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方法論記事

酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ

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DOI:

10.3791/55496

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2017年3月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Wake Forest School of Medicine, 2YX Genomics, 3Department of Biology, Ball State University, 4Department of Hematology and Oncology, Roper St. Francis Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

G4 Resolvase1はG4結合タンパク質のための最も厳しい報告親和性でG-四重鎖（G4）の構造に結合し、HeLa細胞におけるG4-DNA巻き戻し活性の大部分を表しています。我々は、具体的には、触媒活性組換えG4R1を精製するための親和性およびG4-Resolvase1のATP依存性巻き戻し活性を活かした新たなプロトコルを記述します。

要約

高次核酸構造は、両方のDNAおよびRNAのグアニンリッチ領域に形成することができ、G四重鎖（G4において、G4構造）と呼ばれ、非常に熱的に安定です。そこヒトゲノム中に375,000の推定上のG4形成配列が>であり、それらは、プロモーター領域、非翻訳領域（UTR）、およびテロメア反復内で濃縮されています。このような複製および転写などの細胞プロセスに影響を与えるために、これらの構造のための潜在的に、細胞は、それらを管理するために酵素を進化してきました。 1つのこのような酵素は生化学的に我々の研究室と長嶺らが共同で特徴付けられたG4リゾルバーゼ1（G4R1）、です。そして、G4-DNAとG4-RNA（低pMの範囲内の K d）の両方に非常に強固に結合することが判明。 G4R1は、HeLa細胞溶解物中のG4分解活性の大部分の原因であるとからテロメア代謝、リンパ開発、遺伝子転写、造血および免疫監視において役割を果たすことが示唆されています。 EFする能力ficiently表現し、触媒活性G4R1がG4構造とG4分解酵素の動力学的相互作用にさらなる洞察を得ることに興味を持って研究室のために重要である浄化。ここでは、組換えG4R1（rG4R1）の精製のための詳細な方法について説明します。説明する手順は、C末端ヒスチジンタグ付き酵素の伝統的な親和性に基づく精製は、ATPで活性の高い酵素を精製するために、G4-DNAに結合し、くつろぐのにrG4R1の能力の活用でヒト・コドン最適化された細菌において発現組み込ん依存溶出工程。プロトコルはまたrG4R1の酵素活性は、G4-DNAをほどくする精製酵素の能力を調べることによって測定される品質管理ステップを含みます。この方法はまた、精製rG4R1の定量化を可能にすることが記載されています。このプロトコルの代替適応が議論されています。

概要

G4構造は、DNAやRNAのグアニンリッチ領域内に形成安定性の高い核酸の二次構造です。 G4構造は、フーグスティーン結合相互作用を介して安定化され、大幅G4構造1、2の顕著な熱安定性に貢献する一価の陽イオン（ すなわち 、K +およびNa +）と中央の空洞内に配位結合しています。初期のバイオインフォマティクス研究は、ヒトゲノムは> 375,000 "潜在的なG4形成モチーフ「3、4含まれていることを示唆しました。さらに最近の研究で推定値は、別の研究は、ヒトゲノム6の716310の異なる潜在的なG4形成配列を予測しながら、G4モチーフの数は、2-5 5倍高いことを示唆しています。 G4形成配列は、進化的に保存し、ランダムに分散されていませんゲノム。 G4のモチーフは、遺伝子コード領域に濃縮され、そしてすべての遺伝子プロモーターの40％の上方には、G4モチーフ7を含んでいます 。興味深いことに、遺伝子G4モチーフの富化の程度は、遺伝子の機能を示唆することが実証されています。例えば、開発に関与するプロトオンコジーンおよび遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子8,9よりG4構造の有意に高い濃縮度を有しています。

高い熱安定性により、ゲノム全体でほぼユビキタスプレゼンス、および大幅に主要な細胞プロセスに影響を与える可能性、細胞がこれらの構造を管理するために酵素を進化させたことを見つけるために驚くべきことではありません。 、我々はヒト（HeLa細胞）細胞10内tetramolecular G4-DNA解消活性の大部分のソースとして特徴づけ; 1つのこのような酵素はG4 Resolvase1（また、ラウとDHX36呼ばG4R1）です。それ以来、それが示されているTHAトンG4R1はしっかりと結合し、触媒G4結合タンパク質11、12、13のための最も厳しい報告KDSとtetramolecularと単分子G4-DNAとG4-RNAを巻き戻します。さらに、G4R1のG4分解活性は、テロメア/テロメラーゼ生物学11、14、15、16、転写及びスプライシング17、18、19、20、現像21、造血を含む生化学的および細胞プロセスの広い範囲に関与しています21、及び免疫調節22、23。 G4シーケンスが優勢と特異的にゲノムと多様な細胞のp全域にG4R1は最近表現し、効率的に高活性rG4R1を精製する能力は、このタンパク質の生化学的メカニズムや行動を解明するために最も重要なのだろう、と関与することが示唆されていることをrocesses。

