遺伝的にコードされた蛍光一酸化窒素の応用（•NO）シングル細胞におけるNO•信号のリアルタイムイメージングのためのプローブ、geNOps、

サマリー

この原稿は、蛍光顕微鏡を使用して単一細胞のNO•変動をリアルタイムで監視するための新しい遺伝的にコードされた一酸化窒素(NO•)プローブ（geNOps）の適用のためのプロトコルを提示します。個々の内皮細胞レベルでのCa²⁺によって誘発されるNO•形成は、geNOpsと化学的なCa²⁺センサーを組み合わせることによって視覚化されました。

要約

一酸化窒素は、（•NO）、哺乳動物、細菌や植物に複数の重要な細胞機能を媒介する、小型の基です。 インビボおよびインビトロで NO•を検出するための多数の方法が存在するにもかかわらず、単一細胞レベルでのNO•のリアルタイム監視が非常に困難です。 NO•の生理学的または病理学的影響は、実際の濃度によって決定され、このラジカルの滞留時間をされています。したがって、NO•の単一細胞の検出を可能にする方法が非常に望ましいです。最近、我々は直接それゆえ、このニーズに対応し、携帯NO•変動に対応し、単一の蛍光タンパク質ベースの遺伝的にコードされた一酸化窒素（•NO）プローブ（geNOps）を導入することによってNO•指標のパレットを拡大しました。ここでは、NO•二つの異なる化学-liberating分子に応答して細胞内NO•信号を評価するgeNOpsの使用法を示します。我々の結果のALSO新たに調製した3-（2-ヒドロキシ-1-メチル-2- nitrosohydrazino）-N-メチル-1-プロパンアミン（NOC-7）と比較して、細胞内のNO•レベルの変化を誘発するための非常に高い可能性を秘めていることを確認します無機NO•ドナーニトロプルシドナトリウム（SNP）。さらに、緑色geNOps（G-geNOp）を用いて、二色生細胞イメージングおよび化学^の Ca ²⁺インジケーターフラ-2は、単一の内皮細胞中のCa ²⁺依存性NO•形成の厳しい規制を視覚化するために行きました。これらの代表的な実験はgeNOps、多様な実験的なセットアップに単細胞NO•信号のリアルタイムの生成および分解を研究するのに適したツールであることを示しています。

概要

我々は最近^、1 geNOpsと呼ばれる、遺伝的に符号化された蛍光NO•プローブの新規クラスを開発しました。これらのセンサは、異なる蛍光タンパク質（FP）バリアント^3（シアン、緑またはオレンジFP）にコンジュゲートしているだけで構築された、細菌由来、NO•結合ドメイン^2、で構成されています。 NO geNOps内の非ヘム鉄（II）センタ⁴への結合•瞬時に蛍光強度^1を低減^します。細胞内のNO•レベル^1を辞退するとき重要なのは、geNOps蛍光を迅速かつ完全に回復します。したがって、geNOpsは（サブ）携帯NO•変動のリアルタイムイメージングを可能にします。 geNOpsのNO•センシング機構は、これまで不明であるが、それらは優れたNO•記者であってもよく、ひいては多色、定量NO。•bioimaginの新時代を開くために効力を有することが証明されています高い空間と時間分解能¹とグラム^、5。他の利用可能な蛍光NO。•プローブは、細胞内にロードする必要がある小さな化学化合物、に基づいており、そして不可逆的^NO•6によって修飾されます。 NO•敏感な小フルオロフォアの追加の欠点は、それが困難な、信頼性の高い分析と決定的な方法^7、8、9でそれらを使用することを可能にする彼らの潜在的な細胞毒性および比較的低い特異性です。遺伝的にコード化された蛍光プローブの有効利用が効率的な遺伝子導入技術を必要とするが、FPベースの遺伝的にコードされたセンサは、細胞^10、11の内部機能の我々の理解に革命をもたらしている必要不可欠なツールとして浮上しています。シングルFP-ベースgeNOps、Fの開発の前にörster共鳴エネルギー移動（FRET）、NO•センサベースないNOA-1 ^12は 、構築されたと呼ばれます。佐藤ら。 NO•感受性可溶性グアニル酸シクラーゼ（sGC）の二つのサブユニット、環状グアノシン一リン酸（cGMP）レベル^12を報告共役するFRETベースのセンサの両方で構成され、この洗練されたプローブを設計しました。このプローブはcGMPのに応答するように、それは間接的にしか細胞内NO•変動^12を感知^します 。 NOA-1は、ナノモル範囲のNO•上昇に応答しますが、このツールは、おそらくこのかさばる二部センサーの可用性と実用性に関する制限のために、これまで頻繁に使用されていません。

