BrUTP本鎖特異的転写ランオン（TRO）のアプローチを使用した転写の終結の分析

サマリー

出芽酵母における鎖特異的転写ランオン(TRO)アプローチによるBrUTPを用いたin vivoでのRNAポリメラーゼIIによる転写の終結解析のための基本的な実験的アプローチについて説明します。このプロトコールは、酵母および高等真核生物における他のRNAポリメラーゼによる転写終結を研究するために拡張することができます。

要約

この原稿は、 インビボで転写終結欠陥を検出するためのプロトコルを記述しています。 BrUTPを使用して本鎖特異的TROプロトコルは、ここで説明する生理学的条件下で転写終結欠陥を分析するための強力な実験的アプローチです。伝統的なTROアッセイと同様に、転写終結欠陥¹の指標として遺伝子の3 '末端を越えて転写的に活性なポリメラーゼの存在に依存しています。これは、従来のTROアッセイで遭遇する二つの主要な問題を克服します。終結シグナルを読んポリメラーゼがプロモーター近位領域からの転写を開始したものであれば第一に、それを検出することができ、またはそれは単にどこか身体または3 '内から非特異的に開始した広範囲に転写ポリメラーゼを表している場合遺伝子の末端。第二に、超えた場合に転写活性ポリメラーゼ信号を区別することができますターミネーター領域は、真に読み通しセンスmRNAの転写ポリメラーゼまたはターミネーターが開始非コードアンチセンスRNAの信号です。簡単に言えば、プロトコルは、精製された新生RNAを転写し、使用してcDNAを増幅する逆、指数関数的に増殖する酵母細胞を透過性BrUTPヌクレオチドの存在下で伸長するためにインビボで開始される転写を可能にする、親和性アプローチによってBrUTP標識RNAを精製することを含みますプロモーターと遺伝子²のターミネーター領域に隣接する鎖特異的プライマー。

概要

真核生物の転写サイクルは、次の3つの主要手順で構成されています。開始、伸長および終結。 RNAポリメラーゼIIによる転写の終結は、2つの異なる、相互に依存する手順³で構成されています。最初のステップは、テンプレートからの切断、ポリアデニル化およびmRNAの放出を伴う、とすぐにテンプレートからのポリメラーゼの離脱によってマーク第二段階が続きます。適切な終端は、転写の開始/再開時のポリメラーゼのリサイクルのため、下流の遺伝子の転写との干渉を防止するため、および広汎非コードRNA ^4、5の転写を制限することによって、チェックで異常な転写を維持するために不可欠です。最近の進歩にもかかわらず、終了ははるかにRNAポリメラーゼII転写サイクルの少なくとも理解のステップです。信頼性の高い終端アッセイは、メカニズムを研究するために不可欠であるunderlyinin vivoでの RNAポリメラーゼIIによる転写のグラム終結。

実験的アプローチの数は、生理的条件下で活発に転写遺伝子に終止欠陥を検出するために使用されます。これらには、ノーザンブロット、終結因子チップ（クロマチン免疫沈降）、伝統的なTROアッセイが含まれます。これらの技術のそれぞれは、いくつかの利点と欠点を有します。伝統的なTROアッセイは、 インビボ ¹ における転写終結の欠陥を検出するための最も信頼性の高い敏感なアプローチに使用されます。このアッセイは、細胞内の遺伝子の異なる領域に転写活性のポリメラーゼ分子を局在化します。通常の条件下では、アッセイは、厳密遺伝子（ 図1A）のプロモーター及びターミネーター領域との間で分配転写係合ポリメラーゼ分子を示します。不良終了時に、しかし、ポリメラーゼは、終了信号を読み取ることができません遺伝子（ 図1B）の3 '末端の下流の領域で検出されます。