ここでは、効率的に活性酵素を単離するためにrG4R1のATP依存性、G4分解活性を利用して新規発現および精製スキーム（ 図1）を示しています。このスキームは、酵素反応の生成物は、もはやG4R1の場合のように、結合のための基質であるため、他のATP依存性核酸酵素を精製するために適合させることができます。

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プロトコル

rG4R1の精製に使用されるG4-DNA構造の調製（ビオチン化G4-DNA G四重鎖の形成）

  1. 1マイクロモルスケールで、Z33-バイオと呼ばれる以下のDNAオリゴマーを、オーダー：5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-ビオチンを3'。ビオチン部分は、オリゴマーの3 '末端にあることを確認してください。
  2. 450 mMトリス塩酸pHが8、25 mMのEDTA、および2500のNaCl：10×G4バッファを準備します。
  3. （オリゴマー濃度は〜2.5 mMのであるように）水250μLでZ33オリゴマーを再懸濁します。 10倍G4バッファの25μLを加え、混合します。 〜48時間、50℃でオリゴマーをインキュベートします。
  4. 簡単に説明すると結露（〜千×gで、10秒）を収集するためにチューブをスピンダウン。高質量の〜50μL、（H 2 O中30％フィコール）親水性多糖類を加え、混合します。 10％アクリルアミド/ 1×TBE / 10％グリセロールゲル（：16センチメートルのx 16センチメートルのx 1ミリメートルゲルの寸法を）注ぎます。ゲルが重合されると、1×TBEおよび負荷でウェルを洗浄均等にゲルのほとんどを横切って形成されたZ33-バイオオリゴマー（サンプルレーン負荷はシュリーレン線で可視化することができます）。
    1. ゲルの端に1つのレーンでは、（これは構造化されていない対照となる）10分間98℃で加熱されたオリゴマーのごく一部だけでなく、他の中のゲルローディング色素の少量をロードレーンは、ゲルが実行されたどこまで監視します。
  5. ゲルランニングバッファーとして1×TBEを使用して、色素の先端がゲルの少なくとも1/3横断したまで、120 Vでゲルを実行します。
  6. シートプロテクターにその粗い側面を上にして薄層クロマトグラフィープレートを置きます（またはラップでカバーし）。ガラス板の1つを削除して、シートプロテクターの表面にゲルを移します。頭上の照明やUVシャドウゲル（：365nmの長波長）をオフにします。融液からの相対（遅い移動度を有する）ゲル中に高いアップを実行していると見される、新鮮なカミソリの刃を使用し、G-四重鎖-Z33-バイオバンドを切り出し、エド・コントロール。
  7. 50 mLチューブに形成されたG4-DNAを含むゲルスライスを配置し、ゲルスライスをカバーするだけの十分な浸漬バッファを追加（浸漬バッファが1/3の体積の10倍TBE、1/3ボリューム飽和酢酸ナトリウム、および1/3で構成されていボリュームH 2 O）。 37℃のインキュベーター（無加湿）にチューブを置き、O / Nインキュベートします。
  8. 15mLのチューブに溶液を移し、（10 mMトリス塩酸pHが8、2.5mMのEDTA液pH 8、および0.05％アジ化ナトリウム中の20mg / mLのグリコーゲン株）1/10体積のグリコーゲンを追加して、〜1.2倍の体積のイソプロパノール。
    注：アジ化ナトリウムは急性毒性があるので、注意して使用します！
    1. 少なくとも2時間、-20℃でチューブを混合し、配置します。卓上遠心機で2700×gでチューブをスピン12分間、4℃に冷却しました。静かにペレット化G4-DNAからの溶液をデカントします。 70％のエタノール+ 50mMのNaCl（洗浄中の塩は、G4の安定性にとって重要である）でペレットを3回洗浄します。リントフリーティッシュペーパーで余分な液体を吸い上げます。
  9. 場所少なくとも2時間冷蔵庫で洗浄したペレットは、ペレットを水和し、簡単に再懸濁を可能にします。 TNE緩衝液の50μL（10 mMトリス - 塩酸pHが8、50mMのNaCl、および0.05 mMのEDTA pHが8）にペレットを再懸濁します。
  10. H 2 Oの495μLに、この形成されたDNA G-四重鎖の5μLを配置して吸光係数は、オリゴマーのヌクレオチド組成を入力することによって決定することができる分光光度計（Z33 DNAオリゴマーの吸光係数を使用して定量化しますA = 8の塩基組成、C = 3、G = 15、T = 7）は、341946 L /モル/ cmです。形成されたG-DNAの四重鎖4ストランドで構成されていたように、25（いない100）として希釈係数を入力します。
  11. -20℃でチューブや店舗当たり3のOD（OD 260単位）の体積相当を等分。 H 2 Oの495μLに添加し、5μLが3のOD 260読み取りを与えた場合、例えば、その後、5μLのアリコートを準備します。