基本的な生物学的プロセスはよく^13、14を特徴づけてきたインパクトNO•、の多彩な機能。多くの研究は、NO•concentratioことを証明しましたn個のセルとサブドメイン内の健康と病気^14、15、16で細胞の運命を決定します。哺乳動物では、NO•主によく特徴付け一酸化窒素合成酵素（NOS）ファミリー¹⁷によって種々の細胞型に酵素的に生成されます。これまで、NOSの3つのアイソフォームは^{、18、19、20に}記載されています。これらは、Ca ²⁺ /カルモジュリン依存性内皮NOS（eNOSのまたは^NOS-3）18およびニューロンNOS（のnNOSまたは^{NOS-1）19、}およびCa ²⁺ /カルモジュリン依存しない恒常的に活性誘導型NOS（iNOSのかnoso-の異形です^2）20。また、ミトコンドリアNOS（mtNOS）の存在も²¹示唆されています。しかし、mtNOSはのnNOSのスプライシングバリアントと考えられているので、別々に分類されていませんアイソフォーム²¹として。他のアイソフォームは、離れた哺乳動物細胞のものと、いわゆる細菌NOS（bNOS）は、主にグラム陽性菌²²に見出されます。 NO•の酵素の生産は高度に制御し、アデニンジヌクレオチド（FAD）、テトラヒドロビオプテリン（BH4）、分子状酸素およびL-アルギニン^{17フラビン} 、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）などのいくつかの補因子の利用可能性に依存します。カチオン性アミノ酸L-アルギニンは、NO•産¹⁷時L-シトルリンに変換する基板です。 NO•の高度に調節された酵素の生成に加えて、ラジカルは、低酸素条件下²³の下でのミトコンドリアによって亜硝酸塩プールから非酵素的に低減することができると仮定されています。 NO•が細胞内で生成されると、それは自由に生体膜¹⁴を通って拡散することができ^、refは"> 15。しかし、この基の非常に短い半減期は、主に、環境条件によって決定され、そして種々の経路との化学反応を効率的にNO•レベル^24を劣化^させる。最終的に、NO•の生成、拡散、および分解が依存します高度に生物学的に活性な分子²⁴の有効濃度を決定する多様な環境パラメータに。

geNOps技術は、（サブ）の細胞のNO•変動¹の直接検出を可能にし、再調査することが適しており、新たに携帯NO•信号の蓄積と分解のための責任のメカニズムを発見します。ここでは、個々の細胞のレベルでは、単純なプロトコルおよび外因的に誘発された可視化するgeNOpsの使用のための代表的な結果と内因的に生成されたNO•プロファイルを提供しています。また、geNOps技術は、APに適合させることができます多様な細胞の刺激やストレスに応答してNO•形成、拡散、及び分解の複雑なパターンを研究する他の細胞モデル系で襞。

プロトコル

化学緩衝液および溶液の調製

1. 135 mMのNaClを含む貯蔵緩衝液を調製し、5ミリモルのKCl、2mMのCaCl ₂を、1mMのMgCl _2、10mMのHEPES、2.6 mMの_炭酸水素ナトリウム、0.44 mMのKH ₂ PO _4、0.34ミリモルのNa ₂ HPO _4、10mMのD-グルコース、2mMのL-グルタミン、1×MEMビタミン、1×MEMアミノ酸、1％ペン連鎖球菌、および1％アンホテリシンB蒸留水に全成分を溶解し、室温でマグネチックスターラーを用いて20分間バッファーをかき混ぜます。 1 M NaOHを用いて7.44にpHを調整します。連続的に撹拌しながらNaOHを滴下すると、pHメーターを用いてpHを測定します。
2. 140のNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl ₂を、1mMのMgCl _2、10mMのD-グルコース、および10mM HEPESで構成生理のCa ²⁺含有緩衝液を調製します。ステップ1.1で説明したようにNaOHを用いてpHを7.4に調整します。
3. 同じ成分で構成されてのCa ^2+を含まない緩衝液を準備しますステップ1.2に記載されています。 1mMのEGTAの代わりに2 mMのを使用してください。
4. 1mMの原液を得るためにDMSO中でのFura-2AMを可溶化します。までの1ヶ月間-20℃で密封バイアルおよびストア内の原液を等分。凍結した場合、ストック溶液を光から保護し、少なくとも1時間室温で平衡化させます。 3.3μMの最終濃度を得るために、1ミリリットル格納バッファ（ステップ1.1）へのFura-2AMストック溶液を希釈します。
5. 蒸留水（pH7.0）中の100mMヒスタミンストック溶液の1ミリリットルを準備します。 100μMのヒスタミンの最終濃度になるように生理的緩衝液を含有する100ミリリットルのCa ²⁺で100 mMのヒスタミンストック溶液を希釈します。
6. 300μMの最終濃度を得るために、カルシウムを含有する生理学的緩衝液100ml中Nωニトロ-L-アルギニン（L-NNA）を可溶化します。 L-NNAが完全に溶解するまで少なくとも1時間、37℃の水浴で溶液を保存します。
7. 10 mgの可溶化NOC-7蒸留ワシントン州ター液（pH 7.0）、10mMのストック溶液を得ました。密閉バイアルに小分けでストック溶液を分注し、-70℃で直ちに保存します。 10μMのNOC-7の最終濃度を得るために、生理的緩衝液中のNOC-7ストック溶液を希釈します。
   注：NOC-7は、自然に短い半減期でNOを放出する小化学化合物です。常に直前に、各実験にNOC-7で構成作業バッファを準備します。
8. 生理的カルシウム緩衝液に1 mMのニトロプルシドナトリウム（SNP）溶液を作製し、10μMの希釈液を準備します。
   注：常に少量のため、迅速な分解速度のNO-ドナー溶液の（〜10ミリリットル）を準備します。
9. 137のNaCl、2.7 mMの塩化カリウム、9.2 mMののNa ₂ HPO _4、および1.5mMのKH ₂ PO ₄からなるリン酸緩衝液（PBS）を準備します。 NaOH / HClで7.44にpH値を調整します。

