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方法論記事

ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

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DOI：

10.3791/55463

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2017年3月31日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California Berkeley, 2John Innes Centre, Norwich Research Park, 3Department of Plant and Microbial Biology, University of Zürich, 4USDA-ARS Sunflower and Plant Biology Research Unit

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここで説明されているのは、長期のゲノムシーケンシングに使用するための、偏在する生物栄養性真菌病原体であるうどんこ病からのゲノムDNAの抽出、精製、および品質管理の方法です。

要約

うどんこ病菌は経済的に重要な真菌植物病原体のグループです。比較的少ないが原因よく発達し、遺伝とゲノムリソースの不足のため一部では、これらの病原体の分子生物学および遺伝学について知られています。これらの生物は、ゲノム配列決定およびアセンブリが極めて困難作った大規模な、反復ゲノムを、持っています。ここでは、1つのうどんこ病種、Golovinomyces cichoracearumから高分子量のゲノムDNAの採取、抽出、精製及び品質管理の評価のための方法について説明します。記載されたプロトコルは、最適化されたフェノール/クロロホルムゲノムDNAを抽出した胞子の機械的破壊を含みます。典型的な収量は、150mgの分生子あたり7μgのDNAをでした。この手順を用いて単離されたゲノムDNAは、長いリードシーケンシング（ すなわち 、> 48.5 kbpの）に適しています。品質管理対策は、ゲノムDNAの大きさ、収率、および純度を確保するためでもありますこの方法で説明します。ここで説明する品質のゲノムDNAの配列決定は、組み立てと今度はより良い理解につながる複数のうどんこ病のゲノムの比較を可能にし、この農業病原体の制御を改善します。

概要

うどんこ病は、絶対biotrophic真菌植物のグループが一緒になったときに、植物病害全世界1の最大の原因である、という病原体です。分類学的に家族Erisyphaceae 2内の5つの種族に分類されているうどん粉病の900以上述べた種が、あります。彼らの経済的重要性と、彼らは彼らのホストと発展親密な関係の両方により、うどんこ病は> 100年間の研究の対象とされてきました。感染すると、うどんこ病は、この病原体の利益のために、細胞構造、代謝およびそのホストの分子生物学の急激な変化を誘発します。 しかし 、うどんこ病の研究は、それらの偏ライフスタイルに特に困難である、と純粋培養中の真菌の成長はまだ3に記載されていない、4、5"外部参照"> 6、7、8。一過性の形質転換は、いくつかの種9、10で報告されているが、うどんこ病の信頼性の高い、安定した遺伝的形質転換はまた、まだ達成されていません。

うどんこ病のゲノムのシーケンシングおよびアセンブリが原因ゲノム自体の機能の数に困難であることが判明しました。ウドンコ病ゲノムは、大きい（120から180 MBP）他の真菌ゲノムに対して、及び60から構成- 90％の均一に分布反復エレメント11。これらの要素は、非長末端反復だけでなく、未分類の反復要素を含みます。単一うどんこ病種、 ブルメリア・グラミニス f の二formae speciales。 SP。 hordeiと、f。 SP。 トリチシ（BGHそれぞれBGT）ならびにブドウうどんこ病エリシフェの鉤虫、蜂を有しますN配列決定し、そしていくつかの他のもののためのドラフトゲノムは12、13、14を完了しました。ゲノムの反復性は、アセンブリ困難になっており、完成BGHゲノムは2メガビット12のL50と6989 supercontigsに組み立てました。

大規模なゲノムにもかかわらず、うどんこ病は、それぞれ、BGHとBGTで予測5845および6540の遺伝子と、タンパク質をコードする遺伝子の数が少ないように見えます。配列決定された粉末状のカビも生存11、12、13、14のためにそれらの宿主植物上の真菌の依存性と一致している他の真菌において必須である少なくとも99のコア遺伝子を欠いているように見えます。

