欠な前提です。イメージング法を用い、x 線を含むマイクロ計算 ct により、磁気共鳴画像 (MRI)、走査型電子顕微鏡 (SEM)、光干渉断層計 (OCT)、共焦点レーザ走査型顕微鏡の代わりに適用されます。血管新生情報^22,23を取得する病理。ただし、これらのメソッドの可視化と骨再生組織工学における足場を 3 D で新生微小の測定の様々 な障害に直面します。多光子顕微鏡 (MPM) は同時に細胞、細胞外マトリックスを可視化し、周囲の血管ネットワークの明確な利点を持っている比較的新しいバイオ イメージング技術体内。それは深部組織浸透のため固有三次元イメージング機能を所有している、低光損傷を引き起こします。したがって、過去 10 年間、MPM は、バイオメディカル研究²⁴、神経科学、免疫学、幹細胞ダイナミクスを含む多くの注意を得ています。しかし、それはやっと整形外科研究であります。

プロトコル

動物のケアはケアと使用実験動物の広東省のガイドに準拠していた。監督と動物の研究、高度な技術の深セン研究所、中国科学アカデミーの倫理委員会の承認の下ですべての手順を行った

。

1 レンチ ウイルス (LV) 生産

Spe を使用してサイトメガロ ウイルス プロモーターの下流に

1. カスタム複数クローンのレンチ ウイルス発現ベクター (pLenti6/5-eGFP または LV eGFP) に pdgf b cDNA クローン サイト私は、サル。私 ²⁵ pLenti6/5-PDGFB-eGFP プラスミド (LV-pdgfb) を構築するための制限のサイト
。
2. HEK 293 フィート細胞からウイルス包装プラスミド (pLP1、pLP2、および pVSV G) と共同株によってレンチ ウイルス粒子 (LV-pdgfb) を生成クロロキンを用いた標準リン酸カルシウム法 (最終濃度: 25 μ M) ²⁵.
3. トランスフェクションの 48 時間後収穫し、ウイルスを含む 500 mL をフィルター フィルター (0.45 μ m) で上清。その後、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、分注、200 μ L で再懸濁します 2 h. 89,000 x g で超遠心法によるウイルスの粒子を集中、-80 で格納 ° C
4. レンチ ウイルスの力価を決定する 24 時間連続希釈レンチ ウイルス液と HEK293T 細胞を孵化させなさいし、前述の ²⁵ として、レンチ ウイルスの力価を計算します
。

2。3 D プリントされた PLGA/nHAp 足場と LV 固定の作製

均一溶液を形成する 1, 4-ジオキサンの 20 ml

1. 解散 20 g PLGA (ポリ D、L-乳酸-co-グリコール酸) の材料。ソリューションにナノサイズ HAp (ナノ hydroxyapatide) 粉体 (nHAp) の 2 g を追加します。PLGA: nHAp 比が 10:1 (w/w) をする必要があります
。
2. は、積極的に混合液をかき混ぜる (攪拌スピード: 1,500 rpm) 常温 16 時間磁性攪拌器を使用して均一なペーストを形成します。あらかじめデザインされたモデル ²⁶; によると低温の 3 D プリンターを用いた預金のペースト層の層は、下から上へ、コンピューター化されたノズル多孔質 PLGA/nHAp にそれを作製します。足場の細孔径が 200 から 400 μ m の範囲です
。
3. 真空は、できるだけ完全に溶媒を除去する 48 h の足場を凍結乾燥します。殺菌のため 1 時間 75% エタノール溶液に足場を浸漬し、中立的な無菌の足場を得るため凍乾します
   。 注: 凝縮温度 (° C) と真空度 (Pa) に、真空凍結乾燥法の主要なパラメーターが含まれます。45 の真空度で Pa、PLGA/nHAp 足場が真空溶媒を徹底的に削除する 48 h-78 ° C で凍結乾燥します
。
4. LV 粒子の追加 10 μ L (4.5 × 10 ⁵) 各 PLGA/nHAp に足場 (4 × 4 × 2 mm) と吸着できるように加湿のインキュベーターで 37 ° C で 2 時間足場をインキュベートします
。
5. 固定化後、非連結の LV の粒子を除去する PBS で 2 回足場をすすいでください。液体窒素で凍結する LV 粒子コーティング足場、再び、凍乾、将来使用するため-80 ° C で保存します
。