2.細胞調製

注：O中RDERは、細胞が鉄のFe ^2+を復元するために、画像化実験の前に緩衝液を含む（II）/ビタミンCでプレインキュベートする必要geNOpsを使用して単一の細胞において一酸化窒素（•NO）の測定の性能の均一性を達成するためNO•-probesのNO• - 結合ドメイン内。 EA.hy926およびHEK293細胞の場合には、鉄（II）ブースター溶液で20分間インキュベーションNO•センサの完全な活性化をもたらします。

1. 6ウェルプレートのウェルに30ミリ顕微鏡カバーガラス上の次の日のために5.5×10 ⁵ EA.hy926またはHEK293細胞または翌日翌日のために3.5×10 ⁵個^の細胞を、シード。 5％CO ₂の加湿環境中37℃で細胞をインキュベートします。
   注：哺乳動物細胞とウイルス構造のアデノウイルス感染に関する詳細な情報は、チャンらにより記載されています。 ^25。このステップは、安定的にG-geNOpを発現するHEK 293細胞には適用されません。
2. ウシ胎児血清（FCS）および抗生物質を含まないダルベッコイーグル改変培地（DMEM）に乗り、G-geNOp（MOIのためにコードする遺伝子を運ぶアデノ随伴ウイルスタイプ5（AAV5）ベクトルを追加します。EA.hy926細胞のための500はほぼ100をもたらします％陽性細胞; MOI：1は、HEK293細胞のために効率的です）。
   注：アデノ随伴ウイルスベクターの使用は2バイオセーフティレベル2の封じ込めは、一般的に、このベクターでの作業のために必要とされるリスクグループに割り当てられています。必要であれば、ウイルス感染はまた、培地を含むFCS中で行うことができます。あるいは、細胞は、一過性脂質ベースのキャリア^1を用いてトランスフェクトすることができます。
3. 培養培地を除去し、予め温めておいた（37℃）PBSで細胞を洗浄。 1時間各ウェルにDMEM / AAV5培地の1ミリリットルを追加します。このステップは、安定的にG-geNOpを発現するHEK 293細胞には適用されません。
4. 10％のFCSの最終濃度になるように各ウェルに20％FCS含有DMEMの1ミリリットルを追加します。細胞からAAV5含有培地を除去しないでください。ヘントlyがウェル内の媒体を均質化するためにプレートをシーソー。 5％CO ₂を含む加湿環境で37℃で48時間、細胞をインキュベートします。このステップは、安定的にG-geNOpを発現しているHEK293細胞には適用されません。
5. 48時間後、予め温めておいたPBSで細胞を洗浄。続いて光照射から保護し、少なくとも1時間、部屋室温で細胞を各ウェルに2ミリリットル予め温め保存バッファー（セクション1.1）を追加し、インキュベートします。
6. 室温で/ウェル鉄（II）ブースター溶液1ml（RT）で保存緩衝液を交換してください。暗闇の中で正確に20分間細胞をインキュベートします。
   注：これはNO•プローブの応答性に影響を与える可能性があるとして、最適なインキュベーション時間を超えたり削減しないでください。
7. 貯蔵緩衝液で1回細胞を洗浄し、細胞を平衡化させるために、室温で少なくとも2時間、2 mLの貯蔵緩衝液で各ウェルをインキュベートします。
8. 保護された、RTで45分間、1ミリリットルの貯蔵緩衝液中3.3μMのFura-2AMと記憶バッファを交換してください光から。
9. 保存緩衝液で細胞を2回洗浄し、細胞を平衡化させるために、少なくとも30分間再びインキュベートします。

