方法論記事

モノクローナル抗体認識リニアB細胞エピトープのペプチドスキャンアシスト識別

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DOI：

10.3791/55417

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2017年3月24日

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

この記事について

サマリー

ここでは、著者らは、精製されたモノクローナル抗体とドットブロットハイブリダイゼーションによるペプチドスキャンを使用して、線状抗原エピトープを定義するためのシンプルで効率的なプロトコルを提示します。同定されたエピトープは、その後、治療および診断アプリケーションに使用できます。

要約

免疫系による抗原エピトープの同定は、ワクチン及びペプチド薬物の開発を容易にすることができる中和抗体の防御機構の理解が可能になります。ペプチドスキャンは直接的モノクローナル抗体（mAb）によって認識される線状エピトープをマッピングする簡単かつ効率的な方法です。ここで、著者らは、中和モノクローナル抗体を使用して神経壊死症ウイルスコートタンパク質の抗原認識のために直列に切り捨て組換えタンパク質、合成ペプチドの設計、およびドットブロットハイブリダイゼーションを含むエピトープ決意方法を提示します。この技術は、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜上に合成ペプチドとモノクローナル抗体のドットブロットハイブリダイゼーションに依存します。 RG-M56モノクローナル抗体により認識されるウイルスコートタンパク質の最小の抗原性領域は、6量体ペプチドエピトープにペプチドマッピングをトリミングステップ・バイ・ステップによって絞り込むことができます。また、アラニンスキャニング変異誘発、残渣サブstitutionエピトープを構成する各アミノ酸残基の結合重要性を特徴付けるために実施することができます。エピトープ部位に隣接する残基は、ペプチドのコンホメーションの調節において重要な役割を果たすことが見出されました。同定されたエピトープペプチドは、X線回折研究および機能競合のために、または治療のためのエピトープペプチド - 抗体複合体の結晶を形成するために使用することができます。

概要

免疫系では、V、D、およびJセグメントの再結合は、抗体が、病原性感染からホストを保護するために、種々の抗原に結合するための相補性決定領域（CDR）の多大な変化を作成することを可能にします。抗原に対する抗体の中和防衛は、抗体のCDRと抗原のエピトープとの間の空間的な相補性に依存します。したがって、この分子間相互作用の理解は、予防ワクチンの設計および治療用ペプチド薬剤の開発を支援します。しかしながら、この中和相互作用は、単一の抗原からの複数の抗原性ドメインにより、その結果エピトープ決意プロセスをより複雑にする抗体の複数のCDR、の両方によって影響され得ます。幸いなことに、骨髄腫細胞と個々の抗体産生細胞を融合ハイブリドーマ技術の開発は、秒細胞の恒常分割バッチを可能にしますモノクローナル抗体（mAb）として知られている網一つの特定の抗体、1。ハイブリドーマ細胞は、特定抗原の単一の抗原性ドメインに結合するために、これらの純粋な、高親和性モノクローナル抗体を産生します。確立された抗原 - 抗体、ペプチドスキャンを含むいくつかの方法の関係で、その対応するモノクローナル抗体を用いて抗原のエピトープを決定するために用いることができます。合成ペプチド技術における最近の開発は、ペプチドスキャン技術をよりアクセスし、実行することがより便利になりました。簡単に述べると、重複する合成ペプチドのセットは、標的抗原の配列に従って製造されたmAbのハイブリダイゼーションのための固体支持膜に関連しています。ペプチドスキャンは、抗体結合領域をマッピングするための簡単な方法を提供していますが、また、エピトープペプチドと抗体のCDRの各アミノ酸残基との間の結合相互作用を評価するために、残留物をスキャンまたは置換によりアミノ酸（AA）突然変異誘発を促進するだけでなく。