3。体外足場から LV 伝達活性 LV 粒子の放出速度論

1. 加温 3 D 足場 (4 × 4 × 2 mm) 運ぶ LV-緑色蛍光タンパク質 (LV eGFP、4.5 × 10 ⁵ LV 粒子) 2.0 mL 低温で完全な DMEM の 1 ml5 日間の揺れで 37 ° C でバイアル
。
2. 12 時間から 120 時間後の培養 12 時間間隔 1 mL のサンプルを取るし、媒体を交換します。各時点で培養液の 1 mL ではなく新鮮な媒体の 1 つの mL を追加
。
3. HEK293T 細胞を 48 h. 流れ cytometry ²⁷ による細胞の GFP 陽性 HEK293T の数を決定することにより生理活性の LV 粒子数測定インキュベート共同によるヘッジホッグ収集したメディアを使用します。
   1. HEK293T 細胞を伝達する前に培養液を削除し、PBS で 2 回 HEK293T 細胞をすすいでください。レンチ ウイルスを含む収集したメディアは、(まあ 1 mL/) に足場からリリースを追加し、加湿のインキュベーターで 37 ° C で 48 時間 HEK293T 細胞文化します
   。

4。体外骨髄由来 MSC (ボーマン) 移行の評価

1. 遊走試験前に準備表現トマト蛍光蛋白質 (BMSCs T) および PDGF-BB 蛋白質 (BMSCs P) ²⁸ BMSCs
。
2. 8 μ m の孔径 24 ウェル プレートとポリカーボネート フィルターを用いたボイデン室 BMSC 移行分析を実行します。
   1. 場所 BMSCs の 0.5 mL (5 x 10 の ⁴) 上部の部屋でトマト蛍光蛋白質 (BMSCs T) 表現する LV をトランスフェクトしました。BMSCs の 0.5 ml (2 x 10 の ⁵) PDGF-BB 蛋白質 (BMSCs P) 下のチャンバーで表現する LV をトランスフェクトした
   。
3. この実験に六つのグループを含めるし、各井戸の下のコンパートメントに 500 μ L を追加します
   。 A. 空白のみのコントロール、無血清培地
   B. FB 制御、中 10% を添加した FBS
   C. PDGF-BB コントロール、無血清培地で 4 ng/mL PDGF-BB
   + PDGF-BB つかむ PDGF-BB グループ (4 ng/mL) と反-PDGF-BB (4 ng/mL) ポリクローナル抗体無血清培地
   E. BMSC グループ、無血清培地で 2 x 10 ⁵ BMSCs
   F. BMSCs P グループ、2 x 10 ⁵ 血清の自由な媒体 BMSCs P.
4. 5% CO ₂ 加湿のインキュベーターで 37 ° C 48 h 間インキュベートします。その後、下のチャンバー側に移行した細胞を除去し、フローサイトメトリーによる BMSCs T 数の定量化のためにそれらを収集します。
   1. 削除下院に移行した細胞側の細胞スクレーパーを使用して、2 mL の PBS と移行した細胞を再懸濁します。流れ cytometry ²⁹ 移行 BMSCs T 数を定量化します
   。

5。マウス頭蓋骨重要な骨欠損モデルと足場移植の確立

注: 広東省医学実験動物センター (中国・広東省) から購入した男性 balb/c マウス (7 週齢).