個々の細胞におけるNO•およびCa ²⁺シグナルの3ライブセルイメージング

1. 金属灌流チャンバー内（ステップ2.1から）EAhy.926またはHEK293細胞で被覆された30ミリメートルカバースリップを修正し、顕微鏡上に置きます。バッファ貯水池への流入管と真空ポンプへの流出を接続します。一貫した流れを確認し、カバースリップの排出を避けます。
2. 半自動灌流システムを使用して（ステップ1.2から）生理的カルシウム緩衝液で重力駆動灌流を開始します。
   注：このようなシステムは、（ 図1B参照）バッファ貯水池、それぞれのチューブ、電子的に制御されている電磁弁、真空ポンプで構成されています。流量は、1〜3ml /分に灌流リザーバの高さに依存する範囲であることができます。一貫性のある局所薬物アプリのためのカチオンは、すべての使用貯水池の流量がほぼ一致する必要があります。これは、イメージング実験の前にテストする必要があります。内皮細胞は、厳密な灌流により誘導することができる剪断応力の増加に応答することを考えます。
3. イメージング・システムに切り替えて、30分間、すべてのデバイスのウォームアップができます。
4. それぞれのソフトウェアを使用して撮影設定を定義します。励起波長340 nmおよびフラ-2イメージングおよび刺激的なG-geNOpのための480 nmの380 nmのを選択します。蛍光漂白を最小にするために4にカメラのビニングを増加させ、励起強度および露光時間を減らします。参照してください。また、3.6から3.8を繰り返します。
   注：イメージングの設定とパラメータが使用されるデバイスに依存し、フラ-2積載効率とG-geNOp発現レベル。
5. いくつかの蛍光細胞が焦点になるまで、顕微鏡のXYZテーブルを移動させることにより、撮像領域を選択します。そして、それぞれのソフトウェア・ツールを使用して興味（関心領域）の領域を定義します。いくつかの全体SINGLをカバーする領域を描きます手動イメージング分野ごとに電子蛍光細胞。また、同様の大きさの背景領域を定義します。
   注：画像を取得して記憶された後のROIは、それぞれの画像解析ソフトウェアを使用してさらに分析するために画像形成プロセスの後、新たに定義することができる（材料リストを参照）。
6. 電動式試料ステージと反転して高度な蛍光顕微鏡、および単色光源上のデータの収集を開始。交互にそれぞれ、G-geNOpのための340 nmおよびフラ - 2AMのための380 nmおよび480 nmで励起します。全てのチャネルについて、明確な蛍光シグナルが経時的に検出可能であるように、それぞれの露光時間を設定します。 3.4ステップも参照してください。
   注：これは、励起光とカメラのビニングの強度に依存します。例えば、励起光の15％強度、340 nmの、380 nmのための50ミリ秒、および480 nmのための300ミリ秒4と150ミリ秒のカメラのビニングを使用します。 3.4ステップも参照してください。
7. フラ-2 / AM用の510nmで、G-GENOのための520 nmで放出された光を集めます500 nmの励振器、495 nmのダイクロ及び510〜520ナノメートルの発光体からなる適切なフィルターセットを用いて、電荷結合素子（CCD）カメラを用いて、P。録音1総フレームごとに3秒。
8. 時間をかけてそれぞれの蛍光シグナルのベースラインを得るために、生理のCa ²⁺緩衝液（1.2）の最初の分（3分まで、必要に応じて）を記録します。
9. 安定したベースラインの蛍光が観察された後、3分間細胞を刺激する生理的なのCa ²⁺緩衝液を含む、100μMのヒスタミンまたはATP（1μMまたは100μM）に切り替えます。
   注：アゴニストに応答するEA.hy926細胞はフラ-2比（380 nmで励起し、蛍光を介して分割された340 nmで励起された蛍光）とG-geNOp蛍光シグナルの明らかな減少の急激な増加を示しています。
10. 細胞からの化合物を除去するために5分間ヒスタミンまたはATPとL-NNAせずにバック生理のCa ²⁺のバッファに切り替えます。このステップでは、蛍光物質まで延長される可能性がありますcenceの変更は完全に回復しています。
11. 灌流システムを使用して2分間生理^の Ca ²⁺緩衝液中で10μMのNOC-7を管理します。 NOドナーは強く、通常、10μMのNOC-7に対応して> 20％減少し、G-geNOp蛍光に影響を与えます。 EA.hy926細胞ではNOC-7の効果は、G-geNOp蛍光クエンチアゴニスト誘導に比べて約3倍強力です。
12. 生理のCa ²⁺緩衝液及び基礎蛍光が回復されると、記録を停止で約10分間、NO•-releasing化合物を洗浄します。

4.データ解析

1. エクスポートは、データ分析ソフトウェアに、時間をかけて単一細胞の平均蛍光強度のデータを取得しました。
2. それぞれのバックグラウンド値を減算し、時間をかけて各単セルのそれぞれのフラ-2信号の380 nmのことで340ナノメートルの比率を計算します。
3. 実際のFLを得るために、G-geNOpチャネルのバックグラウンド値を減算任意の計算ソフトを使用して、時間をかけてNOプローブ（F）の強度uorescence。
4. F _{0（F 0を}刺激することなく、時間をかけてNOプローブの蛍光をある）として、ベースライン蛍光値をとります。 4.5および図1Cのステップも参照してください。
5. 以下の式を用いて、蛍光漂白効果のために時間をかけて関数を計算：F ₀ = F _{inital。•EXP（-K•}時間）+ F _高原 。 Fの_inital：イメージング一度最大蛍光シグナルが開始されます。 K：経時的な蛍光漂白の速度定数; F _高原 ：時間をかけて漂白することによって到達蛍光最小。参照してください4.3- 4.4および図1Cを繰り返します。
   注：近似のために、前および細胞刺激後の時間をかけてすべての蛍光値が使用される場合があります。更なる詳細は、ベントレーらによって特定されます。 ^27。
6. 時間をかけてG-geNOp信号を標準化するために、1-F / Fを計算_0（ステップ4.3から4.5）。 図1Cおよび1Dを参照してください。

