方法論記事

心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

DOI：

10.3791/55461

⸱

2017年4月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人工多能性幹細胞（hiPSC）が心筋細胞に由来からここでは、人間工学的心臓組織の生成を示しています。我々は、hERGチャネル阻害剤E-4031によって収縮力と収縮パターンの典型的な変化を分析するための方法を提示します。この方法は、心臓薬物スクリーニングのための堅牢性と適合性の高いレベルを示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心臓組織工学は、三次元力発生工学的組織を構成する技術が記載されています。基礎研究および前臨床医薬品開発におけるこれらの手順の実装のために、標準化された条件下での自動生成および解析のためのプロトコルを開発することが重要です。ここでは、異なる種（ラット、マウス、ヒト）の心筋細胞からエンジニア心臓組織（EHT）を生成する手法を提示します。技術は、24ウェルフォーマットで弾性ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポスト間解離、心筋細胞を含むフィブリンゲルのアセンブリに依存しています。三次元の、力発生EHTsは、鋳造後2週間以内に構成します。この手順では、週に数百EHTsの生成を可能にし、技術的に心筋細胞の利用可能性によってのみ制限される（0.4〜1.0×10 6 / EHT）。 auxotonic筋収縮の評価はmechanで変性インキュベーションチャンバーで行われますiCalの24ウェルプレートのためのインターロックと、このチャンバの上に配置カメラ。ソフトウェアは、カメラが各EHTにXYZ軸システムに移動制御します。 EHT収縮は、自動図形認識アルゴリズムによって検出され、そして力がEHTの短縮及びPDMSポストの弾性性質および形状に基づいて算出されます。この手順は、標準化された無菌条件下でEHTの高い番号の自動分析が可能になります。心筋細胞の収縮に対する薬物効果の確実な検出は、心臓薬の開発や安全性薬理のために重要です。私たちは、それが心臓の薬の安全性スクリーニングのための有望なツールであることを示す、人間EHTシステムは、人間の心臓の収縮速度で薬物応答を複製することを、hERGチャネル阻害剤E-4031の例を、示しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

例えば、薬物誘発性QT延長症候群のような心臓の副作用は、過去数年間にわたり、市場の撤退につながっています。統計は、すべての引き出しの約45％が心血管系1上の不要な影響によるものであることを示しています。高価な発達過程および承認した後に、この薬の失敗は、製薬会社にとって最悪のシナリオです。研究開発部門は、したがって、早期に不要な心血管系への影響の検出に焦点を当てています。経済的、倫理的な問題、動物実験を削減し、新しいin vitroスクリーニングアッセイでそれらを置き換えるための努力のために進行中です。

確立されたアッセイのセットは、米国食品医薬品局（FDA）と欧州医薬品庁（EMA）催不整脈薬の効果2の前臨床評価のためのガイドラインに含まれています。の分化に続いて体細胞を再プログラミングする技術人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）は、この研究分野3を押し上げました。現在では、 インビトロでヒト心筋細胞の新薬候補をスクリーニングする可能性を提供し、種間の違いの問題を回避できます。最近の心臓分化プロトコル4、 図5は、倫理的な懸念せずに心筋細胞の無制限の供給を提供します。しかし、収縮力の測定は、心筋細胞の生体パラメータの中で最も重要かつ最も特徴付けられ、十分に確立されていません。これは、成人心筋細胞と比較して、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（hiPSC-CM）の相対的な未熟6に関連しています。可能な進歩は、単一のセル7（操作心臓組織、EHT）から3次元心臓組織を操作することです。 EHTプロトコルは単一のマウスまたはヒト心筋8を埋め込むことに基づいていますSUP>、2つの可撓性ポリジメチルシロキサン（PDMS）ポスト24ウェル形式で11の間にフィブリンヒドロゲル9、10。数日以内に心筋細胞を単一細胞として自発的に収縮し始めると、セルラーネットワークを形成し始めます。 7-10日後、組織全体の巨視的収縮が表示されます。このプロセスの間に細胞外マトリックスは、直径と長さの減少につながる、改造されています。 PDMSの曲げEHT結果の短縮は、連続負荷に開発EHTで心筋細胞を施す、残りの間にも投稿してください。 EHTsは数週間にわたってauxotonic筋肉の収縮を実行し続けます。ヒトEHTsは、薬物スクリーニングおよび疾患モデリング7のためのそれらの適合性を示す生理学的および薬理学的刺激に対する応答を示します。