テロマー、セントロメア、リボソームRN近く反復配列遺伝子配列および転移因子に富む領域が不十分ショートリード配列決定戦略から組み立てられ、アンダー表さゲノムアセンブリ15であることが多いされています。そのような領域は、ゲノム配列において生じるギャップの多くの原因であると考えられ、これは、反復エレメント16のそれらの広範な拡大にうどんこ病に適用されています。高可塑性ゲノム領域は、多くの場合、このような反復領域3に記載されています。これらは、染色体再配列の部位として機能し、しばしばそのようなエフェクタータンパク質をコードする遺伝子と二次代謝の酵素をコードする遺伝子のような強い選択圧の下で遺伝子をコードします。単一分子の長いリード配列決定技術の進歩は、ゲノム15の繰り返し領域の両端の配列決定のための潜在的な解決策を提供します。例えば、Faino ら。 （2015）を含む長い配列は技術や光Mを読み取ることがわかっappingは、遺伝子注釈の数を増加させる（及び部分的または欠落遺伝子注釈の数を減らす、ゲノム中の反復DNA配列の割合が3倍、それらは真菌植物病原体のVerticilliumのダリアの二つの株のためにギャップのないゲノム配列を生成することができ）と暴露のゲノム再編成17。

> 20 kbpの最小限のサイズでこれらの長い読みシーケンシング技術、高品質のゲノムDNAの高濃度を採用するために、必要とされています。ここでは、分生子から分生子コレクション、高分子量のDNAを精製するための私達の方法を説明し、うどんこ病種Golovinomyces cichoracearumを使用して、当社の品質管理評価はキュウリ18上に成長させました。このプロトコルはB.ケラー実験群（チューリッヒ大学、チューリッヒ、スイス）13、19に開発されたプロトコルに基づいていますそして、増加DNA収量につながったいくつかの修正およびサイズでDNA> 48.5 kbpのより高い割合を含みます。プロトコルはまた、エネルギー共同ゲノム研究所20、21、22の米国部門からの推薦に基づき、品質管理工程を含みます。

ヘンリー（2008）23に記載されるように溶解緩衝液に含まれる各試薬の機能、及び各精製工程のための理論的根拠は、です。植物および微生物組織から高分子量のゲノムDNAの単離のための利用可能な公開されたプロトコルは、このプロトコル24、25、26、27、28の設計時に相談しました。

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プロトコル

真菌材料の作製

  1. 成長うどんこ病
    1. 以下の条件で、成長チャンバ内の植物を育てる：22°C日の温度、20℃の夜間温度、相対湿度80％、14時間の日長および125μE/ m 2 / sの光強度（蛍光灯によって提供）。
    2. 18、29を説明するようにGolovinomyces cichoracearum株 UCSC1とキュウリ植物（Cucumisにサティバ品種ブッシュチャンピオン）に感染。
  2. 収穫うどんこ病分生子
    1. 分生子が蓄積たインラインフィルター（11ミクロン）を有する小型真空を用いて接種後10日 - 7に感染した植物から収穫分生子。穏やかな圧力を適用し、分生子を収集するために、葉の表面に沿って真空ノズルを実行します。
      注：G.のcichoracearumの平均収率は、高濃度infeから分生子の20 mgで地域に約130 cm 2のキュウリの葉をCTED。
    2. 清潔な紙のシート上のフィルタから（7-8感染したキュウリの葉から約375μLの体積、又は分生子）分生子の約150mgを磨きます。ここから、（液体窒素で）は、2つの32分の5インチ径予冷鋼粉砕ボールを2mLのクライオバイアルに分生子を移します。直ちに液体窒素にチューブを戻します。 -80°Cで保存チューブ。
  3. ボールミルによりオープン分生子を破ります
    1. Flashには、液体窒素中でボールミルのアルミニウム板を凍結します。ロードは、ボールミルラックにクライオバイアル。激しく30サイクル/秒（室温）で30秒間ボールミルで分生子及びスチールボールとクリオバイアルを振ります。直ちに液体窒素で凍結バイアルを再凍結。
      注：最初に、研削中の細胞壁破壊の効率を100倍の倍率で顕微鏡で分生子のサンプルにアクセスします。 B、30サイクル/ sの30秒の2回 - 必要に応じて、追加の1のために挽きますUTは最小限にラウンド数を保ちます。最適な条件が確立されていたら、この段階での顕微鏡による分生子破損のルーチン評価は不要です。