rG4R1の酵素活性アッセイ（TAMRA標識G4-DNAの形成）に使用されるG4-DNA構造の調製

  1. 1マイクロモルスケールで、Z33-TAMと呼ばれる以下のDNAオリゴマーを、オーダー：5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'。 TAMRA部分はオリゴマーの5 '末端にあることを確認してください。
  2. テトラメチルローダミン（TAMRA）がG-四重鎖は、肉眼で容易に見えるようになります標識ので、G-四重鎖を形成するための第1節で概説したように、その紫外線を除いて、同じ手順を実行します（UV）シャドウイングは必要ありません。この場合も、ゲル上で溶融したコントロールを含めるようにしてください。
  3. ステップ1のように、TAMRA標識DNA G-四重鎖の分光光度計の読みを取った後、TNE緩衝液で0.2ピコモル/μLに形成されたG-四重鎖を希釈。最後に、-20℃で10％の最終濃度とストアにグリセロールを追加します。

3. PTRとpLysSをコンピテントセル（DE3）を形質転換iEx4-DHX36（プラスミドコードするヒトG4R1）と大規模細菌培養物を誘導する/グロウ

  1. TriEx4-DHX36プラスミドを取得します。
  2. 20μLアリコートに細菌を等分し、-80℃で保管してください。 SOC培地のアリコート（2％トリプトン、0.5％酵母エキス、10mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム、10mMのMgCl 2を、10mMの硫酸マグネシウム、および20mMグルコース）を-80℃で80μLのアリコートへと格納します。
  3. カルベニシリン（CARB）/クロラムフェニコール（CAM）LB寒天プレートを準備します。 CARB及びCAMのストック濃度である50 mg / mlでH 2 Oおよび35ミリグラム/ EtOHを、それぞれ、これらは1,000倍に濃縮されている70％ミリリットル。従って、LB寒天選択プレート中の最終濃度は、それぞれ、50μg/ mlの35 / mlのです。
  4. 氷の上の細菌の1アリコートを置き、室温でのSOC培地の1アリコートを配置します。細菌にpTriEx4-DHX36プラスミド1μgのを追加し、混合するピペットチップで穏やかに渦巻きます。 42＆＃で、さらにその後5分および熱ショック氷上でインキュベート176; 30秒のためのC。 2分間氷上に置き、SOC培地を追加します。
  5. プレート予熱選択プレート上で形質転換された細菌（典型的には、5と少量プレート - 単一コロニーを容易に大型の培養に接種することができるように、低コロニー密度を確保するために、10μL）を、37°C​​O / Nでインキュベートします。
  6. 製造元の指示24に従ってテリフィックブロスを準備します。大きなフラスコ当たり500ミリリットルを行い、短い液体サイクルでオートクレーブ（グリセロールを追加してください）。
  7. CARB / CAMは、ブロスに（50μg/ mlの/35μgの/ mL）を追加した後、培養液に単一の細菌コロニーとピペッティングを含む（P1000ピペットを使用して）プラグ寒天取ることによって、培養液を接種します。それらを曝気した後、振とうせずに37°CO / Nで培養物をインキュベートする精力的に文化を渦巻。
  8. 次の日は、37℃のシェーカーで培養液を置き、〜225rpmで振とうします。 OD 600が約0.4になるまでの文化を育てます-初期の細胞密度に依存して、6時間 - 典型的には約4を取る0.6。
    注：これは、分光光度測定値を介して、定期的な密度の監視が必要になりますし、0.5のODの上くらいに文化を成長しないことが重要です。分光光度測定値のためのブランクとして、細菌の1ミリリットルをスピンダウンし、ブランク液として清澄化したブロスを使用します。
  9. 適切なOD 600が得られると、すぐに氷上に培養を置き、すぐに10℃にして冷却します。 70％エタノールで拭い温度計を使用して温度を監視します。これは、組換えタンパク質の誘導に先立って、さらに細菌の増殖を制限するよう、迅速に氷の上ながら、フラスコを回転させて冷却を早めます。
  10. 1 mMの最終濃度（〜120ミリグラム/ 500 mLの培養液）にIPTGを追加し、〜17のために14℃で80 rpmで振とう - 18時間。タンパク質の誘導のための理想的な温度は14℃であることが見出されています。最良これを達成するために、冷却された水浴シェーカーLOCを使用従来の低温室でated、手動で温度計を備えた水浴の温度を確認してください。
    注：それで温度計の水のフラスコをインキュベートし、80 rpmで振とうすることによりデジタル設定温度設定が所望の液体の温度（テストこれが得られるかをテストする必要があるが別の方法として、空冷式シェーカー/インキュベーターを使用数時間）14°Cに達するまで、それに応じて設定するデジタル温度を調整します。
  11. 氷の上の文化を置き、ステップ3.9のように、すぐにそれらを冷却します。細菌の少量を取り、OD 600の測定値を読み取ります。 1.2 OD 600 -理想的には、培養物は、約0.8に誘導中倍増しているだろう。
  12. 500 mL遠心管に細菌を移し、手動で管の間の重量を均等にする細菌培養物を使用して、それらのバランスをとります。バランスの取れた後、4℃で20分間、3840×gで、それらを遠心分離します。清澄化したブロスを捨て、細菌のペルを凍結タンパク質精製するまで-80℃でます。

