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Summary

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。

Abstract

膜タンパク質輸送、組立、および表現を理解することは、細胞内小器官に存在するものと、原形質膜に局在するものを区別したアプローチが必要です。従来の蛍光ベースの測定は、異なる細胞小器官に存在する膜タンパク質を区別するための能力を欠いています。最先端の方法論は、全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）とpH感受性蛍光色素分子を結合することにより、従来の方法を超越します。 TIRF照明は、このように、バックグラウンドを減少させる信号対雑音比を増加し、解像度を高め、ガラスサンプル界面から約150nmまでのサンプルを励起します。 TIRFMで励起体積は、原形質膜と、周辺ERなどの近くの細胞小器官を含みます。 Superecliptic pHluorin（SEP）は、GFPのpH感受性バージョンです。遺伝的に関心位置の膜タンパク質上の蛍光体の細胞外ドメインに9月をコードしますERの、細胞の細胞外領域内腔側。 SEPが、pHが6よりも大きい場合に蛍光性であるが、より低いpH値ではオフ状態のままです。したがって、（PM）原形質膜に小胞体（ER）または挿入時に常駐している場合には人身売買の小胞または、ゴルジ体などの他の細胞小器官に限定されないときに9月の蛍光を発するのタグが付け受容体。細胞外pHが細胞膜上の受容体の蛍光を決定するように調整することができます。同じセルのための中性および酸性の細胞外pHでのTIRF画像との間の蛍光の差異は、細胞膜上の受容体の相対的な数に対応します。これは、細胞内および細胞膜常駐受容体の同時測定を可能にします。細胞外pHが中性である場合、単一の小胞の挿入イベントはまた、原形質膜と融合し、蛍光状態に移行低pH輸送小胞に相当する、測定することができます。このversatil電子技術は、膜タンパク質の局在化、発現、および輸送を研究するために利用することができます。

Introduction

受容体の発現、分布、およびアセンブリにおける変化は、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、および薬物嗜癖^{1、2、3、4、5を}含む様々な疾患に接続されています。例えば、ニコチンおよび他のニコチン性リガンドは、輸送、発現、およびアップレギュレーション^{1、2、5、6、7、8、9、10}の変化をもたらすニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR類）の輸送に影響を与えます。ニコチンは、細胞内で組み立てのnAChRの数を増加させる原形質膜に向けて輸送を増加させますdは、いくつかのサブタイプの高感度版を優先するようにサブユニットのアセンブリを変更します。疾患モデルの人身売買、アセンブリ、および受容体の発現の明確な変化を解決することは薬物標的を定義することが不可欠である重要なメカニズムの詳細を提供します。理想的なアプローチは、急速に細胞内受容体および原形質膜に局在それらの区別になります。これは、特定のタンパク質の大部分は、nAChR類のように、細胞内に存在する場合に特に困難です。 nAChR類の大部分は、小胞体に局在しているので、従来の測定は、分泌経路に沿って局在と人身売買の変化を特定するために必要な時空間的分解能を欠いています。 nAChR類の受容体の輸送および発現の研究は、主に^11を放射性リガンド結合を用いて行われてきた、ビオチン化アッセイ^12、ウェスタンブロッティング^13、または免疫沈降techniq UEの^12。これらの細胞のレポーター分子または固定の結合特異性に依存し、同時に細胞膜に常駐し、細胞内受容体を区別する能力を欠いています。したがって、イオンチャネルアセンブリおよび小胞ダイナミクスの研究は、主に、低スループット電気生理学的技術¹⁴に依存してきました。