転写終結欠陥がプロモーター近位領域から開始センス転写ポリメラーゼの存在下で明らかにし、終了信号を読み取ることができないされ、 図に示すように、遺伝子の3 '末端の下流の領域を転写続けます2A。真核生物のゲノムおよび遺伝子^{6、7、8、9、10}の周りに圧倒的な普及意味で転写、ならびにアンチセンス方向を示す実現して、それはすぐに従来のTROアッセイは検出できないことが明らかになったポリメラーゼIF信号遺伝子の下流には、プロモーター、開始転写産物（ 図2A）またはSOMを開始した異常なRNAを表し、遺伝子またはターミネーター要素（ 図2B）、または遺伝子（ 図2C）の3 '末端からアンチセンス方向のポリメラーゼ転写の下流の途中でewhere。観察されたリードスルーポリメラーゼ信号がプロモーターで開始さ拡張センスmRNAまたは検査中の遺伝子の下流を開始したアンチセンス転写物を表す場合は使用してBrUTPは、ここで説明する本鎖特異TROアッセイは、区別することができます。我々は成功した酵母^2出芽における転写の終結でKin28キナーゼの役割を実証するために、このアプローチを使用しています。ここでのアプローチを採用我々はRna14は出芽酵母におけるASC1の転写の終結のために必要とされていることを示しています。

プロトコル

注：このメソッドはMedler、Sおよびアンサリ、A ²で報告された研究論文で使用されました。

1.培養および収穫細胞

1. 新たに画線サッカロマイセス・セレビシエプレートからYPD培地中の細胞の5mLの培養を開始する（を10g / L酵母抽出物が20g / Lペプトン、2％デキストロース）。
2. 30℃、250 rpmでオービタルシェーカーで一晩細胞を増殖させます。
3. 250mLのバッフル付きフラスコ中のYPD培地中で100mLの最終容量まで一晩成長させた培養物を100倍に希釈します。
   注：文化の100ミリリットルの合計は、TROの反応ごとに必要とされています。複数の反応が必要な場合は、文化の大容量を使用する必要があります。
4. 600 nmの（ - 1.0 _600〜0.8）で1.0から0.8の光学密度に細胞を増殖させます。
5. 滅菌した50 mLのコニカルチューブ中で4℃で5分間、820×gでの遠心分離によって細胞を回収。
6. 氷冷TMN府の10 mLの細胞を再懸濁ffer（10mMのトリス-HCl pH7.5で、5mMのMgCl _2、100mMのNaCl）と氷上で5分間インキュベートします。
7. 細胞をペレット化するために4℃で5分間、820×gで遠心分離します。静かに吸引して上清を除去します。

2.透過性にして、Run-上のアッセイのための細胞を準備

1. 切り捨てられたP _千チップを用いて穏やかに上下にピペッティングし、0.6％のサルコシル溶液1mLで細胞を再懸濁します。チルド1.5 mLのマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を転送します。
2. プラットフォームシェーカー上で25分間、4℃で穏やかに細胞を振ります。
   注：微量遠心チューブは、この段階でプロモーターで生じる新しい開始事象の可能性を回避し、低温を維持するために氷で50 mLコニカルチューブに充填されるべきです。
3. 卓上冷却遠心機を用いて4℃で6分間、1200×gで細胞を遠心。
4. 静かあたりから余分な液体を除去するために上清を吸引細胞ペレットをmeabilized。

3.転写ランオンの反応

1. 転写ランオンバッファの150μLを加える（50 mMトリス-塩酸pHが7.5、100のKCl、10mMのMgCl ₂を、2 mMのDTT（ジチオスレイトール）、0.75 mMのATP、CTP、GTP、およびBrUTP、200 UのRNaseの各透過性細胞ペレットに対する阻害剤）。
2. ピペッティングによって切り捨てられたP ₂₀₀チップを用いてダウン穏やかに混合します。
   注：複数のサンプルを処理する場合は、すべてのサンプルが準備が整うまで氷上にすべてを保持し、次のステップに進みます。
3. 水浴中で30℃で5分間インキュベートします。
   注：新生RNAにBrUTPの最適な取り込みを確実にするために1〜5分の間のインキュベーション時間を調整します。
4. 冷たいすぐに使用できるRNA単離試薬500μLを加えて反応を停止します。室温で5分間インキュベートします。