ここで、本研究は、中和モノクローナル抗体2、3、4を使用して、黄色のハタ神経壊死症ウイルス（YGNNV）コートタンパク質の線状エピトープの効率的な同定のためのプロトコルについて説明します。プロトコルは、mAb製剤、連続切断型組換えタンパク質の構築および発現、合成重複ペプチドの設計、ドットブロットハイブリダイゼーション、アラニンスキャニング、および置換突然変異を含みます。ペプチド合成の高いコストを考えると、直列に所望の標的タンパク質の組換えタンパク質を切り捨てるステップは、変更された、および合成ペプチドアレイドット - ブロット分析を行った前の抗原性領域は、約100〜200アミノ酸残基に絞りました。

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プロトコル

モノクローナル抗体の作製

  1. 培養物を5％CO 2補充37ºCで175Tフラスコ中の無血清培地中のRG-M56マウスモノクローナルハイブリドーマ細胞2。媒体の色は、インキュベーションの5日後に黄色になるときに、上清を収集します。
    注：ハイブリドーマ細胞は、ウシ胎児血清からの抗体の混入を避けるために、無血清培地で培養しました。
  2. 4ºCで30分間、4500×gで上清を遠心し、細胞破片ペレットを捨てます。
  3. 5 mLのカラム（50％スラリーとして供給される）プロテインGアガロースの2 mLを加え、氷冷PBSの10樹脂体積（10mL）で平衡化。
  4. 抗体上清の負荷200 mLをカラムに（ステップ1.2）とパススルーを捨てます。
  5. それを洗浄するために列に氷冷PBSの10 mLを加え。二回繰り返します。
  6. プロテインG-関連抗体を溶出するカラムに50 mMグリシン、pHが2.7の10ミリリットルを追加します。コル10倍の中和緩衝液（1Mトリス、1.5 MのNaCl、および1mM EDTA、pH8.0）を100μLを含むマイクロチューブに900μLの分画をLECT。
  7. -20ºCで0.03％のNaN 3で50％グリセロール中で精製された抗体を保管してください。