人間rG4R1の4精製

  1. 細菌ペレットを解凍し、溶解します。
    1. （TN緩衝液は100 mMトリスpHを7.5及び50mMのNaClからなる）を室温でTN緩衝液3mlに細菌ペレットを解凍。手と解凍するスワールでボトルをホールド/細菌ペレットを再懸濁します。一度解凍し、比較的均一に懸濁させ、（5 mLのピペットでピペッティングを介して、およびダウン達成することができ、さらにサスペンション）TN緩衝液で5ミリリットルまでのボリュームをもたらします。
      注：精製手順と快適のユーザーのレベルに応じて、準備の日に/準備2または4のいずれかのボトルを解凍するのが一般的です。
    2. （培養あたり）H 2 Oの250μLにリゾチーム20mgを溶解し、再懸濁した細菌に追加します。手に瓶を旋回しながら10分 - リゾチーム〜5のために細菌を消化することができます。
      注：SUSの色年金は消化が進むにつれて少し明るくし始めるであろう、とサスペンションは、比較的非粘性となります。培養物があまりにも過剰成長（ すなわち、非常に大きい1.2 OD 600以上）である場合、細菌DNAは、この段階で、望ましくない粘度を引き起こす可能性がある染色体。
    3. プロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）およびロイペプチンの1 10μLを250μLを追加します。完全に混合。
    4. 氷の上に置き、冷たいTN緩衝液とBMEの22μLの10ミリリットルを追加。 50 mLチューブに移します。
    5. 30％の振幅に設定されたデジタル超音波処理器で氷の上の細菌を超音波処理します。 ON 2秒と1分2秒OFFのパルス。サンプルを超音波処理工程の間に少なくとも2分間氷上で冷却し、超音波処理を3回繰り返します。
      注：複数の文化では、超音波処理の反復を繰り返す前に順番にそれぞれ1を超音波処理します。超音波処理の間に、十分に細菌溶解物中に沈め超音波処理チップを保つように注意してください、しかし、目に触れていませんこのよう管の電子側は、余分な熱を生成します。
    6. 冷たい4倍SSCロイペプチンのPIC + 1アリコートの+ 20μLBME + 50μLの等量の（15ミリリットル）を加え、混合します。
    7. 卓上遠心機で4℃に予冷し、20分間2300×gで溶解物を遠心分離します。新鮮、予め冷却した50 mLチューブに上清を移し（大型培養あたり1管が準備されています）。
  2. G4-磁気ビーズを準備します。
    1. ストレプトアビジン常磁性ビーズを1mL（SPB）サスペンション（1 Lあたりの文化）を取り、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。磁石でSPBをペレット化し、2×SSC + 5 mMのEDTA pH8の再懸濁ビーズを洗浄するために使用したのと同じ溶液200μLで洗浄しSPBで2回洗います。
    2. SPB懸濁液にG4-DNA（セクション1で調製したZ33-バイオG4）の1 3 ODアリコートを追加して、上下に数回ピペッティングにより素早く混ぜます。回転子にチューブを置き、（60分まで）、少なくとも30分間、室温で回転します。
    3. アフトえー回転のこの期間は、0.4％ラクトアルブミンの1ミリリットルを追加することにより、G4に結合したSPBをブロックし、そして必要になるまで氷上に保ちます。 1×トリス - グリシンを用いて、4％のラクトアルブミンストックから0.4％ラクトアルブミンを希釈します。
      注：在庫4％のラクトアルブミンは、（w / v）の最初に1X PIC、および0.05％アジ化ナトリウムをさらに添加して、2 MグリシンpH7.5中に溶解することによって調製されます。
  3. バインドヒスチジンタグrG4R1コバルトビーズ（CB）に（ステップ4.1からの続き）。
    1. 明らかに細菌溶解物を含む各50mLのチューブに（0.5 mLのビーズ容量に相当）CBスラリーの1 mLを加え。ローテーター上でRTで20分間インキュベートします。
      注：0.5 mLのビーズ容量が明らかになった溶解物1L当たり使用されます。細菌培養物が用意されている2 500 mLの場合に、第2の培養物からの溶解物を連続STにCBの同じ0.5 mLでバインドされるように、例えば 、のみ、この時点での文化の1から明らかな溶解液を含む50 mLチューブにCBを追加EP 4.3.3）。
    2. 4℃の卓上遠心機で5分間、110×gでCBをスピンダウン。慎重に液体を吸引し、ペレット化したCBを乱さないように、液体のカップルmLのままにしておきます。冷たい4×SSC + BME（4×SSCのBME / mLを0.5μL）の15 mLの - 10で洗浄します。
      注：洗浄のために、ピペッティングはピペットとタンパク質の内部に立ち往生するビーズが失われる原因になりますように、代わりにピペッティングのペレット化コバルトビーズ上に直接10〜15ミリリットルを注ぎます。
    3. 遠心分離により再びCBをペレット化した後、ペレット化したCBの上に（2 回目の大きな誘発される細菌培養物を表す、30ミリリットル）を次の清澄化ライセートを注ぎます。ローテーター上で室温でさらに20分間インキュベートし、次に4×SSC + BMEの10〜15 mLで二回洗浄します。 4℃で5分間、110×gでペレット。
    4. 2回目の洗浄の後、液体を吸引し、チューブの底にビーズ/液体約2mLを残します。によって予め冷却2 mLチューブにタンパク質結合CBを転送1 mLの「ワイドボア「ピペットチップを使用しました。