4. RNA抽出

1. セルsuspensiに酸洗浄ガラスビーズの200μLを追加（ステップ3.4）に、ボルテックスミキサーで4℃で20分間激しく振ります。
2. ホット22 G針を使用して、マイクロチューブの底に穴を開け、15-mLの滅菌コニカルチューブの上に置きます。
3. 細胞溶解物を収集するために4℃で1分間、300×gで遠心分離します。 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに細胞溶解物を転送します。
4. 細胞溶解物に冷たいRNA単離試薬とクロロホルムの200μLの500μLを追加します。 4℃で20分間、16168×gでボルテックスミキサーや遠心分離機上のコンテンツを混ぜます。
5. 新しいマイクロチューブに上部の水相を転送します。
6. pHが4-5コールドフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを等量の（：：24 1 125）を追加します。 4℃で15分間、16168×gでボルテックスミキサーや遠心分離機に激しく振ります。
7. 新しいマイクロチューブにRNAを含む上部の水相を転送します。繰り返しステップ4.6をさらに2回。
8. 最終的なRNAを含む水相に、5 MのNaCl STOCを追加0.3 Mの最終濃度は、RNAを沈殿させるために冷エタノールの3倍のボリュームを追加取得するにはKです。
   1. 1時間または一晩-20℃でインキュベートします。
      注： - 抗BrdUビーズは（ステップ5.3参照）、ブロッキングインキュベートされている間に4.11のステップ4.9を実行します。
9. 4℃で20分間、16168×gで遠心分離します。上清を除去し、DEPC（ジエチル）100μLの水でRNAペレットを再懸濁します。
10. 取り込まれていないBrUTPヌクレオチドからRNAを分離するために、RNA単離ミニキットを使用してください。 RNaseフリー水100μLを用いてカラムからRNAを溶出。
11. 5分間65℃の水浴中でRNAをインキュベートした後、少なくとも2分間氷上に移します。

BrUTP標識RNAの5アフィニティ精製

1. 3MのNaCl、0.2 MのNaH ₂ PO _4：抗BrdUは、バッファ（20×SSPEを結合0.25×SSPE（ナトリウム生理食塩水リン酸EDTA）の500μLを追加し、ビーズを定住の25μLへ、0.02 M EDTA、pHが7.4、1 mMのEDTA、0.05％のTween、37.5 mMのNaCl）で。 4℃で30秒、200×gで遠心分離し、上清を除去します。
2. 繰り返しステップ5.1 3回。
3. ビーズを緩衝液（1×結合緩衝液、0.1％ポリビニルピロリドン、1mgの超高純度ウシ血清アルブミン（BSA））をブロッキングの500μLを加え、1穏やかに振る - プラットフォームシェーカー上で4℃で2時間。
4. ステップ5.1で説明したように、結合緩衝液500μLでビーズをさらに2回洗浄します。
5. ビーズに結合緩衝液400μLを加えます。
6. ビーズに直接RNAの100μL（ステップ4.11から）を転送します。プラットフォームシェーカー上で4℃で2時間 - 穏やかが1振盪しながらインキュベートします。
7. 結合緩衝液500μL、低塩緩衝液の500μL（0.2×のSSPE、1 mMのEDTA、0.05％のTween）、高塩緩衝液500μL（0.25×SSPE、1 mMのEDTA、0.05％Tweenでビーズを順番に洗って、で回転100mMのNaCl）、および二回TET緩衝液（1×TE、0.05％のTween）の500μLと、各洗浄の間に4℃で30秒間、200×gで。
8. 150μlので二回、順次ビーズからBrUTP標識したRNAを溶出し、一回の溶出緩衝液（20mMのDTT、150mMのNaCl、50mMのトリス-HCl pH7.5で、1mMのEDTA、0.1％SDS）200μlで、インキュベートすることにより清からビーズを分離するために、短いスピンに続いて水浴中で42℃で4分間。