2.ゲノムDNA精製

  1. 分生子溶解
    1. 解凍分生子を避けるために素早く作業を、磁石とのクライオバイアルから鋼球を取り除きます。スラリーが形成されるまで10秒- 700μL65℃の溶解緩衝液（ 表1）、ボルテックス5を加えます。
    2. 300μL（65℃）で予熱した5％（v / v）のサルコシルを添加し、穏やかに混合するために5回（3秒ごとに1反転）を反転させます。 65°Cで30分間チューブをインキュベートします。 10、20及び30分で穏やかに3回転倒。ワイドボアピペットチップを使用して、新しい2 mlのマイクロ遠心チューブに全溶液を移します。すべての後続のステップで、穏やかな、ゆっくりし、反転により混合し、ワイドボアピペットチップを用いてDNA含有溶液を移します。
  2. DNAの抽出I
    1. クロロの1つのボリュームを追加形式：イソアミルアルコール（24：1 v / v）の溶解液に、穏やかに5回混合する反転します。優しくインキュベーションの終わりに、再び中間点で5回混ぜるとする反転、室温で10分間インキュベートします。 14,000×gで15分間、室温で遠心分離。ワイドボアピペットチップを使用して、慎重に新しい2 mlのマイクロ遠心チューブに水層を移します。インターフェースからの材料を含む避けます。
  3. DNA降水I
    1. 1つの体積室温の100％イソプロパノール（約750μL）を加え、穏やかに6回混合する反転します。 14,000×gで15分間、室温で遠心分離。上清を慎重に取り除き、捨てます。
    2. 450μL予備冷却（-20°C）70％エタノールを追加します。 14,000×gで室温で5分間遠心。上清を慎重に取り除き、捨てます。注意深く微細ピペットチップで上清を除去し、廃棄し、3秒1,000×gで遠心します。 15分aのペレットを空気乾燥トンの室温。より長い15分間乾燥させないでください。
    3. 300μLのTE（10mMのトリス-Cl、1mMのエチレンジアミン四酢酸、pH8.0）中にペレットを再懸濁します。 4℃で一晩インキュベートします。静か液に行かなかった任意の残留物を再懸濁するためにフリック。
  4. RNA汚染を除去するために、10μLのRNase A（10mg / ml）を加えます。ゆっくり3回を混在させる反転。 3秒1,000×gで遠心します。 2時間37℃でインキュベートします。
  5. DNA抽出II
    1. 300μLを、フェノールを追加：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1 v / v）を、穏やかに5回混合する反転します。優しくインキュベーションの終わりに、再び中間点で5回混ぜるとする反転、室温で10分間インキュベートします。 14,000×gで室温で遠心15分。ワイドボアピペットチップを使用して、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移します。
  6. DNA降水II
    1. 0.01体積の3M酢酸ナトリウムpHが5.2（approximatelを追加Y 3μL）、そっと5回を混在させる反転。 2.5容量予め冷却（-20°C）100％エタノール（約750μL）を加えます。ゆっくり5回を混在させる反転。 -20℃で一晩インキュベート
    2. 遠心14,000×gで4℃で30分間。上清を慎重に取り除き、捨てます。
    3. 450μL予備冷却（-20°C）70％エタノールを追加します。 14,000×gで4℃で5分間遠心。上清を慎重に取り除き、捨てます。 3秒1,000×gで遠心します。慎重に細いピペットチップと廃棄で上清を除去します。
    4. 室温で30〜60分間、ペレットを空気乾燥させます。 27.5μLTEでペレットを再懸濁。 4℃で一晩インキュベートします。静か液に行かなかった任意の残留物を再懸濁するためにフリック。
    5. 品質管理試験のために22.5μLTE（最終容量25μL）にアリコート2.5μL（下記参照）。シークエンシングのために提出するまで4℃で保存DNAサンプル。長期保存、店のサンプルについてそして-80℃でせん断を防ぐために、凍結融解サイクルを最小限に抑えます。
      注：適切にピペットすることが困難な場合が高分子量のゲノムDNAとして、この段階でピペッティングする際には注意してください、そして、「QCアリコート」は、ゲノムDNAサンプルの正確な表現であることを確認することが重要です。