優れた空間的および時間的な分解能は、蛍光顕微鏡法の進歩により可能です。例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびその変形などの遺伝的にコードされたレポーター分子は、非特異的結合の問題を排除し、感度^15を増加^させます。 superecliptic pHluorin（SEP）として知られているGFPのpH感受性変異体は^、局在^{5、 図7、 図8を}決定するために、細胞内区画間の固有のpH差を利用するために使用することができREF "> ^{9、16、17、18。SEP}が、pHが6より高い場合に蛍光を発するが、より低いpHで、オフ状態のままであるので、それらの管腔側に9月でタグ付けされた受容体は、小胞体中に存在する場合に検出されます（人身売買の小胞に閉じ込めER）やプラズマ膜（PM）への挿入時に、ではなく。原形質膜上の受容体と接触している外pHの操作は、結果的に蛍光およびこれらの受容体の、したがって検出を変更します。同じセルの場合順次中性外pH 6より低いその後のpHの両方で撮像され、画像の差分が原形質膜上に位置する受容体に起因する。このことは^、同時に、細胞内の測定（周辺ER）および原形質膜常駐受容体^5を可能^にします^7,8 </su^{P> 9。}細胞外pHが中性である場合、単一の小胞の挿入イベントも解消することができます。低pH輸送小胞が細胞膜と融合すると、小胞体の内腔側は、蛍光^{7、18、19、20}のバーストとして検出された遷移を引き起こし、中性の細胞外液に露出されます。 SEPが原形質膜および周辺小胞体に局在する受容体の測定を可能にし、これらの細胞内領域^5、7、18間の受容体の輸送を測定するための手段を提供します。

形質膜においてより高い解像度を達成するために、遺伝的にコードされた9月との受容体は、全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）によって撮像されます。この方法は、特にです有用TIRFMは、細胞膜の可視性を増大させるための受容体の大部分は、細胞内領域に局在している場合。 TIRFMはまた、PMへの挿入時に9月標識受容体を運ぶ単一小胞の輸送ダイナミクスの解像度を可能にします。全反射は、細胞およびガラスカバースリップ^21、22間のような、異なる屈折率を有する材料の界面で起こります。ガラスセルの溶液の界面で全反射を達成するように配向された488nmの励起、照射時SEPが蛍光を発します。これは、試料中にこのボリューム内でのみエキサイティングな蛍光団を150nm程度に浸透するエバネッセント波を生成します。励起のこの範囲内の中性pH環境での受容体を含有するだけで9月には、原形質膜または末梢小胞体に存在するものに対応し、検出されます。検出は限らトンであることからOエバネッセント波によって励起は、細胞内領域からバックグラウンド蛍光が減少し、信号対雑音比は^{、21、22に}増加されます。さらに、細胞の大部分を貫通していない放射ので、光損傷は、時間の経過にわたる生細胞イメージングを可能にする最小化されます。その結果、TIRFMはSEPが分泌経路に沿って膜受容体の細胞内局在性および輸送動力学を測定するために必要な高い分解能と感度を提供し、遺伝的にコードされて結合されます。

