方法論記事

蒸発低減文化条件は、マイクロタイタープレートに多細胞スフェロイド形成の再現性を高め

DOI：

10.3791/55403

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2017年3月7日

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1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

この記事について

サマリー

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マイクロタイタープレートからの培地の不均一な損失は、均一な多細胞腫瘍スフェロイド形成の再現性に影響を与えます。重要な媒体の損失を低減するために培養条件を改善するスフェロイド形成の再現性及び液体オーバーレイ技術を使用して回転楕円体に基づくアッセイの結果を改善します。

要約

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密接にインビボ条件で模倣する腫瘍モデルは、潜在的な抗癌薬のスクリーニングのための薬物発見および開発にますます普及しつつあります。多腫瘍スフェロイド（MCTSes）を効果的にリード最適化および標的バリデーションのためのインビトロモデルにおけるそれらの優れた製造、固形腫瘍の生理学的条件を模倣します。 MCTS培養のための利用可能な様々な技術のうち、アガロース上に液体オーバーレイ方式は、MCTSの世代のための最も安価な方法の一つです。しかし、ハイスループットスクリーニングのための液体オーバーレイを使用してMCTS培養の信頼できる転送をアガロースウェルにわたって均一MCTS形成の非再現性を有するマイクロタイタープレート（MPS）のコーティングを含む多くの制限によって妥協されてもよいです。国会議員は、薬物のためのプレート全体の使用を防止する、プレートの外部から媒体の過度の蒸発に起因するエッジ効果に有意傾向がありますテスト。この原稿は、均一なMCTS形成の拡張性と再現性を高めるために液体オーバーレイ技術に詳細な技術改良を提供します。薬物治療が提示された後に加えて、MCTSの評価のためのシンプルな、半自動、および普遍的に適用するソフトウェア・ツールの詳細については備えています。

概要

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腫瘍中の癌細胞は、生理学的に細胞外マトリックスと相互作用する細胞に囲ま複雑な3次元（3D）構造に配置されています。ほぼ組織内のすべてのセルは、3D環境内に存在する、より生理学的に関連する腫瘍の特性を模倣するインビトロ腫瘍モデルでの必要性は、いくつかの3次元培養技術1、2、3の開発をもたらしました。これらのモデルは、現在、3D 2の治療薬への転移および細胞応答に腫瘍微小環境の役割を研究するための基礎的な研究ツールになってきています。また、2次元（2D）細胞培養物4と比較して、3Dモデルは、細胞シグナル伝達経路に影響を与える、腫瘍-間質相互作用のよりよい理解を可能にします。

癌細胞株の多腫瘍スフェロイド（MCTSes）は、しばしば、3DセルCで使用されていますin vivoでの腫瘍に対するそれらの相対的な近さに起因するultureモデル。使用中のいくつかの技術のうち、アガロースでコーティングされたプレート上でMCTS生成の液体オーバーレイ技術（LOT）は、リード最適化とターゲットバリデーション5、6、7、8、9、10、11のために大きな関心を集めています。これが成功しLOT 6、7を使用してMCTS培養における化合物ライブラリーのパイロットの画面を実行することができました最近の研究から明らかです。しかし、媒体の蒸発によって誘導される不均一な損失にMCTSの形態と成長のウェル間の変動は、マイクロタイタープレートを使用して、LOT（MPS）を伴う一般的なハードルがあります。その結果、不均一なMCTSesの形成は有意との関連性を損ないます薬理学的アッセイ8、12、13からのデータ。自動液体分注装置を使用する際の再現性の問題に加えて、LOTベースのハイスループットアッセイに影響を与える別の実用的な問題は、アガロースでMPのコーティングです。分配ユニットは、アガロースのゲル化を防ぐために加熱保持することができるが、分注カセットおよび管の目詰まりは、ロボットシステム6のための潜在的な問題です。

これらの課題のいくつかを克服するために、我々は最近、MCTS文化8用のLOTでいくつかの変更を考案しました。これらの修飾は、主に一般的ハイスループットスクリーニング実験室で発見された機器を用いたMPから不均一媒体の損失を防止することができる方法に基づいています。 3に均一なサイズで再現性のMCTSesの世代のために修正されたLOTの詳細な手順84ウェルプレート（WPS）は、ここに提示されています。原稿は、特に断面積の測定のために明確に定義された境界を持っていない、部分的に崩壊し、薬剤処理MCTSesで、MCTSサイズの評価のための半自動化ルーチンを示しています。