結果

一過アプライドNOドナーに応答したシングルセルNO•プロファイルの可視化

我々は2つの異なるNO-遊離小化学化合物、NOC-7およびSNPに応答して、単一細胞レベルでのNO•信号を可視化しないためには、安定的にG-geNOp（ 図1A）を発現する HEK細胞クローンを使用しました。 NO•ドナーを連続連続流（ 図1B）を確保し、重力ベースの灌流システムを用いた撮像時に適用され、細胞から除去しました。異なる強度でG-geNOpを発現するすべての細胞はNO•ドナーを添加すると、細胞内の高速NO•蓄積を示す、NOC-7およびSNP（ 図1C）に応じて、蛍光の明らかな減少を示しました。正規化された蛍光シグナル（1-F / F _0）は、両方_の NO•ドナーが均質蜂巣を誘発することを実証しましたNO R•完全にNO•-releasing化合物（ 図1D）のウォッシュアウト時に回復標高。しかし、10μMのNOC-7（18.10±1.20パーセント、N = 3/38、pで到達した携帯NO•信号のわずか50％（9.63±1.05パーセント、N = 3/38）に誘導され、10μMのSNP < 0.0001）。 NOドナーます、SNPの1 mMの濃度が必要であった（ 図1C、1D）の両方と同じ細胞内のNO•レベルを達成するために。

次に、私たちはHEK細胞における細胞内NO•レベルを上昇させるために、期限切れのNOC-7対準備たての能力をテストしました。この目的のために、我々は、5μMのNOC-7を含む4つの実験のバッファを用意しました。 NO•ドナーは、どちらかだけで、測定前に新たに添加、または1時間、2時間、および測定前に室温で3時間貯水池内に保持しました。異なる緩衝液を連続的に適用し、Fを除去しました潅流システム（ 図2B）を使用して、G-geNOp発現細胞をROM。このアプローチは、予想されるように、細胞内のNO•レベル（ 図2A、2C） を上昇させるために時間をかけて能力を低下示した水性NOC-7溶液の安定性を発表しました。おそらく細胞成分で分子を-liberating NO•無傷の付着がないことを示す、新鮮なNOC-7（ 図2C）によって誘発された細胞内NO•応答と比較して興味深いことに、NO•信号は、期限切れのバッファを除去する際に大幅に高速回復しました。

同時のCa ²⁺の可視化とNO•単一内皮細胞内シグナル

Ca ^2+を研究するために、内皮細胞のNO•形成を-triggered、一般的に使用される内皮細胞サロゲートを不死化、EA.hy926細胞株、トンでしたransiently G-geNOpでトランスフェクトし、（プロトコル2.8を参照）のFura-2 / AMでロード。トランスフェクションは、G-geNOp陽性の内皮細胞の約10％が得られた（n = 6は、 図3A）のCa ^2+を記録するのに十分である、単一の内皮細胞のレベルでNO•生産を-evokedません。しかし、我々は、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて、ほぼ100％のG-geNOp陽性のEA.hy926細胞を達成した（n = 6;プロトコル2.2を参照してください）。多チャンネル測定の前に、細胞を、L-NNA、強力な不可逆的NOS阻害剤^26からなる保存バッファー中、室温で20分間インキュベートしました。対照細胞は、L-NNA（プロトコル1.1を参照）（ 図3B）ことなく、同じ保存緩衝液中に保持しました。ヒスタミンと対照細胞の処理、強力なイノシトール1,4,5-三リン酸（IP _3）アゴニスト、アゴニストが削除するまで、細胞内NO•の緩やかな増加が続く瞬時に上昇した細胞質ゾルのCa ²⁺レベルを-generatingD（ 図3C、3D）。細胞内のNO•レベルはヒスタミンに対する応答（ 図3E）にはほとんど影響を受けないままであったNOS阻害剤で前処理した細胞は、同様の細胞質ゾルのCa ²⁺シグナルを示しました。 G-geNOpを発現してEA.hy926細胞はまた、geNOpsが低い生理学的および超生理学的の両方に対応してNO•信号を監視していないのに適しているかどうかをテストするために、IP ₃発生アゴニストATPの1μMおよび100μMで処理しましたアゴニスト（ 図3F）の濃度。内皮細胞株では1μMATPが約100μMATP（ 図3F）で得られた信号の半分だった明確な細胞質ゾルNO•信号を、誘発しました。