2.構築およびシリアル切り捨てられた組換えタンパク質の発現

  1. （10倍のPfu緩衝液の5μL、各dNTP 0.2mMの、0.2μMのフォワードプライマー3、0.2μMリバースプライマー3、2 mMのMgSO 4を、のpET20b-1A59 3プラスミドDNA 1ngの、および2.5 U：PCR反応混合物を準備しますPfu DNAポリメラーゼの単位）。 50μLの最終容量までのddH 2 Oを追加します。
    1. 自動サーマルサイクラー中で実行したサンプル次のパラメータを使用して：サイクル1（5分94ºC）。サイクル2-36（30秒94ºC、30秒間63ºC、60秒72ºC）。サイクル37（7分72ºC）。
  2. 以下の制限酵素消化を容易にするために、PCR精製キット5を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物を抽出します。
  3. んで IおよびXho I制限酵素でPCR増幅DNA断片を消化し、NdeIおよびのXhoI酵素切断PET-20B（+）ベクターにこれらのDNA断片の各々を連結。 6 大腸菌 DH-5α-コンピテント細胞にコンストラクトを変換します。
    1. PCR増幅DNAまたはPET-20bの1μgの消化緩衝液（20 mMトリス酢酸、10mMのMgの（CH 3 COO）2、50mMのKCH 3 COO、および1mM DTT、pHは7.9）での消化混合物を準備しますNdeIおよびXhoI制限の（+）ベクターDNA、および2 Uは、20μLの最終容量で酵素。
    2. 優しく消化混合物を混合し、すぐにスピンダウン。制限SITの完全な切断を確実にするために、乾燥槽中で2時間、37ºCでインキュベートしますエス。
    3. 以下のプラスミドの構築を容易にするために、PCR精製キット5を用いて、制限酵素消化DNA断片を抽出します。
    4. 予め消化、PCR増幅DNAの100 ngの、予め消化のpET-20bの10 ngの（+）とライゲーションバッファー（66 mMトリス、5mMのMgCl 2、1mMのATP、および5mM DTT、pH7.5）を内ライゲーション混合物を準備しますベクターDNA、および10μLの最終容量で5 UのT4 DNAリガーゼ。
    5. 優しく連結混合物を混合し、すぐにスピンダウン。水浴中で18時間、16ºCでインキュベートします。
    6. DH-5α-コンピテント細胞の100μLにライゲーションサンプルの10μLを入れ、30分間氷上でマイクロ遠心チューブを配置する前に、穏やかに混合します。ヒートショック7を誘導するために90秒間42ºCで乾燥浴中にマイクロチューブを入れてください。すぐに2分間氷上にチューブを移します。
    7. ルリア - ベルターニ（LB）ブロス（1％バクトトリプトン、0.5％バクト酵母extracの900μLを追加管にT、および0.5％のNaCl、pH7.0）に。 150 rpmで45分間振盪しながら37ºCでインキュベートします。 10分間4000×gでの遠心分離により細胞をペレット化し、上清を捨てます。
    8. LBブロスの50μLでペレットを再懸濁し、100μg/ mLのアンピシリンを含む予め温めたLBプレート上に各変換を広げます。 16時間37ºCでプレートをインキュベートします。
    9. 200μLチップを用いて、単一のコロニーをピックアップし、ゆるくキャップした15 mLチューブに100μg/ mLのアンピシリンを含むLBブロス3mLの中にそれを配置します。 150rpmで12時間振盪しながら37ºCでインキュベートします。
    10. 各培養物からプラスミドDNA 8を抽出し、シーケンス9を確認するために、T7プロモーターとT7ターミネータープライマーを用いて配列決定します。
  4. 配列確認後、当社による大腸菌のBL-21（DE3）株にYGNNVコートタンパク質遺伝子の長さを変化させて、これらのpET-20bは（+）プラスミドからDNA 10ngの変換ヒートショック法7る。手順に従ってください2.3.6-2.3.8変換を実行します。
  5. ゆるくキャップした15 mLチューブに100μg/ mLのアンピシリンを含む3mLのLBブロスに各形質転換した大腸菌 BL-21細胞からの単一コロニーを転送します。 150 rpmで振盪しながら37ºCで培養物をインキュベートします。
  6. 文化のOD 600が約0.6のとき25ºCに文化を冷却し、組換えタンパク質の発現を誘導するために最終濃度0.4mMになるようにIPTGを追加します。 200 rpmで振盪しながら25ºCで余分4時間培養をインキュベートします。
  7. マイクロ遠心チューブに培養液を1mLを転送します。 1分間12,000×gの遠心分離により細胞をペレット化し、上清を捨てます。
  8. マイクロピペットでピペッティングすることによって、およびダウン変性緩衝液100μL（8M尿素、20mMリン酸ナトリウム、及び0.5MのNaCl、pH7.4）中で細胞ペレットを再懸濁します。活発ボルテックスで混和します。
    注：サンプルゾルutionsは今、半透明の少し粘着性、およびドットブロットハイブリダイゼーションアッセイのために準備する必要があります。

重複ペプチドの3設計と合成

  1. 設計と各ドットブロット法によりRG-M56 mAbのエピトープ領域を絞り込むためにYGNNVコートタンパク質の195から338のaa領域からの10アミノ酸残基によって、その後継と重なる3シリアル20量体ペプチドを合成します。
  2. ドットブロット法により195から206アミノ酸のエピトープ領域を絞り込むために、次の合成ペプチドに6アミノ酸残基のオーバーラップで3 3 8マーペプチド（195 VNVSVLCR 202、197 VSVLCRWS 204、および199 VLCRWSVR 206）を設計し、合成します。
  3. 設計と3 7マーを合成（196 NVSVLCR 202と195 VNVSVLC 201）、6量体（195 VNVSVL 200、196 NVSVLC 201、および1その隣接するペプチド上に97 VSVLCR 202）、および5量体ペプチド（195 VNVSV 199、196 NVSVL 200、それぞれ197 VSVLC 201、及び198 SVLCR 202）6のオーバーラップを有する、5、4アミノ酸残基は、最小限にしますドットブロットによるエピトープ領域。