3.品質管理

  1. サンプル純度
    1. TEブランクを用いて、小容量の分光光度計QCアリコートの1μLをロードすることによって、DNAのサンプルの純度を評価します。録音A260 / A280およびA260 / A230の測定値。純粋なDNAは、1.8と2.2の間、約1.8のA260 / A280比およびA260 / A230比を有することになります。
  2. ゲノムDNAの定量化
    1. 製造者の指示に従って商業的二本鎖DNA定量アッセイキットを用いて、QCアリコートの定量化を行います。
  3. DNA品質評価I
    1. 負荷が約60 ngのゲノムDNAと1X TAE（40mMのトリス、20mMの酢酸、および1mM EDTA、pH8.0）中0.7％アガロースゲル上のDNAラダー。ゲノムDNAのバンドがラダーでよく、バンド分離から約2cmで明らかであるようになるまで45分 - 40、70 Vでゲル装置を実行します。これらの条件は、利用可能なゲル電気泳動装置に基づいて調整される必要があるかもしれません。
  4. DNA品質評価II
    1. 負荷は約60 0.5×TBE（44.5 mMトリス、44.5 mMのホウ酸、1mMのEDTA、pHは8.3）と1％アガロースゲル上でゲノムDNAと（パルスフィールドゲル電気泳動に適した）高分子量DNAラダーをngの16時間80 kbpの波形パルスフィールドゲル電気泳動プロトコル - 5を用いて0.5×TBEランニングバッファーで実行されます。
  5. 細菌、真菌、および植物の汚染物質の評価
    1. プライマー及び増幅条件のリストを使用してリボソーム遺伝子の適切な内部転写スペーサー（ITS）領域を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行います表2に編。ゲル上で得られた反応のロード10μL。
      注：うどんこ病ITS領域を表すバンドは、真菌のITSプライマーを用いて増幅されるべきです。このアンプリコンおよび細菌、又は植物プライマーを用いて生成されたアンプリコンからのDNAは、汚染の起源を決定するために配列決定されるべきです。唯一のうどんこ病のITSシーケンスは、真菌アンプリコンに記載されていなければなりません。

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結果

ゲル電気泳動を使用し、パルスフィールドゲル電気泳動を用いてアガロースゲル上G.のcichoracearum実行から精製したゲノムDNAを60ngの代表的な例は、それぞれ、 図1および図 2に示されています。わずか品質管理に合格し、不合格、通過ゲノムDNA調製物が表されています。完全な品質管理に合格したゲノムDNA調製物は、長期読みゲノム配列決定アプローチを使用して配列決定のために理想的です。わずかな品質制御を渡す製剤は許容されるが、完全に渡す準備が好ましいです。品質管理に失敗準備は長い読み取りゲノム配列決定アプローチのために受け入れられません。

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図1：精...

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ディスカッション

偏biotrophicウドンコ病菌類から純粋な、高分子量のゲノムDNAを得るために、以前に記載された方法の修正版30を開発しました。この最適化されたプロトコルを使用して平均収量は150mgの分生子あたり7μgのDNAを、従来のプロトコルを用いて得られた収量の倍増です。また、平均粒径は48.5 kbpの上に約20 kbpのから増加しました。このプロトコルはcucumber- G.のcichoracearumシステムに最適化しました。他のウドンコ病における最高の品質と最高純度のDNAを入手するかbiotrophic菌類を義務付けるために、このプロトコルの追加修正が必要とされ得ます。さらなる修飾が必要とされるかもしれないが、将来的に、このプロトコルは、他の偏biotrophic菌類から長い読み取りDNA配列決定に適した高分子量のDNAを得るために使用され得ます。

抽出されたDNAの高いDNA収量及び高分子量のバランスをとることの懸念でしたこのプロトコルの最適化中。ボルテックスを含むステップは、DNAの剪断を最小限にするため...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