BrUTP標識RNAの6降水

1. BrUTPは、RNAを標識したアフィニティー精製に5 - pHが4冷たいフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（：：24 1 125）の500μLを追加します。 4℃で15分間16168×gでボルテックスミキサーや遠心分離機に混ぜます。
2. 新しいマイクロチューブに上部の水相を転送します。
3. RNAを沈殿させ、0.3Mの最終濃度と冷エタノールの3倍の量を取得するために、5 M NaCl貯蔵を追加します。
4. -20℃で一晩インキュベートします。
5. 4℃で30分間16168×gで遠心分離することによって沈殿したRNAを収集します。
6. 上清を除去し、10分間空気乾燥さペレットを許可します。
7. DEPC水の26μLでRNAペレットを再懸濁します。
8. 分光光度計を用いて260nmの吸光度を測定することにより、最終RNA濃度を決定します。また、260/280比を決定します。 〜2の比率は、純粋なRNAサンプルを示します。
9. cDNA合成のために必要とされるまで-80℃でアリコート中のRNAサンプルを保管してください。

BrUTP標識RNAの7.逆転写

1. DEPC水を用いて100 ngの/μLにRNA濃度を調整します。各cDNA合成反応のためのRNA0.5μgのを使用してください。
   注：RNA鋳型の濃度が最適なcDNA合成を達成するために、0.5から1.0μgのに変化してもよいです。
2. 図3Aに示すように、ポリ（A）部位（終結部位）の下流に設計された複数のリバースプライマーを用いてRNAを逆転写。
3. 各逆転写反応には、RNAのtemplatμlの5を追加電子（0.5μgの）、1μLのdNTPミックス（各10mM）、リバースプライマーC、D、E、FまたはGの2μL（50μMずつ）とヌクレアーゼフリー水（ 図3Aを参照してください）。各チューブの最終反応容量は13μLです。
   注：逆転写反応の数は、cDNA合成のために使用されるリバースプライマーの数に依存します。たとえば、ASC1のために5リバースプライマーを使用したため、5逆転写反応を設定しました。 cDNA合成のために使用される逆方向プライマーに基づいてC、D、E、F及びGのような管をラベル。
4. 任意の二次構造配座を除去するために5分間65℃でサーモサイクラー中でRNA鋳型、dNTP混合物およびプライマーを含有するチューブをインキュベートし、少なくとも2分間、4℃に冷却します。
5. 1μLを加えるRNA鋳型とし、プライマー（ステップ7.4）を含む各チューブに転写酵素（200 U /μL）、4μLのバッファーと0.1 M DTTの2μLを逆転。上下静かにピペッティングで。
6. 60分間42℃でサーモサイクラーで反応混合物をインキュベートすることによって、逆転写を実行します。
7. 20分間65℃で逆転写酵素を不活性化します。
8. -20℃でのcDNAを保存したり、次のステップに進みます。

cDNAの8.増幅

1. ステップ7.8、1.0μLのフォワードプライマーB（10μM）、1.0μLから3.0μLのcDNAテンプレートを次のようにステップ7.8から（ASC1ためのC、D、E、FおよびG標識）各cDNA調製の増幅のためのPCR反応を行いますリバースプライマーCまたはDまたはEまたはFまたはG（10μM）、2.5μLの10×ポリメラーゼPCR緩衝液、0.5μLdNTPミックス（各10mM）、1.0μLのMgCl _2（2.5 mM）の、15.5μLのPCRグレードの水、および0.5 μL熱安定性ポリメラーゼ酵素。
   注：5 1：1の範囲のcDNA鋳型の種々の希釈液100は、PCR産物の収率を最適化するためにテストされるべきです。単一のプロモーター近位フォワードプライマーは、cDNAを増幅するために使用されます異なるリバースプライマーを用いて得られました。例えば、プロモーターの近くに位置する単一の順方向プライマーBはASC1ためのCからGへの5逆方向プライマーと組み合わせて使用​​しました。 BC、BD、BE、BFおよびBGは、図3（a）に示すように、それぞれC、D、E、FおよびGとラベル付けチューブに使用しました。
2. 以下の熱サイクルパラメータを用いてPCRを実行します。1サイクルで2分間95°C（ポリメラーゼの活性化のためのホットスタート）、30から40サイクル30秒（変性）、15秒間54℃、95℃（アニーリング） 5分（最終伸長）のために、1分（伸長）のために68°C、および1サイクル68℃。
   注：アニーリング温度は、使用する特定のプライマーに応じて変化し、伸長時間は、予想される生成物の大きさに依存して変化します。
3. 生成物の予想される大きさに応じて0.8％、1.5％、2％アガロースゲル上での電気泳動によりPCR産物を分離します。
4. エルKaderi らに記載のようにPCR産物を定量化します。 、2012 ^11。
   注：別の方法として、新生転写物の量を定量化するために、リアルタイムRT-qPCRの戦略を使用します。