本稿では、我々はgeneratiための堅牢かつ簡単なプロトコルを提示します人間EHT、およびhERGチャネル阻害剤の存在下での収縮パターンの濃度依存性の変化を自動的に収縮分析の上。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注：次の手順は、細胞培養プロトコルを記述します。無菌条件下で実行し、予熱したメディアを使用してください。

hiPSCの1.心臓分化

  1. hiPSCを育成
    1. 成長因子低減基底膜マトリックスで被覆6ウェルプレート（1ミリリットル/ウェル）又はT75フラスコ（7ミリリットル/フラスコ）（ 例えば geltrex、1：200;材料の表を参照）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中に希釈するための37°Cで30分間。基本2mMのL-グルタミンを含むDMEM / F-12培地、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、5 mg / Lのトランスフェリン、5μgの/ Lセレン、0.1％ヒト血清アルブミン、1×脂質ミックス、5を混合することにより媒体FTDA 12を準備mg / Lのインスリン、50nMのドルソモルフィン、2.5 / mlのアクチビンA、0.5 / mlのヒトTGFß1及び30 / mlのFGF2。
    2. 37°C、5％CO 2、毎日培地を交換しながら、21％のO 2（AT FTDA培地と培養におけるシードhiPSC（〜3×10 5月 10日cm2で）図1A）。 （：2-1：6 1）（0.5ミリモル;インキュベーション時間〜4分EDTA）エチレンジアミン四酢酸と80％の密集度、通路で。
  2. 胚様体（EB）の形成
    1. 高密度にT75フラスコにhiPSCを育成。
      1. （PBS）カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水で二回コンフルエント細胞とフラスコを洗浄し、約10分間、0.5mMのEDTA中でインキュベートします。細胞がフラスコの底から外していないことを確認してください。
      2. ガラスピペットを用いてEDTAを除去10mLのPBSで細胞をオフフラッシュし、細胞を分離するためにベンチにフラスコをタップ。
        注：必要に応じて、セルスクレーパーを使用してください。
      3. 体積の1/4を追加し、50 mLコニカルチューブに細胞を採取（ 例えば 、10 mLのRMPI 40mLの細胞懸濁液に）RPMI 1640培地（または任意の他の標準的な1.8 mMのカルシウムを含む培地）で5分間250×gで遠心。
    2. FTDA培地に再懸濁細胞ペレットを4mg / mLのポリビニルアルコール（PVA）を補充し10μMY27632とノイバウアー室で細胞を数えます。
    3. 細胞懸濁液をスピナーフラスコを埋める（30×10 6細胞/ PVA及びY-27632を補充した100mLのFTDA媒体、ステップ1.2.2を参照）、スピナーフラスコ内EB形成を開始（40 RPMに磁気撹拌機のローター速度を調整します）一晩細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、5％O 2）です。
  3. 中胚葉分化
    1. EB形成の間、コート細胞培養物を37℃で一晩、非イオン性界面活性剤（14ミリリットル/ T175）との懸濁培養に適したフラスコ。
    2. 翌朝は、PBS（30ミリリットル/ T175）で2回界面活性剤でコーティングされたフラスコを洗浄します。再びPBSを追加し、必要になるまでインキュベータに保ちます。
    3. インキュベーターからスピナーフラスコを取り外します。
      注：細胞懸濁液は、小さな肉眼で見えるのEB（ 図1B）を有する透明であるべきです。
    4. 50 mLコニカル浴槽に50 mLの懸濁液を転送しますEBを5〜20分間沈降Eとしましょう。
    5. 上清を除去し、2％のPVAおよび10μMのY-27632を添加したRPMI 1640 7 mLでペレットを洗浄します。目盛り15 mLのコニカルチューブに移し懸濁液及びEBの体積（〜50〜100μL）を推定します。
    6. コーティングされていないT175フラスコにスピナーフラスコの内容を転送し、最大20分間の沈降のためにV字型ラックにこれを残します。上清を除去し、上記のように胚様体を洗います。沈降が時間がかかりすぎるとして、200以上のmLでT175フラスコを記入しないでください。最初のスピナーフラスコの容積は200mLのを超えた場合、いくつかのT175フラスコにEB懸濁液を分割し、洗浄後に再度EBSを組み合わせます。