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プロトコル

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アガロースでコーティングされたプレートの調製

  1. 低融点アガロースの0.75グラムを計量し、血清を含まない（フェノールレッドの有無にかかわらず）マッコイ5A培地の100ミリリットルに追加します。電子レンジ内の溶液を加熱し、完全にアガロースを溶解するために、すべての1-2分を旋回。それを殺菌するための解決策をオートクレーブ。
  2. 約70℃にアガロースオートクレーブし冷却し、層流ボックス内の真空濾過により500ミリリットル、0.22μmのフィルター上部からそれをフィルタリングします。一度に全体のソリューションを使用していない場合はより小さなボリュームに0.75％フィルタリングアガロース溶液（FAS）を等分。低温室または4週間まで4℃の冷蔵庫で、このすぐに使用アガロース溶液を無菌的に保管してください。
  3. 70％エタノール（エタノール）でカセットコンビ試薬ディスペンサーとプライムにplastic-または金属傾け調剤カセットで小さなチューブを取り付け、その後、フローボックス内の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で。
  4. 使用前に、FAS私の保存されたアリコートを加熱 nは、マイクロ波は、溶融しました。総理アガロース溶液とコート384ウェル、組織培養（TC）との分注カセットは、FASの15μLとマイクロプレート「特別な」 - 処置しました。プレート内のアガロースは細胞を播種する前に、15〜20分間冷却してください。低温室で、または4℃、直射光からポリエチレン袋に包まれ、無菌的にアガロースコーティングしたプレートを保管してください。
    注：原液中のアガロースの濃度の変化を防止するために、0.75％FASの繰り返し加熱を避けてください。上記の条件で保存した場合、アガロースでコーティングされたプレートは、最長2週間保存することができます。 FASは、プレートのコーティング時の加熱を必要としません。
  5. カセットのヒントやチューブに残っているアガロースを除去するために、70〜80℃の滅菌水でそれをプライミングすることにより、分注カセットをきれいにしてください。

2.細胞培養およびMCTSの形成

  1. 培養ヒト結腸直腸癌HCT116細胞を、前述のように小娘= "外部参照"> 8。
  2. アガロースでコーティングされたの必要数を削除し、384ウェル、冷蔵保存からマイクロTC処理し、15分間室温（RT）にそれらを平衡化。
  3. 70％エタノールと滅菌PBSで標準管分配カセットをプライミングすることによって、細胞播種のためのコンビ試薬ディスペンサーを準備します。ディスペンサーの手動設定ボタンを使用して、メディアに必要μLに播種量と分注速度を調整します。
    注記：全細胞播種プロセスは、無菌条件下で層流ボックス内で行われます。
  4. 組換え細胞解離酵素を用いて組織培養フラスコから接着細胞を解離します。完全増殖培地50μL中ウェル当たり2.5×10 4細胞/ mlの密度でシード細胞と無菌ビーカー中の細胞懸濁液のストックを作ります。複数の384-WPを播種する際、ビーカーの底に沈降するのを防ぐために、マグネチックスターラーを用いて細胞をかき混ぜます。
  5. 許可しますプレートを室温で30分間休憩した後、4×gで15分間遠心分離します。
  6. 一方、蒸発還元環境蓋を取り、短辺中の滅菌H 8mLの2 Oまたは5％のジメチルスルホキシド（DMSO）で塗りつぶし5mLのピペット（ 図1A）を使用して（左および右）。まず、ゆっくりと上下にピペットチップを掃引することにより、左側の谷に液体を充填4mLのを分配します。右側の谷で、この手順を繰り返します。
    注：サイドトラフに追加された液体は、蓋の中央部で合流し、ガス交換（ 図1A）のためのギャップを残さないことを確認してください。蓋の外部にH 2 Oの浸透2 O結果Hの過剰量を添加し、続いて384ウェルTCプレートの外側のウェルに。
  7. （ 図2Aを滅菌H 2 Oで384ウェルTCプレートの液溜りを記入し、液体充填環境蓋との定期的なプレートの蓋を交換）。
  8. 湿度95％、5％CO 2及び20％O 2、37℃のロータリーインキュベーターにプレートを置き、そして細胞を4日間MCTSesに凝集することを可能にします。突然落下湿度レベルを防ぐために、後続の日には長すぎるためのインキュベーターの扉を開けないでください。

3.培地交換ロボットシステムを使用して

  1. MCTSの形成後4日目に、よく自動化されたマイクロプレートウォッシャーディスペンサーを使用して、あたり予め温め媒体の30μLを追加します。 MCTSesは、さらに3日間増殖することを可能にします。彼らは実験のために希望のサイズを達成するまで、定期的に3日ごとに培地を交換してください。
  2. 各ウェルから培地の定義されたボリュームを吸引するために、経験的にワッシャーマニホールドのz -heightを調整します。ウェルあたり培地を吸引30μL、新鮮な、予め温めた培地を30μLと交換してください。
    注：ディスペンシング速度を設定し、ワッシャーマニホールドがダウンして移動する速度最低速度でのウェルにウェル内の乱流を最小限に抑えることができます。