Protocol

1.細胞培養およびトランスフェクション 増殖培地中のマウスの神経芽細胞腫2aを（N2aの）細胞を維持。 高グルコースで200mlダルベッコのイーグル培地（DMEM）500からmlのN2aの増殖培地を行い、250mlの血清培地50mlのウシ胎児血清（FBS）を低減し、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（100×）。 5％CO 2インキュベーター中で37℃でT75フラスコ中の細胞を維持します。 スプリット細胞午前1時15分、必要なとき、または約80〜90％の密集度。これは通常、週2-3回です。 ポリ-D-リジンでコート35ミリメートルガラスボトムディッシュ。 層流バイオセーフティキャビネットでは、滅菌35mmディッシュのガラス底の領域には0.1μg/ mlのポリ-D-リジン200μlのを追加します。 1時間37℃のインキュベーターに皿を置きます。 慎重のddH 2 Oで3〜4回の皿をすすぎます。 1時間以上のための料理は完全に乾燥させます。 Steril必要に応じて、生物学的安全キャビネットの中で、UV光を使用して料理をIZE。 TIRFMイメージングのためのN2a細胞をプレート。 接着細胞から増殖培地を除去します。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で5分間、1ミリリットルの1xトリプシン（+ EDTA）でインキュベートすることにより、フラスコから細胞を剥離。 9 mlの増殖培地を添加することによってトリプシンを不活性化します。ピペットを使用してメディア、トリプシン、および剥離した細胞を混ぜます。 視覚的に血球計数器を用いて細胞をカウントし、各ポリ-D-リジンコーティングされたガラスボトムディッシュに90,000細胞を追加するための正しい体積を計算します。この密度は、効率的なトランスフェクションし、単一細胞TIRFイメージングのために必要とされます。 90,000個の細胞を含む各ガラスボトムディッシュに2ミリリットルの増殖培地を追加します。 16-24時間、5％CO 2インキュベーター内で37℃で皿をインキュベートします。 N2aのトランスフェクション 組み入れのSEPフルオロフォアを含むプラスミド構築物を得ます関心対象のタンパク質の細胞外領域に。このようなPCR増幅の5などの標準的なクローニング技術は、構築物を生成するために使用することができます。 注：これは小胞体またはトラフィッキング小胞の内腔の中に存在した場合に、原形質膜上の細胞外液に露出されるように、SEPが膜タンパク質の細胞外領域に組み込まれるべきです。 SEPがGFPのサイズに類似しており、類似のクローニング戦略を使用することができます。 トランスフェクション試薬の添加前に1.5ミリリットル減少血清培地（ 例えば 、のOpti-MEM）、約30分で播種した細胞に成長培地を交換してください。 注：受容体における薬物誘発性の変化を研究するために、薬剤の適切な濃度は、トランスフェクションの時点で添加することができます。 各所望のプラスミド500ngの追加血清培地（チューブ1）減少し250μlに構築。 別のチューブcにトランスフェクション試薬の2μLを加えます減少血清培地250μlのをontaining。室温で5分間チューブ2をインキュベートします。プラスミドDNAのトランスフェクション試薬の比率は、目的の各タンパク質を発現するように最適化されるべきです。 トランスフェクション試薬およびプラスミドミックスを500μlを含む溶液を作るために、チューブ1と2を組み合わせます。 25分間、室温でインキュベートします。 皿当たり2ミリリットルの全体積を500μlのトランスフェクション混合するために事前に播種した細胞を追加します。 24時間、5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。 24時間後、トランスフェクション混合物を除去し、増殖培地で細胞を洗浄した後、各皿に増殖培地の2ミリリットルを追加します。 注：薬物は、トランスフェクションの時点で添加した場合には、このステップで再び補充することができます。 24時間、5％CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。 画像セルトランスフェクション後48時間。 合計で2.ライブセルイメージングternal反射蛍光顕微鏡（TIRFM） イメージングを設定します セットアップ走査ステージと、図1に示すように、倒立蛍光顕微鏡を用いて撮影を行います。これは、488 nmのDPSSレーザー光源、488 nmのビーム位置を調整するステッピングモータと、高開口数（NA 1.49）60Xまたは100X油浸対物レンズの位置合わせを必要とします。 適切な励起フィルター（帯域10分の488 nm）を介してレーザビームを渡します。ステッピングモータに取り付けられたランチャーに接続された単一モード光ファイバを介して偏光レーザービームを合わせます。落射蛍光モードにおいて、励起ビームは、対物の背面開口部の中央にセンタリングされます。 臨界角に達していないビームがもはやサンプルを透過し、その代わりに完全にガラスセルを反射するまでの全反射を達成するために、対物レンズの後開口を横切る集束レーザ光を変換するためにステッピングモータを使用しリットルインタフェース。 排出経路（50分の525 nm）の中に搭載され、適切な発光フィルターを用いてイメージングソフトウェア（ 例えばをMetamorph）で制御EMCCD（512×512ピクセル）を使用して画像をキャプチャします。 イメージングソリューションを準備 150mMのNaClを混合して200ミリリットルに細胞外溶液（ECS）を準備し、4のKCl、2のMgCl 2、2mMのCaCl 2を、10mMのHEPESおよびNaCl、KClを、のMgCl 2、ののddH 2 Oストック溶液中の10 mMグルコースそして、のCaCl 2を予め用意し、撮影日に新鮮HEPESおよびグルコースと組み合わせることができます。 