    7. 、中胚葉分化用培地中でそれを洗浄媒体と再懸濁を除去RPMI 4 mg / mlとPVAを補充された、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、0.05％のヒト血清アルブミン、5μg/ mlのトランスフェリン、5 / mlの亜セレン酸ナトリウム、0.1％の脂質混合物、250μMリン酸アスコルビン酸塩、10μMのY-27632、10ng / mLの骨形成タンパク質-4（BMP-4）、および3 / mlのアクチビンA、5 / mlの安定したFGF2。
    8. 界面活性剤で被覆されたT175フラスコからPBSを除去し、細胞懸濁液（40mLの200μLのEB）で埋めます。小さいEBボリュームの小さいフラスコを使用してください。
    9. 三日間（37℃、5％CO 2、5％O 2）のための懸濁液中のEBを養います。交換（ステップ1.3.7と同じ組成）中の50％毎日（使用V字状の沈降ラック）。給餌前に毎日メディア新鮮を準備します。
  4. 心臓分化
    1. 前日の新しい界面活性剤でコーティングされた血管を準備し、（1.3.2）上記のように扱います。
    2. 中胚葉誘導の3日後、EBを沈降ラックで最大5分間沈降してみましょう。媒体の大部分を除去し、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10mM HEPESを補充したRPMI 1640で洗浄します。
    3. 目盛りにEB懸濁液の10mLのを転送します15mLのチューブ及び沈降後のEBの量を推定します。
    4. 再懸濁EBを注意深く心臓分化培地中0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、10mMのHEPES、0.05％ヒト血清アルブミン、5μg/ mlのトランスフェリン、5 / mlの亜セレン酸ナトリウム、0.1％の脂質混合物、250μMのリン酸を添加したRPMI1640からなります-ascorbate、1μMY-27632、100nMでのWnt阻害剤DS-I-7 13。
    5. 新しい界面活性剤コーティングされた細胞培養フラスコ（46ミリリットル/ T175で〜200μLのEB）にEBSを移します。
    6. 50％の培地を交換しながら3日間（37℃、5％CO 2、21％O 2）インキュベート第二および第三日目（培地組成は、ステップ1.4.4を参照します）。最初の48時間以内にメディアを変更しないでください。
    7. 500μM1-チオグリセロール、インスリンと10mMのHEPES、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、1μMY-27632、2％無血清神経細胞培養用サプリメント（ 例えば B27）、100 nMでのWntを補充したRPMI 1640からなる培地中でインキュベート-inhibitor DS-I次の4日間、50％培地の毎日の為替と-7。 EBは、この期間内に暴行を開始すべきです。
    8. 心臓分化の1週間後は、Wnt阻害せず、無血清の神経細胞培養サプリメントと同じ培地に切り替えます。初日を除いて、毎日培地を50％に変更します。
  5. 人間の心筋細胞の解離
    注：分化プロトコルの2週間後、EBは自発収縮（ 図1C）を示すべきです。もしそうなら、解離を開始し、コラゲナーゼ溶液を準備します。
    1. （（HBSS）を秤量し、カルシウム/マグネシウムを含まないカルシウムを含まないハンクス平衡塩溶液中で200 U / mLのを解くことで、コラゲナーゼ溶液を調製し、1mMのHEPES、10μMのY-27632、30μMのN-ベンジル-p-トルエンスルホンアミドを追加BTS）。 -20℃で濾過（0.2μmのフィルタ）とストアアリコートによって滅菌します。一晩4℃でアリコートを解凍。
    2. 沈降ラックにEBSをセトル、吸引媒体及び20〜25 mLを予め温めておいたHBSSと交換してください。もう一度この洗浄工程を繰り返します。
    3. 吸引HBSSと予め温めコラゲナーゼ溶液（15ミリリットル/ T175）で置き換えます。細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2、21％O 2）中で4時間インキュベートします。
    4. 1％ペニシリン/ストレプトマイシン及びデオキシリボヌクレアーゼ（12μgの/ mL）で補充したDMEMでブロッキング緩衝液調製。
    5. ベンチ上の細胞培養フラスコをタップし、EBを崩壊し、バラバラに（ない場合は、インキュベーション時間を増やす）必要があり解離しました。穏やか円錐50mLチューブに細胞懸濁液と転送を粉砕します。バッファ（15ミリリットル/ T175）を遮断すると共にフラスコを洗浄し、チューブに移します。
    6. 100×gで10分間遠心分離。暖かいDMEM、粉砕物中の細胞を再懸濁し、細胞をカウントします。