      注：この「広口径「ピペットチップの使用は、タンパク質結合コバルトビーズの損失を低減するように、転送する前にチップの先端をカットするために、新鮮なカミソリの刃を使用してください。
    5. （ - すべてが迅速にペレット化のために必要である10秒〜5）簡単に言うと4℃で微量に高速（〜18,000 XG）で2 mLチューブ中のビーズを遠心してください。静かタンパク質結合CBを失わないように注意しながら、ピペットで上清を除去し、廃棄します。
  4. CBからの溶出rG4R1。
    1. 寒い部屋で5分間ローテーター上のヒスチジンの溶出緩衝液（HEB）の0.5 mLのCBをインキュベートします。 HEBを追加するときに、再び、ちょうど（CB損失を排除するために）ビーズ上に0.5 mLのをピペット、チューブを反転させることにより、ビーズを再懸濁します。 HEB 0.7 M L-ヒスチジンのpHが6（pHは酢酸を用いて調整されている）です。
    2. 1分間の4℃のマイクロ遠心で18000×gで遠心分離します。上清を移し予め冷却した15 mLチューブに。優しく除去し、CBの上に少量の液体を残して、慎重にピペッティングすることにより、タンパク質含有上清を移します。
    3. 繰り返しは3 HEBの溶出の合計4.4.1と4.4.2を繰り返します。
    4. 0.2 M EDTA pHが6.0で一回溶出; EDTAは、コバルトをキレートとしてCBの色は白にピンクに変わります。
    5. この第四の、最終的な溶出を15 mLチューブに転送された後、1mLのピペットチップの先端でのゲルローディングチップを用いて、CBからの残留溶出緩衝液をピペット。チューブの底部に先端を沈めることによって、残余タンパク質を含む溶出緩衝液を回収することができます。
  5. G4結合SPBにrG4R1をバインドし、ATP依存的に組換え酵素を溶出させます。
    1. 250 mMトリス酢酸のpHは7.8、250 mMのNaClを、2.5のMgCl 2、及び50％グリセロール：5倍RESバッファを準備します。 3倍RESバッファを準備します：H 2 O、2 mLの5倍のRESバッファー、0.4％ラクトアルブミンの0.33ミリリットル（Dの0.915 mLの1×トリス-グリシン4％のラクトアルブミンからiluted）、BMEの0.010ミリリットル、1 MのMgCl 2の0.015 mLを、PICの0.050ミリリットル、およびロイペプチンの0.010 mLです。氷の上に保管してください。
      注：在庫4％のラクトアルブミンは、（w / v）の最初に1X PIC、および0.05％アジ化ナトリウムをさらに添加して、2 MグリシンpH7.5中に溶解することによって調製されます。
    2. ペレットマグネット付チューブの側面にG4-SPBと（ステップ4.2で調製した、G4-SPB）上清を捨てます。混合するG4-SPBとピペットに3倍RES緩衝液1mlを追加します。
    3. （ステップ4.4からの溶出液）タンパク質含有HEB / EDTAの〜2 mLを含む15 mLのチューブに3倍RESバッファーに懸濁G4-SPBのこの1ミリリットルをピペット。ビーズが沈降しないように時々攪拌しながら37℃の水浴中で15分間インキュベートします。
    4. 氷の上に、磁石をチューブの側面にタンパク質結合G4-SPBをペレット化。洗浄するために、ビーズを再懸濁するために4×SSC + 0.4％ラクトアルブミン（+ 0.5μL/ mLのBME）とピペットの1 mLを加え。トンとペレットビーズ彼は氷の上に磁石。 2回の洗浄の合計のためにこの洗浄を繰り返します。
      注：忍耐は磁気ビーズの全てが洗浄の間にペレット化されていることを確認するために、洗浄操作中に必要とされます。これは、RESバッファに含まれるグリセロールに起因する液の粘度が増加与えられた特にそうです。
    5. 3倍RESバッファー1mLでG4-SPB 1Xを洗ってください。
    6. 3倍RES緩衝液0.5ml、0.1 M ATPを0.1mL、およびH 2 Oの0.4ミリリットル：溶出バッファー（EB）を準備
    7. 37℃に設定したサーマルサイクラーの加熱ブロックに分散さPCRチューブ中37℃までEBのプレ暖かい1ミリリットル。
    8. 氷の上で磁石とペレットG4-SPBと予め温めておいたEBの100μLでビーズを再懸濁します。すぐ予熱したPCRチューブにビーズを移し、37℃で30秒間インキュベートします。
    9. 30回 - 速やかに積極的にダウン20を5 M NaClおよびピペットアップの12μLを追加します。 EBに含まれる高塩とATPの組合せG4-ビーズからrG4R1を溶出するのに役立ちます。
      注：これは、気泡がタンパク質を変性させることができるように、分注工程の間に形成される気泡の数を最小限にするために非常に重要です。
    10. すぐに磁石をG4-SPBをペレット化し、（日付で標識した）氷上で新鮮なPCRチューブにタンパク質含有溶出液を移します。
    11. ステップ4.5.8-4.5.10に記載溶出し、転送を繰り返します。このプロセスの最終製品は、このようにして精製rG4R1を含むEBの〜200μLです。高活性rG4R1が実際に精製されているかどうかをテストします品質管理酵素活性アッセイでの使用のために確保（適切な日付で標識されたPCRチューブ内の）2 7μLアリコートを設定します。
    12. 活性アッセイの時まで-80℃で精製rG4R1を保管してください。