結果

転写終結欠陥を検出する際にBrUTP鎖特異TRO手続きの適用性を実証するために、我々はrna14-1と呼ばれるRNA14の終端不良、温度感受性変異株を使用していました。 RNAポリメラーゼIIによる転写の終結でRna14の役割が選択された遺伝子¹のターミネーター近位領域でRNAを検出した伝統的なTROアッセイを用いて実証しました。非許容温度でrna14-1変異体におけるターミネーター領域を超えたRNA信号の検出が終了欠陥として解釈されました。観測信号は、しかしながら、 図2Bに示すように、遺伝子の3 '末端付近のどこかからの転写を開始広範囲に転写ポリメラーゼに帰することができます。決定的終了でRna14の役割を実証するために、我々はrna14-1にBrUTP本鎖特異的TROを行いました変異体および37℃での同質遺伝子野生型株。我々は、 図1Aに示すように、野生型株で、TRO信号は、プロモ...

ディスカッション

ここで使用される本鎖特異的TROプロトコルは、哺乳動物細胞¹²にGRO-のSeq（グローバルランオンシークエンシング）分析のために使用されるプロトコルから適応されました。我々は成功し、出芽酵母において新生転写を研究するためのプロトコルを変更しました。具体的には転写終結欠陥を分析するために、我々は、RNAの加水分解工程を取り除くことにより、更なるプロトコルを調整しました。これは、私たちは、具体的プロモーター領域の近くに転写開始部位から開始された完全長の新生転写産物を検出することができました。

意味のある結果を得るために細心の注意を払って行われるべきプロトコルでいくつかの重要なステップがあります。まず、プロトコルは指数関数的に増殖している酵母細胞を用いて行われなければなりません。対数期の細胞_（600〜0.8から1.0）この段階での細胞の大部分として与える最良の結果は、積極的に成長しており、堅牢な転写を発揮しています。第二に、RNAの単離ST4°C - epが2の間の温度で、可能な限り迅速に行われるべきです。 BR...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール混合物	Sigma-Aldrich	77619	pH 4-5
TRIzol 試薬	ライフテクノロジー	15596-026
RNase 阻害剤、ヒト胎盤	ニューイングランド バイオラボ	M0307S
アンチ BrdU ビーズ	サンタ クルス バイオテクノロジー	sc-32323AC
プロトコル II	ニュー イングランド バイオラボ	M03368L	または同等の酵素
アドバンテージ 2 ポリメラーゼ ミックス	Clontech	639201	または同等の酵素
5-ブロモウリジン 5' 三リン酸ナトリウム塩	サンタクルーズ バイオテクノロジー	sc-214314A
RNeasy ミニ キット	Qiagen	74104
ATP	ニューイングランド バイオラボ	N0451AA
CTP		N0454AA
GTP		N0452AA
超高純度ウシ血清アルブミン (BSA)	MC Labs	UBSA-100
Asc1 B			AGATTCGTCGTCGTCACAAGTCC
Asc1 C			GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC
Asc1 D			TGTACATTGTATTTTCGCAGCA
Asc1 E			GCCAAGGAGACTGAATTTAATG
Asc1 F			CTATGGAATGGGGTTTTTAAG
Asc1 G			GGTTATGGCAGACATGCCAC
5s cDNA			AGATTGCAGCACCTGAGT
5' 5s 逆			GGTTGCGGCCATATCTAC
3' 5s 逆			TGAGTTTCGCGTATGGTC