エンジニア心臓組織の2世代（EHT）

  1. 市販のPDMSラック及びポリテトラフルオロエチレン（PTFE）スペーサをオートクレーブ（ 材料を参照機器のスプレッドシート。 図2）と一日前EHT生成するために、無菌条件下で、以下の溶液を調製します。
    1. 計量及びPBS、オートクレーブの適切な容量に溶解して2％アガロースを調製し、直ちに60℃で保存。
    2. アプロチニンを調製秤量し、アクア広告iniectabiliaの適切な容量に溶解して（33ミリグラム/ mL）を、-20℃での滅菌（0.22ミクロンフィルター）、アリコートとストアをフィルタリングします。
    3. -20℃で無菌の0.9％NaCl（ぬるま湯）、アリコートし、店舗の適切な体積で無菌フィブリノゲンを溶解することによりフィブリノーゲン（200ミリグラム/ ml）を調製します。
    4. 三つの部分に無菌トロンビンを溶解することにより、トロンビン（100U / ml）を調製し、-20℃でPBS及び2部アクア広告iniectabilia、小管3μLのアリコート部分とストアを無菌。
    5. 5mLのアクア広告iniectabiliaに670 mgの10×DMEM粉末を溶解することにより10倍DMEMを調製し、4℃で無菌かつストアをフィルタリングします。
    6. 2X DMEMを準備2 mLの熱不活性化ウマ血清、0.2 mLのペニシリン/ストレプトマイシンおよび5.8 mLのアクア広告iniectabiliaと2mLの10×DMEMを混合し、4℃で無菌かつストアをフィルタリングします。
    7. 、10％熱不活化ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミン（200mMの）と4℃で保存するDMEMを混合することにより、EHT-鋳造媒体（ECM）を準備。
  2. 1.6 mLの温かいアガロース（2％、PBS）をピペッティングし、ウェルにPTFEスペーサー（ 図2A）を配置することによって、24ウェルプレートで鋳型を調製します。
    注：すぐに8つの井戸の最大にピペッティング後にスペーサー - アガロースは非常に速く凝固します。 5分よりも長く、室温でアガロースを放置しないでください。
  3. アガロース凝固（〜10分間、アガロース不透明になります）後、PTFEスペーサ（ 図2C）を除去し、PDMSポストの対が各鋳型（ 図2D）に達するように鋳型にPDMSラック（ 図2B）を配置します。
  4. 15×10 6細胞/ mLの最小濃度とECMで心筋細胞を再懸濁。
  5. ice.For 24 EHTsに丸底の15 mLチューブに再構成混合物の推定量の110％を準備し、ピペットヒト、ラットまたはマウスの心筋細胞は、表1に列挙された再構成ミックス、それぞれ（10％余分に含まれています）。