4.ドットブロットハイブリダイゼーション

  1. 10mg / mLの最終濃度になるようにジメチルスルホキシド（DMSO）中の各合成ペプチドを溶解させます。
    注：合成ペプチドの多様な溶解性を克服するために、すべての合成ペプチドは、DMSO中に溶解されるべきです。 DMSOは完全に疎水性又は親水性ペプチドを溶解する良溶媒です。
  2. 2分間メタノールでポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜を浸します。
    注：PVDF膜は、DMSOに耐性の100％までです。他の人はそうではないかもしれません。
  3. ために修飾Towbin緩衝液（25 mMトリス、192 mMグリシン、0.1％SDS、pHが8.3）でPVDFメンブレンを平衡化2分。
    注：10〜20％（v / v）のメタノールの転送結果を改善するように改変Towbin緩衝液に添加することができます。
  4. 修正されたTowbin緩衝液でクロマトグラフィー紙を洗浄します。クロマトグラフィーペーパー上にPVDF膜を配置します。修正されたTowbinバッファが次のステップに進む前に、PVDF膜表面から消失するまで待ちます。
  5. 10μLチップでメンブレンに各ペプチドサンプルの2μLを追加します。 10分間クロマトグラフィーの紙にPVDF膜に空気が乾燥します。あまりにも多くの拡散を避けるために、膜上にゆっくりと徐々に各ペプチドサンプルを追加します。
  6. 穏やかに振盪しながら室温で30分間、5％脱脂乳でTBST緩衝液（0.05％（v / v）のTween-20を、20mMのトリス、および150mMのNaCl、pH7.4）中で膜をブロックします。
  7. 膜への5％脱脂乳でTBST緩衝液1,000：1の最終希釈でRG-M56モノクローナル抗体を追加します。穏やかに振盪しながら1時間、37ºCで膜をインキュベートします。
  8. そう抗体を除去リューション。穏やかに振盪しながら5分間、TBST緩衝液中で膜を洗浄します。二回繰り返します。
  9. 膜を5％脱脂乳を有するTBST緩衝液で5,000：1の最終希釈で二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、Fcを、アルカリホスファターゼ結合）を加えます。穏やかに振盪しながら1時間、37ºCで膜をインキュベートします。
  10. 抗体溶液を廃棄してください。穏やかに振盪しながら5分間、TBST緩衝液中で膜を洗浄します。二回洗浄ステップを繰り返します。
  11. 暗所で15分間、室温でBCIP / NBT基質溶液を有する膜を開発。信号が表示されたときのddH 2 Oで膜を洗浄することにより現像を停止します。
  12. 膜を空気乾燥し、画像システムを用いたドットブロットの画像を取り込みます。
  13. 画像解析ソフト3を使用して、各ドットブロットの強度を測定します。

5.アラニンスキャニングと交代

  1. 3アラニンおよびメティを設計・合成onine置換ペプチド。 VAVSVLCR 202、195 VNASVLCR 202、195 VNVAVLCR 202、195 VNVSALCR 202、195 VNVSVACR 202、195 VNVSVLAR 202 8-merペプチド195 VNVSVLCR 202のために、アラニンで各アミノ酸残基を交換し、合成ペプチド195 ANVSVLCR 202、195、および195 VNVSVLCA 202 。 VNVSVMCR 202 SJNNV遺伝子型エピトープペプチド195を作成するために、メチオニンへのaa残基のロイシン200を交換してください。
  2. アラニンスキャニングおよび置換変異誘発は、ドットブロッティング実行するために第4節に従ってください。