図1：異なるNO-liberatiに応答した細胞内NOプロフィール ngの分子。 （A）を安定サイトゾルG-geNOpを発現するHEK細胞の広視野画像。 =20μmのスケールバー。 （B）NOC-7およびSNPの制御された適用および除去のための重力ベースの半自動灌流システムの模式図。 （C）代表（3つの独立した実験のうち）非正規化された単一細胞の蛍光強度は、安定的に10μMのNOC-7に応答して細胞質ゾルG-geNOpを発現するHEK細胞の時間に対する任意の単位で追跡し、10μMSNP、および1mM SNP。黒太線は26単細胞トレース（ライトグレーの曲線）の平均曲線を表しています。点在黒色の曲線は、正規化のために使用されたF ₀表します。 （D）正規化と反転シングルトレース（1-F / F _0、ライトグレーの曲線）、および10μMのNOC-7に応答して、時間をかけて曲線（黒太線）を意味、10μMのSNP、および1mMのSNPから抽出されましたパネルC.エス/ ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：安定にG-geNOpが発現するHEK細胞を使用して、NOC-7の安定性試験。新鮮と古いNOC-7の緩衝溶液を加えるとHEK細胞を発現する安定的にG-GeNOpsの時間（A）代表NO•濃度応答曲線。すべてのNOC-7含有緩衝液は、同じ原液（50 mm）を使用して、5μMの最終濃度で最初に調製しました。調製後のそれぞれの溶液の経過時間示されるように、イメージングは​​、1時間、2時間、および3時間に達するまで。 （B）連続して追加し、撮像中NOC-7を含む溶液を除去するために、重力ベースの半自動灌流システムの模式図。 （C）の時間的相関新たに調製したに応答して信号と古いNOC-7のバッファ•携帯NO。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：単一EA.hy926細胞におけるNO•およびCa ²⁺シグナルの同時マルチチャンネルイメージング。 （A）フラ-2 / AM（中央および右パネル）でロードされているG-geNOp（左パネル）を発現EAhy.926細胞の代表的な広視野蛍光画像。 =20μmのスケールバー。 （B）測定の前に、6ウェルプレート中で20分間、500μMNωニトロ-L-アルギニン（L-NNA）でEAhy.926細胞の処置を示す概略図。 （C）フラ-2（励起の同時記録の代表的な時間経過：340 nmの/ 380nmのemissイオン：510 nm）をG-geNOp信号（励起：480nmで、発光：520 nm）を100μMのヒスタミンに対する応答インチ示さヒスタミンよう灌流システムを使用して3分後に除去しました。 （D）曲線は、細胞質ゾルのCaの同時録画を表す^2+（フラ-2比信号、F ₃₄₀ / F _380は灰色の実線）とNO•信号（正規化と反転曲線、1-F / F _0は緑の実線です）シングルフラ-2 /の時間をかけて一時的にG-geNOpを発現する内皮細胞をロードしています。細胞を3緩衝液を含むのCa ^2+（2ミリモルのCaCl _2）中で分（N = 8/3）、100μMヒスタミンで刺激しました。 （E）代表は同時に^の Ca ^2+（灰色の実線）を記録し、NO•500μMのNω-ニトロ-L-アルギニン（L-NNA）で前処理したEA.hy926細胞の経時（緑の実線）信号前測定へ（N = 12月3日）。細胞を、2 mMの存在下で、100μMのヒスタミンで処理しましたCa ^2+。 100μMのATPと第二の細胞刺激に続いて1μMのATPに応答して細胞質ゾルNO•信号を表す（F）の平均曲線。バーは1μMATP（白バー）と4つの独立した実験の100μMのATP（緑のバー）に応じて、最大G-geNOp信号の平均値±SDを表します。 P <0.001対1μMのATP。 P値は、対応のないt検定を用いて計算しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

生物学²⁸における重要なシグナル伝達分子としてのNO•の発見以来、可能かつ確実に高解像度の単一の細胞、組織および動物全体におけるラジカルの特定のリアルタイム測定が望まれています。ここでは、広視野蛍光顕微鏡^1を使用して、正確なNO•信号のライブセルイメージングを可能にする最近開発された遺伝的にコードされた蛍光のNO•プローブ（geNOps）の適用を報告しています。

安定した緑色蛍光G-geNOpを発現精巧かつ侵襲的なトランスフェクション手順を回避するHEK細胞クローンは、外因生成単細胞NO•プロファイルを定量しました。 HEK細胞は、通常、NOを•内因²⁹産生しないように、この細胞型は、共培養条件の多くの他の用途に有用であるかもしれないgeNOpベースセンサー細胞株の生成に適していますNOと•初代細胞、あるいは動物^30生き中を生産します。しかし、本研究では、HEK細胞モデルを表現するG-geNOpを用いた細胞内NO•信号を喚起するために、異なる濃度および安定性の化合物を、-liberating様々なNO•の能力を実証します。我々のデータは、アプリケーションのNO•-donor濃度、品質及び方法は、最終的には細胞内のNO•プロファイルのパターンを決定することを明らかにしました。このような情報は、いくつかの疾患の指標である異なるNO•ドナーのその場での薬物動態学的特性評価のために不可欠です。特に、geNOpsは安定して非常に長い時間¹上^に NO•-donorパルスの複数の反復的なアプリケーションに対応することが示されています。したがって、本明細書に示される化合物を-liberating•NOを用いた実験では、それぞれの細胞のNOの様々な振幅と動態に関する半定量的結論を可能にします226;信号（ 図1及び2）。

安定に発現するHEK細胞クローンは、おそらく単一の細胞に由来するが、G-geNOps発現レベルの広範な不均一性は、（ 図1）が観察されました。これは、関心のある（ゲノム統合）遺伝子の転写は、細胞増殖速度^32に影響^を与える多様な環境ストレス³¹として多くの因子の制御下にあるように、安定な細胞クローンの一般的特徴であり、細胞周期の状態^33。シングルFP-ベースgeNOpsは、したがって、NO•はgeNOp発現レベル¹と蛍光強度が増加の損失を誘発、非レシオメトリックプローブであると。したがって、geNOps信号の正規化は、特に、比較分析の場合には携帯NO•信号を定量化するために不可欠です。我々の最近の研究では、厳密な線形相関（b）に示すように、etween geNOpsの基底蛍光強度と蛍光強度の広い範囲にわたってNO•誘導性の蛍光消光の強度は^1を発見されました。これは、細胞のNO•信号の絶対定量化のためのgeNOpsの重要な特徴です。 図1に示すように 、NOC-7およびSNPに応答したG-geNOps信号の正規化は、HEK細胞が取り込む能力に関してで多様されていないことを示す、同じプレートから別のHEK細胞に均質NO•信号を明らかにしましたそして、NO•ドナー由来するラジカル•NOを劣化させます。これとは対照的に、HeLa細胞中で使用してgeNOpsは、NOC-7に対応して異なる細胞間の細胞NO•信号の明確な不均質性を実証しました。これらの違いは、細胞生理学および病理学における複数の意味を持っているかもしれない、とgeNOpを使用して明らかにすることができる、細胞型特異的NO•代謝や分解速度を指しますsの技術。