    注：再構成混合物の細胞濃度は、ヒト（10×10 6細胞/ mL）、ラット（4.1×10 6細胞/ mL）およびマウス（6.8×10 6細胞/ mL）EHTsで異なります。細胞懸濁液の濃度に応じて、2,640μLの最終容量まで追加のECMを加えます。フィブリノゲンは、ピペッティングのためにぬるま湯にする必要があります。ゆっくりピペットの先端を記入し、再構成ミックスにフィブリノゲンを追加する際にフィブリノゲン含有ピペットで冷たい再構成ミックスの表面には触れないでください - フィブリノーゲンの粘度をピペットチップですぐに増加するであろう。
  6. 再構成ミックスを粉砕する1血清学的ピペットで15回フィブリノゲン凝塊が溶解するまで - 0。均質性のために、ピペットで再構成ミックスを確認してください。
  7. 1つのトロンビンのアリコート（200μLチューブ3μL）中の各EHT、ピペット100μLの再構成混合のために、可能な限り迅速に（ 図2E）アガローススロットに混合物を混合し、ピペット。各EHTのための新しいフィルターチップを使用してください。すべての8 EHTs後に再構成ミックス（血清ピペットで粉砕し、5〜10回）を再懸濁します。
  8. 一度すべてのスロットを再構成混合物が充填され、細胞培養皿の蓋を閉め、2時間、37℃、7％CO 2でインキュベートします。
  9. 無菌フード下インキュベーターと場所からプレートを取り外し。各ウェルの培地の少量（ 例えば、DMEM、約200から500μL）を覆う、穏やかプレートを振盪し、少なくとも10分間、37℃で再びインキュベートします。 DMEMの添加は、アガロース鋳型からフィブリンゲルからの除去を容易にします。
  10. ウェルの10％熱不活性化ウマ血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、を10μg/ mLのインスリン、33 / mlのアプロチニンを添加したDMEMからなる当たり1.5mLのEHT-培地を新しい24ウェルプレートを準備します。
  11. 注意深くアガロース鋳型からPDMSラックを除去し、培地で満たされた24ウェルプレート（図2F）に転送します。バックインキュベーターに皿を置き（37℃、7％CO 2、ヒトおよびラットEHTs 40％のO 2、マウスEHTs 21％のO 2）新たに調製EHT-媒体とし、フィード月曜日、水曜日および金曜日。 EHTs（図1D、2G）を鋳造後PDMSラック7-10日の記事を偏向自発収縮を示すべきです。
    1. マウスについてEHTsは、線維芽細胞の増殖を制限するために、48時間の培養培地に5-シトシンβDarabinofuranoside25μgの/ mLを加え。

3.収縮解析

注：収縮分析はに基づいています市販のEHT分析装置における映像光記録（ 材料の表を参照のこと）。この器具の中央部は、インキュベーションチャンバー（ 図3A）です。機器に付属のソフトウェアは、既知の弾性率及び幾何11（ 補足図1）を有するPDMSポストの偏向に基づいて収縮力を算出します。