pH7.4に100ミリリットルECSを含む溶液のpHを調整します。 5.4のpHにECSの残りの100ミリリットルを調整します。 ECSの2ミリリットル（pH7.4）でトランスフェクトした細胞を洗い流します。 撮影の前にトランスフェクションされた細胞にECS（pH7.4）中の2ミリリットルを追加します。 TIRFでのライブセルイメージング includin、システム全体の電源をオンにG 488nmレーザー、カメラ、移動ステージ、及び撮像プログラム。落射蛍光ビームをフォーカスし、60X対物レンズで約1ミリワットの電力を調整します。 客観的にオイルを追加し、並進ステージ上にトランスフェクトされた細胞の皿を置きます。細胞が複数回撮像することができるように、それはステージに対して移動しない確実にするために、ステージマウントを使用して所定の位置に皿を固定します。 落射蛍光モードでは、顕微鏡を集中し、蛍光、トランスフェクトされた細胞を見つけます。細胞は、いくつかの焦点面全体に焦点を当てたままになります。 TIRFを続行するために、単一、単離された細胞の位置を確認します。 撮像プログラムにおいて、200ミリ秒の露光時間を設定し、EMゲインを設定することにより、蛍光強度を最適化します。 ステッピングモータを使用して、段階的に客観にわたってビームを変換することによってTIRFにレーザビームを遷移。それは目で収束するまで臨界角が近づくと、ビームは目に見えて皿の縁を横切って翻訳します試料面での全内部反射のE点。 細胞は、フォーカスノブを調整することにより、TIRFモードになっていることを確認します。 TIRFにおいて、細胞の唯一の面は、原形質膜の高分解能を有する非常に定義された画像を生成する、（ガラス界面から、すなわち約150nm）に焦点を合わせることができます。 細胞内局在を決定するためのイメージング9月 撮像面での健康、トランスフェクションし、単一細胞の位置を確認します。 pH7.4での細胞の焦点画像を取得します。 9月には、表示されるはずです形質膜と小胞体上の受容体を標識しました。 すぐに退色を防止するために、試料に到達するレーザ光を遮断します。 多数のXY位置を記録することができる顕微鏡イメージングソフトウェアを使用して、各セルに対応するステージ位置を覚えます。 ソフトウェアを使用中に皿当たり20-30細胞のための手順を繰り返し2.4.1-2.4.4、各セルの位置を記録します。 AfpH7.4でのすべてのセル画像が収集されているター、手動ピペットを用いてpH 7.4 ECS溶液を除去。これは記憶ステージ位置を移動できるように皿に手を触れないでください。 慎重に皿にpHが5.4 ECSの2ミリリットルを追加し、10分を待ちます。この間、以前に取得した画像を保存します。 、pH7.4で画像を収集し、各保存された位置にステージを移動し、pH 5.4での同じ細胞の画像を取得するために使用される条件の同一のセットの下で。すべての検出された蛍光は、受容体を標識した9月閉じ込められた小胞体から発信されるため、細胞を以下に定義さになります。 pHが5.4細胞画像を保存します。 生細胞内イメージング単一小胞の挿入イベント 2ミリリットルのpHが7.4 ECSと、またはライボビッツL-15培地をトランスフェクトした細胞の増殖培地を交換してください。リーボビッツのL-15培地のpHは、必要に応じて、撮像が長期間にわたって行わできるように、CO 2は独立しています。 Plac顕微鏡のステージ上でトランスフェクトされた細胞の皿を電子。安全で上記のステップ2.3以下TIRFに単一のセルを集中。 装備している場合、フォーカスが撮影の期間にわたってドリフトしないように、オートフォーカスを設定します。 連続して200ミリ秒のフレームレートで画像をキャプチャ、千一連のフレームを記録します。蛍光のバーストは外pH 7.4に9月を露出させ、形質膜と融合し、低pHの人身売買の小胞に対応し、この時間の間に表示されます。 別の1つのセルを探し、上記の手順を繰り返します。必要に応じてオートフォーカスをリセットします。 3.画像解析やデータ処理 細胞内局在を決定するための分析9月の蛍光 このようなをMetamorphまたはImageJの（http://imagej.nih.gov/ij/）などの画像解析ソフトを用いて細胞の画像を開きます。ボールの転がりの設定を使用して、両方のpH 5.4およびpH 7.4の画像からバックグラウンドを減算します。単一の細胞からの蛍光を定量化するために、強度ベースのしきい値を使用してください。手動でpH7.4の画像にセルの周囲の関心領域を選択します。 、セル面積を測定し、強度を意味し、統合された密度のImageJでプラグインを使用するか、または[分析]タブの下で「測定」機能に建て使用して。 慎重に同様の関心の強さベースのしきい値と地域を調整し、pHは5.4で同じセルのための手順を3.1.1-3.1.3繰り返します。 集積密度の両方のpH 7.4および5.4での細胞画像について取得された後、pHを7.4の値からのpH 5.4の値を減算することにより、原形質膜の集積密度を計算します。違いは、TIRFの励起領域内のプラズマ膜上の相対的な数の受容体に相当します。 人身売買の対策として、9月の相対的な割合を計算TIRF excitatiに見える残りの受容体と比較して、原形質膜上に位置する受容体を標識しました100を乗じたpH7.4の全積分密度によって密度を統合し、原形質膜を、分割することによってボリューム上。 単一小胞の挿入イベントの分析 画像解析ソフトウェアを用い千TIFFイメージのシリーズを開きます。ボールの転がりの設定を使用して、すべてのフレームからのバックグラウンドを減算します。 挿入イベントを小胞に対応する強烈な領域を最大化するために、記録のカラーバランスを調整します。手動長い3フレーム（> 600ミリ秒）よりも持続する蛍光のバーストを数えます。