それにもかかわらず、geNOpsの2つの重要な機能は、センサーとデータ解釈の正しい使用方法については慎重に検討する必要があります：ⅰ）geNOpsはgeNOpsことができ、完全にFPバリアントに応じて^NO•1に対応し、ii）のために十分な鉄（II）が必要ですpH感受性¹です。ここでは、HEK、HeLa細胞またはEA.hy926細胞（プロトコル2.6を参照）のいずれかで表されgeNOpsの無毒鉄（II）補充のために適切であることが見出されているプロトコルを記述する。それは鉄と細胞処理は（II）/ビタミンCは、細胞形態、細胞生存率および細胞¹の代謝活性に影響を及ぼさなかったことが実証されているが、他の細胞型および組織のためのこの重要なステップを最適化するために不可欠であるかもしれません。しかし、いくつかの実験条件では、鉄（II）の負荷の要件はgeNOpsの適用が制限される場合があります。注目すべきは、アスコルビン酸は、Nを減少させることができることが示されています•O ³⁵とアスコルビン酸-鉄（II）錯体は^{、NO•36、37を}捕捉することができます。また、過剰な鉄（II）およびアスコルビン酸は、炎症応答³⁹と脱共役eNOSの^41を誘導^することができます。このような効果はgeNOps技術を使用する場合に考慮する必要があります。特定の実験条件下で、細胞内pHがgeNOps蛍光^1に影響^を与える可能性を有する^、34著しく影響されることが示されています。特に、シアン、緑geNOps変異体は、比較的pHを酸性化¹時の蛍光の減少を示す敏感です。 pH感受性geNOpsを使用しているときしたがって、（サブ）の細胞のpHの急性変化は、偽のNO•信号をシミュレートすることがあります。負の制御として私たちの前の仕事、NO•小文字を区別しないgeNOps（geNOpsの^MUT）の並列使用で示唆したようにlsコマンドは、pHが^1を変更するから、実際の携帯NO•信号を分析することをお勧めします。加えて、細胞のpHの変化は、削ぎ接ぎする³⁴等のpHプローブを用いて検査することができます。

さらに、我々は、内皮細胞代理EA.hy926で生理のCa ²⁺ -mobilizingアゴニストに応答して、内因性酵素NO•形成を可視化しました。 EA.hy926細胞株は、一貫してeNOSの³⁸発現頻繁に使用されるモデル系です。一過EA.hy926細胞で発現geNOpsの使用は、IP _3は、Ca ²⁺シグナルはほぼ完全にL-NNAによってブロックされた、この細胞型に深いNO•形成を引き起こす媒介することを確認しました。一時的にNO•信号と^の Ca ²⁺を相関させるためには、G-geNOp発現細胞は、UV励起性化学のCa ²⁺ -indicatorフラ-2 / AMを負荷しました。 Ca ²⁺結合および非結合フラ-2のfluoのスペクトル分離市販のフィルタ^40を設定してG-geNOp信号からrescenceを容易に実現することができます。イメージングプローブの両方は、Ca ²⁺ -triggered酵素NO•形成がこの内皮細胞型における細胞質ゾルのCa ²⁺の上昇に比べてはるかに遅く発生することを発表しました。 IP ₃発生アゴニストブラジキニン、ならびにせん断応力を用いた細胞治療の際にウシ肺動脈からの内皮細胞における単一細胞NO•信号の同様の動態は、NOA-1、間接性の高いNO•感受性センサー^12を用いて報告されています。したがって、これらのデータは、Ca ²⁺完全な酵素活性に到達するまでのeNOS由来NO•形成は、特定の開始時間を必要-evokedことを強調する。携帯NO•形成の速度は、拡散や劣化が他のデータから抽出することができますが、NO•の例えばテンションベースの測定は、血管弛緩を誘発しましたSS = "外部参照"> 26、蛍光のNO•プローブの大きな利点は、彼らが直接、リアルタイムに可視信号に携帯NO•変動を変換することです。したがって、geNOps付き携帯NO•信号を画像化することは、高い空間分解能と時間分解能を提供し、（サブ）携帯NO•ホメオスタシスを調査（再）にユニークな可能性を提供しています。例えば、単一の内皮細胞にgeNOps技術との組み合わせで^42を往復イメージングのeNOSはNO•産生酵素またはそのようなカルモジュリンおよびカベオリン⁴³などの他の関連するタンパク質の細胞内局在や転座でNO•形成を相関するのに適している可能性があります。