このプロトコルは、Joint Genome Institute-Community Sequencing Project（#1657）の支援を受けて開発されました。この作業は、Philomathia Foundation、National Science Foundation(#0929226)、Energy Biosciences InstituteからS. Somervilleまで部分的に支援されました。スイス国立科学財団(#310030_163260)からB.ケラーへ。同僚のM. Figureroa氏とM. Miller氏(ミネソタ大学)、R. Panstruga 氏(アーヘン工科大学)、C. Pedersen氏(コペンハーゲン大学)、P. Spanu氏(インペリアルカレッジ)、J. Taneja氏(カリフォルニア大学バークレー校)、M. Wildermuth氏(カリフォルニア大学バークレー校)、R. Wise氏(アイオワ州立大学)、S. Xiao氏(メリーランド大学)の寛大なアドバイスと、ここで説明するプロトコルの開発にあたり、プロトコールをボランティアで提供してくださったことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MM400 ボールミルRetsch20.745.0001または同等のボールミル
2 mL チューブ ボールミルSarstedt 72.694.007
5/32 "ステンレス鋼製粉球OPSの診断GBSS 165-5000-01
マイクロプロセッサは65 °に事前設定された280シリーズ水浴を制御しました;C サーモフィッシャーサイエンティフィック2825または同等のウォーターバス
マイクロプロセッサ制御280シリーズウォーターバスプリセット37°C;Cサーモフィッシャーサイエンティフィック2825または同等のウォーターバス
エッペンドルフ 5417R 冷蔵微量遠心機Krakeler Scientific 38-022621807または同等の微量遠心分離機
Chlorform:IAA (24:1 v/v)Sigma-Aldrich C0549に接触または吸入した場合に危険です。ニトリル手袋、保護メガネ、白衣を着用し、化学フードで作業
フェノール:クロロホルム:IAA
(25:24:1 v/v)		サーモフィッシャーサイエンティフィック15593031皮膚接触または吸入の場合には危険です。ニトリル手袋、保護メガネ、白衣を着用し、化学フード
100%イソプロパノールSigma-Aldrichで作業してください 
W292907 100%エタノールSigma-Aldrich 34923-20 > まで冷やします。C 以前の使用
酢酸ナトリウムSigma-Aldrich S2889
Rnase、Dnaseフリー(10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificEN0531
重亜硫酸カリウムSigma-Aldrich P2522
ラウリルサクロネートナトリウムSigma-Aldrich L9150
トリスベースSigma-Aldrich 
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)Sigma-Aldrich EDS
塩化ナトリウム(NaCl)Sigma-Aldrich S9888
臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)Sigma-Aldrich H6269
Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, UvextremeStaples423263または同等の眼鏡
High Five COBALT ニトリル手袋, LARGENeta ScientificHFG-N193または同等の手袋
GelRed 核酸ゲル 水で 10,000xビオチウム41003
化エチジウム 10 mg/mLビオチウム40042皮膚に付着した場合に危険です。ニトリル手袋と保護眼鏡を着用
Agarose Ultrapure BioreagentVWR International LLCJT4063
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher ScientificFERSM1332
8 - 48 kb CHEF DNAサイズ標準Bio-Rad170-3707
Pippin PrepLife Technologies Corporation4472172または同等のパルスフィールドゲルアパラタス
Whatman定性濾紙、グレード1Sigma-Aldrich WHA1001042または同等の成長チャンバー
パーシバル成長チャンバーパーシバルAR66LXC9
NanoDrop 8000 UV-Vis分光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィックND-8000-GLまたは同等の分光光度計
Quant-iT PicoGreen dsDNAアッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィックP11496
TAEバッファー(トリス-アセテート-EDTA) (50x)サーモフィッシャーScientificB49使用前に 1/50 を水で希釈する (1x)
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015 
トリス-ホウ酸塩-EDTA、10倍溶液(電気泳動)サーモフィッシャーサイエンティフィックBP13334使用前に水で1/10を希釈(1倍まで)
液体窒素液体窒素(-196°C;C)凍結の危険があります。また、温まると急速に膨張するため、密閉容器に入れておくべきではありません
用 皮膚してください メタ10708976001 染色 臭してください

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