4. MCTSの高コンテンツイメージングと半自動画像解析

  1. 画像4X空気対物レンズを用いた高含量の自動画像化システムにおけるMCTS（NA 16）。
  2. 4×4に11ミリ秒とビニングに露光時間を設定して実験のために所望のようにウェル当たり全体MCTSをキャプチャするために数と間隔のz -stacksのとピクセルビニングを調整します。
  3. プログラミング言語で記述され、社内のルーチンを使用して "は、Readme」に記載されているように、画像を段階的に処理します。
    注：.mファイルコード.txtのreadmeファイルには、補助コードファイル（ 図1B）として入手可能です。ルーチン対策2D画像からMCTS面積、長軸と短軸、周囲、および堅牢。

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図1：環境蓋の調製と半自動ルーチンのフローチャート。正しい（左）および過剰の液体を充填する（右）の量（ここでは、5％DMSO）で充填された蒸発還元環境蓋の（A）画像。矢印は、液体を追加するための短辺のトラフを示します。アスタリスクは、DMSOの正しいボリュームの添加後、蓋の中央にあるギャップを示しています。 （B）半自動画像解析ルーチンに必要な手順を示すワークフロー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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結果

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特に、周辺井戸からの媒体の不均一な損失は、小さな培養容量を持つ国会議員で頻繁に遭遇する問題です。このような、よく制御された温度/加湿システムと蒸発低減国会議員とプレートの蓋付きインキュベーターと実質的に改善された培養条件は、井戸8を横切る媒体の重大な損失を低減します。相対蒸発を測定するために、オレンジG（OG）の等容積を各ウェルに添加し、3日間のOGの吸光度の変化は、標準、ロータリーインキュベーターで定期的かつ環境ふたを有するプレートに記録しました。プレートウェルプレート（ 図2A）の端からの距離に基づいて6つのグループに分けました。グループ1-4では、標準のインキュベータ（ 図2B）で定期的にふたを有するプレートの経時OGの吸光度に大きな変化がありました。 OGの吸光度の変化からもありましたが、グループ環境蓋/回転式インキュベーターの組み合わせ（ 図2C）の下のプレート中の1ウェルは、変動係数（CVが）標準インキュベータ（...

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ディスカッション

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フィルタリングされたアガロースで384ウェルTCプレートをコーティング

LOTにおける標準的技法を被覆するアガロース、アガロースを必要とする、及び/又は分配ユニットは、アガロース6のゲル化を防ぐために加熱保持するプレートを1〜1.5％の低融点を使用することです。直径が0.2〜0.4ミリメートルの範囲の小さなチューブ開口を有する液体分注カセットを使用して複数のプレートを準備している間、アガロースのゲル化は、潜在的な関心事です。それは分配中は追加の加熱を必要としないように分配するカセットを目詰まりの潜在的な問題を克服するために、0.75％FASは、使用されました。なお、それはまた、0.75％FASはとして急速に濾過されていない1〜1.5％、またはさらには0.75％アガロース溶液としてゲル化しないことが観察されました。 0.75％FASを使用して、分注カセットを詰まらせることなく被覆する35未満の全384ウェルTCプレートをとります。カセットは、残留Aを除去するために加熱された水でプライミングすると、最後に洗浄することができますカセットを使用して...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

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この作品は、チェコ教育省、青年、およびスポーツ（LO1304）、チェコ共和国の科学技術振興機構（TE01020028）からの助成金によってサポートされていました。著者は、環境蓋の静止画を撮影するための博士ラクシュマンバラナシに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースシグマ アルドリッチA9414低融点
マッコイズ 5A ミディアムシグマ アルドリッチM8403
インチラピッド"FiltermaxフィルターTPP995050.22 μm、500 mL
マルチドロップ&トレード;Combi試薬ディスペンサー サーモフィッシャーサイエンティフィック5840300
スモールチューブディスペンシングカセット サーモフィッシャーサイエンティフィック24073295メタルチップ 
384ウェルTCプレート PerkinElmer6057308プレートタイプ - CellCarrier
スタンダードチューブ分注カセットサーモフィッシャーサイエンティフィック24072670
MicroClime 環境蓋LabcyteLLS-0310
DMSOSigmaD4540
ロータリーインキュベーター (SteriStore)HighRes Biosolutions23641シリアル番号:D00384
マイクロプレートウォッシャーディスペンサー BioTek不特定のモデル: EL406 
ハイコンテントイメージングシステム(CellVoyager)横河電機株式会社詳細不明Model:CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE™Express recombinant cell dissociation reagentサーモフィッシャーサイエンティフィック12604021フェノールレッドフリー

参考文献

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