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結果

この実験の目的は、mAbを用いて、ドットブロッティングを通じてエピトープを同定することでした。迅速かつ効率的にモノクローナル抗体によって認識される抗原性領域を絞り込むために、C末端での6×His融合タグを有する完全長およびシリアル切り捨てYGNNV組換えコートタンパク質は、 大腸菌 pET発現システム10（ 図1A）から発現させました。得られた組換えタンパク質は、ドットブロットハイブリダイゼーションのためにRG-M56 mAbおよび抗た6×His抗体を用いてPVDF膜上にスポットしました。ドットブロット法は、1から338のaa（全長）、51から338アミノ酸、および195から338 aaのではなく、1-100 AAまたは1-200 aaの組換えタンパク質（ 図1B）に対する陽性シグナルを明らかにしました。ドットアレイは、抗の6xHis抗体に対してハイブリダイズし、すべての組換えタンパク質の発現を確認しました。これらのデータは、RG-M56モ...

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ディスカッション

このプロトコルは、mAb-認識線形エピトープを同定するための迅速かつ簡単な手法を提供しています。考慮ペプチド合成およびペプチド合成の生産効率のコストを考えると、ウイルスコートタンパク質の抗原性領域は、ペプチドスキャン分析の前に直列に切り捨て組換えタンパク質を発現させることによって減少しました。 10 kDaの50の間の分子量を有する組換えタンパク質は、容易にこのシステムを介して発現させることができるようにこのように、信頼性の高い効率的な大腸菌 pET発現系は、これらの連続切断型組換えタンパク質を産生するために使用しました。この方法では、エピトープは、簡単より扱い100〜200アミノ酸領域に絞り込むことができます。それの6xHisタグを発現させるためのコードは、製造の6xHisタグ融合タンパク質の発現を確認するために、抗た6×His抗体を用いて免疫検出することを可能にすること配列を含有するようにPET-20B（+）ベクターは、特に、選択されました組換えProteins。産生された組換えコートタンパク質は、次いで、ドットブロットハイブリダイゼーションアッセイを介してRG-M56モノクローナル抗体を用いて分析しました。組換え...

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開示事項

著者らは、このレポートに関連する利益相反を持っていません。

謝辞

著者は、ペプチド合成とDNAシーケンシングに関する専門知識を提供してくださった、Academia SinicaのInstitute of Cellular and Organismic Biology（ICOB)のコアファシリティのMiss Ching-Chun Lin氏とMiss Diana Lin氏に感謝します。この研究は、中央研究院の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ハイブリッドSFM培地Gibco12045-076
ダルベッコスリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco21600-069
Pfu DNA ポリメラーゼ サーモサイエンティフィック EP0502 バッファを含める
T4 DNAリガーゼRoche10799009001インクルーデッドバッファー
NdeI ニューイングランドバイオラボR0111S
バッファーXhoI を含む;ニューイングランドバイオラボR0146S緩衝液を含む
pET-20b(+)ベクトルNovagen、メルクミリポア69739
大腸菌DH-5&α;コンピテントセルRBCバイオサイエンスRH617
大腸菌BL-21(DE3)コンピテントセルRBCバイオサイエンスRH217
アンピシリンアムレスコ0339-25G
LBブロス Invitrongen12780-052
イソプロピルチオ-β;-D-チオガラクトシド (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
メタノールメルク ミリポア106009
ポリオキシエチレン 20 ソルビタン モノラウレート (Tween-20)J.T.BakerX251-07
ジメチルスルホキシド (DMSO)SigmaD2650
グリシンアムレスコ0167-5KG
トリスAffymetrix、USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
グリセロールAmresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
ヤギ抗マウスIgG、Fcフラグメント抗体Jackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (ポリフッ化ビニリデン、PVDF)メルク ミリポアIPVH00010
プロテイン G アガロース ファストフローメルク ミリポア16-266
QIAquick PCR 精製キットQiagen28106
UVP BioSpectrum 600 イメージシステムUVP該当なし
VisionWorks LS 解析ソフトウェア Ver 6.8UVP該当なし
MyCycler サーマルサイクラーBioRad1709713

参考文献

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