精製rG4R1の5.品質管理酵素活性アッセイ

  1. rG4R1の各製剤をアッセイするために、300μLを準備各30μL（ステップ2で調製）TAMRA標識Z33のG4-DNAの0.2ピコモルが含まれているリゾルバアッセイバッファー（RAB）、の。次のようにRABの構成は次のとおりです。6 PCRのストリップで3倍RESバッファの0.1 mLを、0.2ピコモル/μLG4-Z33-TAMの0.01ミリリットル、0.1 M ATPの0.03ミリリットル、およびH 2 Oの0.16ミリリットルチューブ、ピペット最初のチューブにRABの40μL、残りのチューブにRABの30μL（この時点では、氷上でチューブを保持）。
  2. （ステップ4.5.11から）7μLrG4R1アリコートの1を取得し、氷の上に置きます。 5μLに設定P20ピペットで、穏やかにアップピペット、数回上下6 PCRチューブ（RABの40μLを含むもの）のストリップの第1の管にアリコートし、転送中に5μLをrG4R1を混合します。次に、10μLにピペットを設定し、シリアルRABを含む残りのPCRチューブに10μLを移します。
  3. すぐに4°Cホールドが続くサーマルサイクラー中で30分間、37℃でPCRチューブのこのストリップをインキュベートします。それらは4℃に保持されている間にチューブを開き、各チューブに0.5 M EDTAのpHが8の2μLを加える（酵素反応を停止します）。
  4. 10％アクリルアミド/ 1×TBE / 10％グリセロールゲルを注ぎます。コームを除去した後、1×TBEでウェルを洗浄します。 （井戸の負荷が再びシュリーレンラインを使用して観察することができる）を各チューブから15μLをそれぞれのチューブに高質量の5μL、（H 2 O中30％フィコール）親水性多糖類を追加し、負荷。
    1. G4-DNAのモビリティのための対照として、4高質量のμL、20μLのRABに親水性多糖類、及び負荷15μLを追加します。 10分間98℃でRABの巻き戻さ単量Z33、熱20μLのコントロールとして、高質量、親水性多糖類、及び負荷15μLの4μLを追加します。
  5. ランニングバッファーとして1×TBEで2時間、120 Vでゲルを実行します。画像TAMRA-特定のフィルタを用いた蛍光イメージング機能を備えたマルチモーダルイメージャ上のゲルは、（532nmの緑色レーザーで励起し、58を使用します0 nm帯は30フィルタ（580 BP 30））を通過します。
    注： 図2に示すようにrG4R1の高度に活性な製剤は、ゲルにロードした最初の3レーンでTAMRA標識Z33の完全な解像度が得られます。