ここでは、従来の広視野蛍光mに単一細胞レベルで、リアルタイムでHEKとEA.hy926細胞外因を可視化すると、体内で産生させるセルラーNO•信号を発現しているG-geNOpの実用的なアプリケーションを記述するicroscope。我々のデータはgeNOpsが特に興味深いの細胞型のすべての種類を使用して、種々の実験条件下での（サブ）セルラNO•ダイナミクスを追跡するのに適していることを意味します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3957.20	ナトリウム
塩化物 KCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6781.1	塩化カリウム
CaCl2·2H2O	カール・ロス、カールスルーエ、ドイツ	T885.1	塩化カルシウム二水和物
MgCl2·6H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2189.2	塩化マグネシウム六水和物
HEPES	Carl Roth, カールスルーエ, ドイツ	9105.3	4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
NaHCO3	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8551.1	炭酸水素ナトリウム
KH2PO4	メルク、ダルムシュタット、ドイツ	104873	リン酸二水素カリウム
Na2HPO4·2H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4984.1	リン酸水素ナトリウム二水和物
D(+)-グルコース一水和物	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6780.1	>99.5%; for cell culture, endotoxin free
EGTA	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3054.2	エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N⁠,⁠N⁠,⁠N⁠&プライム;⁠,⁠N⁠&プライム;⁠-四酢酸;カルシウムキレート剤
NaOH	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6771.1	sodium hydroxide
HCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4625.1	塩酸, 発煙, 37% (~10 N)
DMSO	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4720.1	ジメチルスルホキシド; 高極性、非プロトン性有機溶媒
L-グルタミン酸塩酸塩	Sigma Aldrich, Vienna, Austria	G2128	(S)-2-Aminoglutaric
acid DMEM, low glucose	Sigma Aldrich, Vienna, Austria	D5523	Dulbecco'のモディファイドイーグル」中 - 低グルコース;1,000 mg / LグルコースとL-グルタミン、重炭酸ナトリウムを含まない粉末、細胞培養に適しています
MEM ビタミン溶液 (100x)	Gibco/Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ	11120037	標準の最小必須培地(MEM)に含まれるビタミンの 100倍
MEM アミノ酸溶液 (50x)	Gibco/Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ	11130036	標準の最小必須培地(MEM)に含まれる必須アミノ酸(L-グルタミンを除く)の 50 倍
ニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/ml)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140122.00	細胞培養の細菌汚染を防ぐ抗生物質
Amphotericin B	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15290026.00	Gibco Amphotericin B contains 250 & micro;アムホテリシンB(真菌ゾン)および205のg&マイクロ;gデオキシコール酸ナトリウム;酵母および多細胞真菌による細胞培養物の汚染を防止
FCS	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270106	Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10010031.00	リン酸緩衝生理食塩水
Fura-2 (AM)	Teflabs, Austin, TX, USA	102	蛍光細胞質カルシウムインジケーター
ヒスタミン二塩酸	Sigma Aldrich, Vienna, Austria	H7250	2-(4-イミダゾリル)エチルアミン二塩酸塩;IP3生成アゴニスト
Nω-Nitro-L-arginine	Sigma Aldrich, Vienna, Austria	N5501	N5-(ニトロアミジノ)-L-2,5-ジアミノペンタノン酸;L-NNA; 一酸化窒素合成酵素
NOC-7	Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany	487952	3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; 一酸化窒素(NO)ドナーの短い半減期 NO放出
ニトロプルシド二水和物	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-203395A	ナトリウムニトロフェリシアン化物(III)二水和物; 一酸化窒素放出化合物
30 mm カバースリップ	カール・ヘクト、ソンドハイム対rhön、ドイツ	41001130	ガラスカバースリップ、HECHT「アシスト」、サイズ1、丸型、30mm、(VE:100個)
Iron(II) booster solution	Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria	n.a.Iron	(II) containing physiological buffer for non toxic iron）(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp プラスミド	次世代蛍光イメージング (NGFI), グラーツ, オーストリア	n.a.	プラスミド DNA コード: green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5	次世代蛍光イメージング (NGFI)、グラーツ、オーストリア	n.a.	アデノウイルス グリーン NO 感度プローブ (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOpセンサー細胞株	次世代蛍光イメージング(NGFI)、グラーツ、オーストリア	n.a.	ヒト胚性腎臓細胞株(HEK293)は、緑色NO感度プローブ(G-geNOp)を安定して発現しています。 http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A細胞株	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	R70507	ヒト胚性腎臓細胞株 (HEK293)のサブクローン
EA.hy926 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany	CRL-2922	体細胞ハイブリッドクローン ヒト臍帯静脈細胞株とA549
TILL iMIC	Till Photonics, Graefling, Germany	n.a.	デジタル顕微鏡
Polychrome V monochromator	Till Photonics, Graefling, Germany	n.a.ultra	fast
switching AVTStingray F145B	Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany	n.a.Versatile	CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40	Zeiss, Göttingen, Germany	n.a.40X	objective
dichroic filters	Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA	n.a.GFP	emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller	AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA	01-08	programmable perfusion system control
unit BVC control	Vacuubrand, Wertheim, Germany	727200	化学ダイアフラムポンプME 1C;灌流システム用真空ポンプ
ImageJソフトウェア	NIH画像		NIH Imageに触発されたJava画像処理プログラム。