1. 登録合計 42 頭蓋骨骨欠損の雄マウスの実験します。14 次の治療を受ける各グループ内の 3 つのグループにランダムにマウスを分ける: グループ A、ないインプラント;グループ B、PH 足場 (PLGA/nHAp) を注入した;グループ c、PHp 足場注入 (PLGA/nHAp/LV-pdgfb) です
。
2. では、ペントバルビ タール ナトリウム 50 mg/kg の腹腔内投与で動物を麻酔します。脱毛のペーストで毛皮を削除し、最初の切開を行う前に 75% アルコール溶液で頭の皮膚をきれいします。手術中にまだ維持する定位放射線計測器で各マウスの頭を修正します
。
3. 初期メスで切開してウィットに拡大h はさみ 1 cm 線形皮膚切開を作成します。滅菌綿棒を使用して頭蓋骨の骨表面を明らかにするため頭蓋の骨の骨膜をこすりです
。
4. は ³⁰ の頭蓋骨の左側にある直径 4 mm サイズで重要な欠陥を作成するのにトレフィン バリを使用します。足場を移植骨欠損サイトにします
   。 注: 重要なサイズの欠陥 (Csd) のとして定義されたもともと " 最小サイズ骨傷特定のボーンと動物の一生の間に自然治癒することがない動物の種 " この実験では、4 mm 径の欠陥重要なサイズの骨欠損によると、以前研究 ^{31 , 32} です
。
5. は、手術部位をカバーするのに骨膜をそっと戻って移動するのに眼科用鉗子を使用します。1 cm あたり 3 つのステッチで切開の皮膚を縫合します
。
6. は、永久歯のケアを実行します。痛みを緩和する鎮痛ブプレノルフィン (0.1 mg/kg) を管理します。動物を目覚めさせるまでは、加熱パッドで体の温度を維持します。その後、食料と水との動物フィードし、テストが終了するまで毎日彼らの活動を記録します。注: 前の手順によって、ローカル動物の世話委員会ガイドライン。 鎮痛を管理できるように

6。生体内でMPM での骨内血管新生イメージング

注: FITC 結合 250 kD デキストラン (10 mg/mL) 生理食塩水では sn 比の高い新しい血管の (信号対雑音比) の画像を取得するためにマウスに注入された静脈内以前研究 ³³ によると。これは生存プロシージャ注意してください

1. 2 光子励起蛍光 (TPEF) と第二高調波発生 (SHG) 信号イメージングの多光子顕微鏡 (MPM) システムを構築します。
。
2. Anaesthetize ペントバルビ タール ナトリウム 50 mg/kg の腹腔内注入動物実験中の 37 ° c の体温を維持する熱プレート上の動物を固定化.イメージング プロセス中に十分な麻酔と鎮痛効果を維持するために、100% 酸素で 3.0% イソフルラン麻酔ガスを使用します。イメージングの前に脱水を防ぐため生理食塩水 (200 μ L/動物) を腹腔内注入します
。
3. チューニング フェムト秒 Ti サファイア レーザーで 860 nm。ガルバノ ミラーのペアをスキャンすることによって 512 x 512 μ m サンプリング領域を作成し、サンプルと後方散乱の TPEF/SHG 信号を収集する focusthe 励起光に NA1.0 水浸対物レンズを使用します
   。 注: イメージング ホーム ビルド多光子顕微鏡イメージング システム (MPM) で実行されました。860 にチューニングされたフェムト秒 Ti サファイア レーザー イメージング、時として最適な励起波長 nm。レーザー ビームはガルバノ メーター ミラーのペアを使用してサンプル面スキャン ラスターだった685 のダイクロイック ミラーを通過した後供試体に 20 X NA1.0 目的で nm、ビームを集中していた。誘導 TPEF と SHG 信号は、同じ目的で収集されました。信号は上記し、680 nm ショートパス フィルターによって浄化されたダイクロイック ミラーによって励起レーザーから裂けた。TPEF と SHG 信号は繊維束によって収集され、分光器を実施します。光電子増倍管 (光電子増倍管) の線形配列では、分光器、検出器。分光器と線形配列光電子増倍管の組み合わせは 16 の連続したスペクトル バンド 400 からの信号を記録する機能を提供する 600 nm nm、12.5 nm 間隔で。したがって、TPEF と SHG 信号が同時に検出およびスペクトル ドメインの分離します。さらに、3 D イメージング、軸モーターは、イメージングの深さを制御するため使用されました。各イメージの領域は、512 x 512 μ m に設定された、深さ間隔は (対照群、5 μ m) 2 μ m に設定されました。特に、統計的に有意なデータを収集するそれぞれの欠陥に 5 サイトをイメージしましたし、選択した画像サイトは欠陥に沿って均等にかつランダムに配られた
。
4. 血管の形成を測定する統計的に有意なデータを収集するそれぞれの欠陥にスキャン 5 サイト。
   1. 使用スキャン サイトの欠陥に沿って均等にランダムに分散します。コントロール グループの元の骨領域と、欠陥のエッジ (FOV) カバーを表示のフィールドが、PH および PHp グループの FOV 注入の足場にします
   。
   2. メスを使用して線形の皮膚を 1 cm 切開し移植サイトを明らかにするため固定する開いている皮膚を縫合します。浸漬レンズと水のガラスを形成する移植の間に水の滴を配置する注射器を使用します
   。
5. 取得画像のスタックすべて 12 以上期間をイメージング 2 h s。表示およびカスタム MATLAB プログラムを使用してボリュームのデータを分析し、ImageJ ソフトウェア ^{34 , 35} 血管領域を定量化します
。