Representative Results

受容体への9月の取り込みは、生細胞におけるその受容体の直接検出を可能にします。 TIRFMと相まって、これは、原形質膜とTIRF励起の領域における細胞内位置内の受容体の分布に相対的な発現レベルを評価することができます。単一の小胞輸送のイベントも解決することができます。 細胞膜上の9月で標識された受容体の相?…

Discussion

9月のpH感受性は、細胞膜に存在する受容体は、小胞体内の細胞内受容体と区別することができ、挿入イベントを解決するために使用することができる受容体担持小胞^{5、7、8、9、18、19、20} 。結合表面のビオチン化リガ?…

Materials

Reagent/Material
Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2	VWR	82050-856
35 mm glass bottom petri dishes, sterile	Cell E&G	GBD00002-200
Poly-D-lysine	vwr	215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), High Glucose	Fisher Scientific	11-965-084
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco / Fisher Scientific	31-985-088
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)	Gibco / Fisher Scientific	16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Fisher Scientific	12604-021
Penicillin-Streptomycin Solution	VWR	45000-652
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco / Fisher Scientific	21083027	Optional
Lipofectamine	Fisher Scientific	11668030	Gently mix; Do not vortex
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-10
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Objective immersion oil	Olympus	Type F
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Microscope	Olympus	IX81
Camera	Andor	iXon Ultra 897
60x, 1.49 NA oil immersion objective	Olympus	APON 60XOTIRF
Motorized stage	Prior	IXPROXY
Motorized actuator (stepper motor)	Thorlabs	ZST213
MetaMorph (or other imaging program)	Metamorph
488 nm laser	Market Tech
Single mode fiber	Thorlabs	SM450
Mirrors	Thorlabs	BB1-E01
Dichroic 488 nm LP	Semrock	Di02-R488-25×36
Bandpass filter, 488 nm	Semrock	LL01-488-12.5
Bandpass filter, 525/50	Semrock	FF03-525/50-25