  1. 測定に先立って機械2時間の加熱装置をオン。直前の収縮解析へのガス供給及び軸システムの電子供給をオンにします。
  2. ベースライン記録（分析中の基準点）のために、EHT分析機器にEHT-培地中EHTs有する24ウェルプレートを配置し、供給業者のマニュアルに従って収縮解析ソフトウェアを起動。
    1. 右側のパネルの「プロトコル」タブをクリックし、スタディ名、ユーザー、種、CEに関する関連情報を入力します。LLタイプ、年齢、記録長と追加の発言。
    2. 左側のパネルの「カメラビュー」タブをクリックし、自動フィギュア検出モードでカメラのライブモードを開始します。 XYZとカメラ位置を24ウェルディッシュに、各ウェルの座標andadjust右側のパネルの「設定」タブをクリックします。 EHTは、ウィンドウの中央に、カメラの焦点であることを確認してください。
      1. これは、図形認識や収縮解析を損なうだろうとして、細胞培養皿の蓋が霧ではないことを確認してください。
        注：図形認識アルゴリズムは、コントラストの高い領域を検出した位置にその変化を監視に基づいています。ソフトウェアで図形認識のこれらの領域は、EHTの収縮に伴って移動青い十字マークが付きます。
      2. 青十字の位置がEHTsの両方の頂部及び底部の端部にあり、（ 図3B）EHTsの収縮と一致する垂直にのみ移動することを確認してください。 S「OKポジション」ボタンを押して、各ウェルのAVE設定位置。
    3. 次に、左側のパネルにある「パラメータ」タブをクリックします。ここに表示されるパラメータは、ソフトウェアが収縮ピークを識別し、緑の四角でそれをマークしたことにより、基準を定義します。これらの値は、収縮ピーク（ 図3C）、ノー偽のデータ点（ 図3E-F）の正しい識別のために非常に重要です。
      注：種依存パラメータおよび例のリストは、図3Hに示されています。詳細については、ソフトウェアのマニュアルを参照してください。
    4. 右側のパネルの「自動」タブをクリックし、「スタート」ボタンを活性化することにより、分析を開始します。ソフトウェアは、次のレコードEHT収縮への1つのウェルから順番に移動し、（左側のパネルに「リアルタイム」タブに表示）録音中に力を計算します。分析、PDFレポートの終わりにsummari結果をシュッと、自動的に生成されます。
  3. システムは、結果を要約するために生成されたPDFレポートを保存し、分析します。
  4. 数日間にわたって繰り返し測定による収縮パラメータを監視します。それは（通常は文化の日15前後）プラトーに達するまでEHTは、収縮力に増加します。
  5. 薬剤スクリーニング
    1. 一日測定前に無タンパク質タイロード溶液を調製し、24ウェルプレート中で平衡化（2ミリリットル/ウェル）を細胞培養インキュベーター中（37℃、7％CO 2、40％O 2）一晩：120のNaCl、 5.4ミリモルのKCl、1mMのMgCl 2、0.1~5ミリモルのCaCl 2、0.4mMののNaH 2 PO 4、22.6ミリモルのNaHCO 3、5mMグルコース、0.05ミリモルのNa 2 EDTA、25mMのHEPES。陽性変力効果を調査するために、[EC 50] 1.8mMのまたは以前に決定までのカルシウムを加えます。
    2. 計量及びDMSO中の薬物を溶解し、必要に応じて、滅菌フィルター。作業濃度（ 例えば、0.3、1、3、10、30、それぞれナノモル範囲の100μM）の（DMSOで）6つの異なる1000倍サブストック溶液を調製します。