7。Pdgf b と RT qPCR による血管新生関連遺伝子の遺伝子発現解析

注: PCR は、通常の手順に従って実行された: 95 ° C、30 s、40 サイクル 95 ° C の 5 s と 30 s. ポスト PCR 溶解用 60 ° C曲線が単一ターゲット増幅の特異性を確認し、β-アクチンに対する興味の遺伝子のフォールドの変更が決定されました。各サンプルの反応は 3 回調べた

。

1. 収穫注入足場と 2、4、および 8 週間術後 ³⁶ で実験的マウス組織; グループ サンプリングを制御 (n = 4)、同じ時間ポイントで撮影、隣接する骨からする必要があります
   。 注: 各時点 (2、4、および 8 週間) で CO ₂ 吸入とマウスを安楽死させた。頭蓋骨骨を解剖、その後、削除し、頭蓋骨から注入された足場を収穫します
。
2. 商業試薬を使用して製造元によると各サンプルからの総 RNA の抽出 ' s プロトコル。逆に逆の転写キットを使用-次の製造元 cDNA に RNA を転写 ' s プロトコル
。
3. SYBR グリーン検出システムを使用して実行量的なリアルタイム PCR プライマーは、表 1 に示す
。

Primer(5'–3')
遺伝子		楽しみにして		逆
pdgfb	CATCCGCTCCTTTGATGATCTT			GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT
vWF	CTCTTTGGGGACGACTTCATC			TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC
VEGFR2	GAAATGACACTGGAGCCTACA AG			TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G
β-アクチン	GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG			GCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT

テーブル 1: Pimer セット

。

8。 骨再生の:microct 解析

1. 8 週間後操作で CO ₂ 吸入と安楽死マウス。よく換気された環境に優しくクリーン マウス ケージに各マウスを配置し、安楽死の前にマウスを anaesthetize にケージに CO ₂ ガスをポンプします
。
2. 骨欠損領域の:microct イメージングの頭蓋骨を分析します。ユーザー次実験のパラメーターをスキャン: 9 μ m 分解能、アル 0.5 ミリメートル フィルター、50 の kV の電圧、現在 142 μ A
。
3. 偵察構造体商用ソフトウェアを使用してすべての画像データは、会社によって提供されます。CTAn ソフトウェアのキャリブレーション機能を使用してスキャンを調整します
   。 注: 各スキャンで与えない Hounsfield の単位 (胡)、マウスの下に配置します
。