高活性rG4R1プレップ、分注、およびストレージの6プーリング

注 ：この手順は、2人が必要です。数および精製rG4R1がで使用される下流アッセイの酵素的要件は、前等分に必要とされているどのように多くの準備を決定します。典型的な大規模な準備は8高活性製剤（したがって、16誘導される500 mLの細菌培養物の合計を使用して）のプールで構成されていますが、これは任意の数であり、実験室固有です。

  1. 分注しされる高活性、精製されたrG4R1の総容量を計算します。典型的には、7μLアリコートを、下流アッセイにおいて使用されています。熱CYCLのブロックを埋めますER（ブロックの固体性質は、PCRストリップの迅速な閉鎖を促進しますように、これらは、に等分されます）ストリップPCRチューブに4℃に設定してください。
  2. -80℃から高活性rG4R1を含むPCRチューブを取り出し、すぐに手にチューブを解凍。少量の氷がチューブ内に放置した場合、チューブを氷上に置きます。予冷、15 mLのチューブに迅速に融解した製剤のすべてを組み合わせて、気泡を最小限に抑えるために確認して、よく混ぜます。
  3. 自動繰り返しピペットを用いて、サーマルサイクラー中で予め冷却PCRストリップチューブに希望のアリコート量を分注します。すぐに1として - 2ストリップが完了し、二人は蓋を閉じて（フラッシュ凍結は、酵素活性を維持するために必要である）、液体窒素中に浮遊している96ウェルウェーハに転送する必要があります。
    注：酵素は4になっていない時間を短縮する時に自動ピペットの先端にrG4R1の約200μL以上服用しないでください°C。
  4. サーマルサイクラーで予冷PCRストリップチューブは、アリコートで満たされ、適切に凍結されたら、すぐにサーマルサイクラーに氷からより多くの予備冷却PCRストリップチューブを転送し、小分けを続けます。酵素の残りを等分されるまでこのように続けてフラッシュを液体窒素中で凍結し、ドライアイスに移しました。最後に、長期保存のために-80℃に一定分量を転送します。

7.定量精製rG4R1濃度の

  1. タンパク質分離のための5％スタッキング/ 12標準％解決アクリルアミド/ SDSゲルを注ぎます。
  2. 等分rG4R1の約50μLを解凍し、1チューブに結合し、よく混ぜます。 （pHは6.8、26.3％（w / v）のグリセロール、2.1％SDS、0.02％ブロモフェノールブルー65.8 mMトリス塩酸）+ BME（50μLをピペットで正確な量を測定し、2×Laemmliサンプル緩衝液の等量を追加/ 2×Laemmli緩衝液の950μL）。 10分間98℃でタンパク質を変性させます。
    3. は、以下のタンパク質の量を標準としてゲルにロードすることができるように、1×サンプルバッファー+ BMEに広い範囲MWマーカーの希釈液を調製します。
    注：広範囲MWマーカーに含まれる各タンパク質標準は、0.3μgの/μLで存在する50 kDaの蛋白質を除いて、0.1μgの/μLで存在します。これらのマーカーは、熱変性である必要はありません。
  3. ゲルからコームを外し、標準の1×SDS /グリシンランニングバッファーでウェルを洗浄します。酵素製剤の濃度は、例えば （35異なりますようにロードする酵素の最適量は、ユーザによって決定されるべきであるが、（変性タンパク質の50および25μLである）rG4R1の25と12.5μLと同等のものを読み込みますμL、 図3）でゲルにロードしました。ステップ7.3で調製されたタンパク質標準をロードします。ピペットが適切に較正されていることを確認し、possibほど正確であるようにしてくださいルピペッティング技術と正確な定量を確保するために。
  4. 色素の先端が約2/3ゲルのを横断したまで（広範囲MWマーカーを構成するタンパク質の適切な分離を確実にするために）120 Vでゲルを実行します。
  5. ゲルを外し、かみそりの刃でそれを離れて切断することによりタンパク質を含まないゲルの一部を処分します。ガラスキャセロール皿または同等の容器にゲルを置きます。室温でO / Nクマシー色素（：酢酸ろ紙漏斗を通して濾過されたH 2 OクーマシーR-250 50:10:40（v / v）のメタノール100mLあたりの50 mg）を用いてゲルを染色ゲルの十分な攪拌を確保するために設定オービタルシェーカー上。
  6. 酢酸：H 2 O脱色を促進するために丸めアップ、リントフリーティッシュペーパーを使用して30:10:60（v / v）のメタノールでゲルを脱染色します。必要に応じて、脱色液を変更します。背景がrG4R1とタンパク質標準を視覚化するのに十分に低くなるまで脱色続けます。この時の典型的なゲルステージは、 図3に示されています。
  7. シートプロテクターの間に脱色したゲルを置き、≥300dpiの解像度でゲルをスキャンします。画像解析ソフトウェアプログラムでスキャンした画像を（例えば富士Multiguageまたは同等）を開き、75、100に対応するタンパク質標準から標準曲線を作成し、150 kDaの（曲線はデンシトメトリー測定値対グラムの量を表します）。濃度測定値を得るためのプロセスの間に定量化されている各レーンからバックグラウンドを減算することを確認します。
  8. ゲルにロードしたrG4R1の体積量は、これらの標準曲線の直線範囲内にあるタンパク質の量を含有すると仮定すると、rG4R1のマイクロリットル当たりのタンパク質のグラム量を外挿することができるロード。
  9. 12万グラム/モルであるG4R1、の分子量を用いてモル量にrG4R1の外挿しグラム量に変換します。
    注：各ゲルについて、3外挿した値になります（75、100、および150 kDaの標準曲線を生成するために使用される3つのタンパク質マーカーの各々について1つ）を生成。さらに2つのゲルおよび染色を実行し、手順7.1繰り返すことによって、それらを定量化 - 7.10。最初のゲルのための定量の結果を、ユーザがrG4R1タンパク質スタンダードの線形範囲内の量を得るためにさらにゲルにロードする必要がどのくらい測ることができるようになります。要するに、高活性、精製されたrG4R1の濃度を表す9つの値を外挿する。 20〜100nmの範囲、典型的には最終バッチ固有rG4R1濃度を与えるためにこれらの値を平均します。これらの値からの標準偏差を計算した（n = 9）。