    3. タイロードプレート（各ウェル2ml中2μL）の各ストックを希釈し、十分に混合します。必要になるまでインキュベーターにプレートをバックに置きます。
    4. ウェル中の無菌フードと位置カーボン電極の下に第一タイロード充填された24ウェルプレートをとることによって、ベースライン測定を開始します。炭素電極の上に置かEHTsとPDMSラックを移し、蓋を閉じて、バックインキュベーターでプレートを置き、〜30分の平衡期間を待ちます。
    5. EHTの分析機器でインターロックをインキュベーターからEHTsを転送します。器具を閉じ、自発的ベースライン収縮（20秒/ EHT）を記録します。
    6. ペーシングケーブルに炭素電極を接続し、EHTsの電気刺激を開始（2.5 V、4ミリ秒のインパルス持続時間、人間：〜1ヘルツ、ラット：2〜ヘルツ、マウス：〜4ヘルツ）。 "ペース" ベースライン（10秒/ EHT）を記録します。すべてEHTsが適切にペーシングされることを確認してください。刺激周波数と電圧は、細胞株からの細胞株に異なる場合があります。
    7. ベースライン記録後、器具からEHTsを除去し、第一の薬物濃度で24ウェルプレートに、上部にPDMSラックと電極を転送します。すぐEHT分析機器のインターロックに戻しEHTsを転送し、そこ（標準薬のインキュベーション時間例えば 20分間）インキュベートします。
    8. ペーシングケーブルを接続し、最初の薬物濃度に応答して図形認識とレコードEHT収縮を調整します。
    9. 以下の薬物濃度のために、より高い薬物濃度を含む24ウェルプレートを用いて、ステップ3.5.7および3.5.8を繰り返します。
    10. すべてのPDFの録音を保存します。各図形認識、収縮ピークとアーチファクトを識別緑色の正方形の正確な位置決めのための記録をチェックし（3.2.1及び図3を参照してください）。
    11. 必要に応じて追加のオフライン解析を実行します。
      1. 「選択実行」をクリックすると、左側のパネルの「ラン」のデータベースからそれぞれの実行]を選択します。左側の「パラメータ」タブでは、収縮解析のためのパラメータを変更します。今すぐ動画を再分析するために右のパネルに「オフライン」タブにある「オフライン解析」を選択します。
      2. 図形認識を調整するため、新しいビデオファイルを記録するには、「リアルタイム」タブで図形認識を調整した後、「サンプル・レビュー」を選択します。注：オフライン解析は、左の「パラメータ」パネルにボタン「すべてのウェルの使用パラメータ」をクリックすると、すべてのウェルのための新しいパラメータを適用することができ、一方、サンプルのレビューは、一度に1つのウェルを再分析することができます。オフライン解析の両方のタイプの結果を自動的に表示する新しいデータファイルとPDFファイルが作成されます。
    12. Bの結果を組み合わせることにより、実験を分析iological複製し（ 図5D）周波数、収縮力、収縮時間及び緩和時間についての濃度応答曲線のデータを要約し、および/または平均収縮ピーク（ 図5C）のグラフ表示。
      注：PDMSラックとPTFEスペーサーを繰り返し使用することができます（PDMSラック最大5倍、およびPTFEスペーサー延々と。）。使用後、脱イオン水およびオートクレーブ内で二回沸騰、水を使って手動でそれらをきれいに。ラックを再使用するときに薬がPDMSによって吸収される可能性があるとして、潜在的なキャリーオーバー効果の点に注意してください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHTの心臓分化と準備