結果

円筒多孔性 PLGA/nHAp 骨格の高さ 0.6 mm、直径 4 mm を 3 D プリンターで作製しました。足場の形態を走査型電子顕微鏡および:microct 経由で行った。図 1 aは、注入された足場の写真を示しています。:Microct スキャン毛穴の 85% 以上が 200 から 400 μ m (図 1 b) に至るまでのサイズを持っていたことを明らかにしました。SEM イメージングは、足場の表面が内部足場 (図 1 D F) 相互接続孔 (直径約 5-10 μ m) と、大まかな微地形を持っていたことを示した。被覆 LV eGFP 粒子の総量の約 40% (4.5 × 10⁵) 24 h 内で最初のバースト効果を持つ開始 PLGA/nHAp 足場からリリースします。120 h (図 2) で 0 に近づいているリリースの LV ウイルス 24 h 山頂に到達し、継続的に...

ディスカッション

骨は、継続的に癒すために、個々 の¹の有効期間を通じて改造するユニークな能力を持つ高度に血管組織です。血管新生のレベルは骨形成や欠陥修理のため重要です。低血管新生骨のティッシュ エンジニア リングの幅広い臨床応用が制限されます。バイオミメティクスの理論によると高度に血管組織エンジニア リングの骨を構築する大きなセグメント骨欠損を修復するためのツールとなっています。各種足場は比較的小さな骨欠損の修復に正常に適用されています。ただし、重要な骨欠損、まだ顔の障害を修復する足場のアプリケーションの主因に十分な血液を供給欠陥修理のため。したがって、大型の骨欠損の修復の過程での血液供給を改善は、組織工学における主要な問題の 1 つです。

人々 を刺激する、募集し、走化性、分化および^{新生微小と骨の形成に必要な細胞の増殖を促進するため必要な形態形成の分野を確立するのにために生理活性物質をコーティング足場を使用します。37}. 新生微小組織設計の足場で受け取る酸素や栄養、老廃物の除去のために細胞に不可欠です...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリ(D,L-ラクチド-co-グリコリド) (PLGA)	Σ	P1941	L/G比 75:25, MW 66000-107000
ハイドロキシアパタイトナノ粒子	シグマ	702153	平均直径 < 200 nm
クロロキン二リン酸塩	シグマ	C6628
FITC共役 250-kD デキストラン		ΣFD250S
1,4-ジオキサン	lingfeng,上海		0.45ミクロン
ステリカップフィルター	メルクミリポアコーポレーション	SLHV033RB
PDGF-BB Cdna	Sino Biological, Inc	MZ50801-G
Anti-PDGF-BBマウスポリクローナル抗体	BioVision, Inc	5489-30T
PDGF-BB 組換えタンパク質		4489-50
リン酸カルシウムトランスフェクション溶液	Promega Corporation	E1200
L-DMEM	Hyclone	SH30021.01
DPBS	Hyclone	SH30028.01
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Thermo Fisher Scientific
FBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10099-141
トランズウェル	Corning	3422
BALB/c マウス オス	広東省医療実験動物センター
ペントバルビタールナトリウム	メルク	1063180500
多光子顕微鏡			深セン先端技術研究所で自家製で、2光子励起蛍光(TPEF)と第2高調波発生信号(SHG)を検出します。
イソフルラン	Keyuan, Shandong	401750169
TRIzol 試薬	Invitrogen	15596018
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	Takara	RR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR036B
Hematoxylin and eosin	Beyotime	C0105
Paraffin	Leica	RM2235
超遠心分離機 オプティマ L-100XP	ベックマン・コールター	L-100XP
低温プリンター	清華大学		清華大学の
自家製LightCycler 480機器	ロシュ	5815916001
microCT	Bruker	1176
商用ソフトウェア	Bruker
Buprenorphine