HiPSCは、成長因子低減基底膜マトリックス上に展開EDTA、一晩スピナーフラスコに形成された胚様体（EB）を用いて解離させました。 3日間、中胚葉誘導後、心臓分化はのWnt阻害剤で開始しました。分化プロトコルの〜17日後、拍動EBをコラゲナーゼタイプII（ 図1）を用いて単一細胞に分離しました。 EHTsを直ちにEB解離（ 図2）の後、100μLの組織あたり1.0×10 6細胞を新たに単離した心筋細胞から調製しました。凍結した細胞（ 例えば 、商業的供給業者）からの調製のために、細胞を培地に滴下再懸濁により解凍し、遠心分離した後、ECMに再懸濁しました。 48時間以内に、単一細胞の自発的な拍動は、EHTに顕微鏡観察されました。次の日に、心筋細胞は、組織の力線に沿って縦方向に広がって結合され、コヒーレントに暴行EHTを形成しま...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エンジニア心臓組織は、心血管研究のツールボックスに貴重なオプションを提供しています。 24ウェルフォーマットにおけるEHTsは、疾患のモデリング8、14、薬剤の安全性スクリーニング7、8、10、11、15、または基本的な心臓血管研究16、17のために価値のあることが証明されています。

基本EHTプロトコルの潜在的な変更は、心筋細胞と非心筋細胞18および後負荷増強

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IM、TEとAHはEHT Technologies GmbH社、ドイツの共同設立者です。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、材料の彼らの現物出資のためのアレッサンドラ・モレッティとデニス・シャーデに感謝しています。私たちは、実験薬理学およびUKEの毒性の部門でのiPSとEHTワーキンググループの素晴らしいサポートを認めます。著者の作品はDZHK（循環器病研究のためのドイツ語センター）と教育のドイツの研究省（BMBF）、ドイツの研究財団（DFGエス88 / 12-1、HA 3423 / 5-1からの助成金によってサポートされています）、研究中の動物の交換洗練＆リダクション（NC3Rsクラック-ITの助成金35911から259146）のために英国のナショナルセンター、英国心臓財団RM / 30157分の13、欧州研究評議会（アドバンスト・グラントIndivuHeart）、ドイツ心臓財団そしてFreieウントHansestadtハンブルク。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
EHT分析装置EHT Technologies GmbHA0001ソフトウェア付属
EHT PDMSラックEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFEスペーサーEHT Technologies GmbHC0002
EHT電極EHT Technologies GmbHP0001
EHTペーシングアダプタ/ケーブルEHT Technologies GmbHP0002
24ウェルプレートNunc144530
6ウェル細胞培養プレートNunc140675
15 mL ファルコンチューブ、目盛り付き ザルスタット62,554,502
セルスクレーパーサルスタット831,830
スピナーフラスコインテグラ182 101
スターラー バリオマグ/シマレック バイオシステムダイレクト Thermo scientific70101ローター速度を 40 rpm に調整
T175 細胞培養フラスコ ザルシュテット 831,812,002
V字型沈殿棚 UKEハンブルクでカスタムメイドna10
×DMEMGibco52100
1-チオグリセロール Sigma AldrichM6145
2-Phospho-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩Sigma Aldrich49752
Activin-A R&Dシステムズ338-AC
アガロース Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS インスリン ギブコ17504-044
BMP-4R&Dシステムズ314-BP
コラゲナーゼII ワージントンLS004176
DMEMバイオクロムF0415
DMSO シグマ アルドリッチD4540
DNase II, type V (ウシ脾臓由来)Sigma D8764
ドルソモルフィン abcamab120843
EDTA Roth8043.2
子牛胎児血清Gibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
フィブリノーゲン (ウシ)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302コーティング用: 1:200 希釈
HBSS w/o Ca2+/Mg2+ ギブコ14175-053
HEPES Roth9105.4
馬の血清Lifeテクノロジー26050088
ヒト血清アルブミン 生物産業05-720-1B
インスリン、ヒトシグマ アルドリッチI9278
L-グルタミンギブコ25030-024
リピッドミックス シグマアルドリッチL5146
マトリゲルBDバイオサイエンス354234EHTレコンシチュエーションミックス用。
N-ベンジル-p-トルエンスルホンアミドTCIB3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2Biochrom14190
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140
Pluronic F-127 シグマ アルドリッチP2443
ポリビニルアルコール シグマ アルドリッチP8136
RPMI 1640 Gibco21875
亜セレン酸ナトリウムSigma AldrichS5261
TGFß1Peprotech100-21
トロンビンシグマ アルドリッチT7513
トランスファーリン Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCCustom made at UKE ハンブルクna
iCell 心筋細胞キットCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Pluricyte 心筋細胞キットPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC 心筋細胞キットAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytesTakara Bio USA, Inc.10075
円

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436(2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397(2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958(2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937(2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349(2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312(2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

PDMS hERG E 4031

関連記事