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結果

このプロトコル（ 図1）は、日常的にほぼ純粋な、触媒活性rG4R1をもたらします。 rG4R1 0.013μLの範囲（ 図上に概説G4活性アッセイによってアッセイし、 - TAMRA標識tetramolecular G4-DNAの0.2ピコモルの50％が0.2の範囲内の単量体に変換される酵素活性の尺度として、それは、典型的に観察され2）。精製rG4R1のクマシー染色は、G4-DNAビーズを結合し、ATP依存性に溶出するために、その能力を維持していることrG4R1を切り捨てとなることができる〜75kDaの、でマイナー汚染バンドで、予想される120 kDaのサイズで単一のバンドを示し、方法（ 図3）。目的のバンドは、タンパク質標準曲線に対して定量化、およびこのプロトコルは、一般的に、細菌培養物1リットルあたり20から100 nMの精製酵素の200μLを取得しています。

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ディスカッション

このプロトコルは、DHX36遺伝子産物、G4-Resolvase1（またラウとDHX36呼ばG4R1）（ 図1）を単離するための非常に効率的な発現、精製、および定量化スキームを表します。 G4-DNA複合化ビーズ上のHisタグの親和性コバルト親和性ビーズ上での精製と酵素精製：このプロトコルは、2つの精製工程を利用しています。後者のステップは、それがrG4R1はG4構造に持っているタイトな親和性、高特異性、および触媒巻き戻し活性を活用するという点で独特です。 G4構造のためのタイトな親和性（低pMの範囲のK d）は大幅に非特異的なタンパク質の存在を減少させる、G4のビーズから溶出前に（塩化ナトリウムの溶解度限界に近い）高塩洗浄を可能にします。 G4構造上G4R1の触媒活性は、ATPおよびMgCl 2の添加時にアクティブrG4R1の特定の溶出を可能にします。この二段階精製スキームが一貫して高純度の生成しますほとんどの生化学分析に適した量でrG4R1 13、触媒活性。

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開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

我々は（PJS）は寛大（JPVに）陶器財団からの贈り物、（PJSへ）HealthGrant T32-CA079448の国立研究所、およびボール州立大学のスタートアップ資金を含め、当社の資金源に感謝したいと思います。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
TriEx4-DHX36 プラスミドAddgene68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cellsNovagen71403-4
S.O.C mediumThermo Fisher Scientific15544034 
Difco Terrific BrothBecton Dickinson243820
グリセロールSigma-AldrichG5516
ChloramphenicolSigma-AldrichC191935 & micro;細菌プレート/大型培養物中のg / mLカル
ベニシリン(植物細胞培養試験済み)Sigma-AldrichC341650 µ細菌プレート/大規模培養物中のg / mL
イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)Sigma-AldrichI6758
リゾチーム(鶏卵白由来)Sigma-AldrichL6876
1 M Tris-HCl, pH 8Universal Scientific Supply Co. 1963-Bまたは標準供給源
1 M Tris-HCl、pH 7Universal Scientific Supply Co. 1966年または標準源から
1.5 M Tris-HCl、pH 8.8キャスティング分離ゲル用(タンパク質定量ゲル用);標準供給源から
1 M Tris-HCl、pH 6.8スタッキングゲルのキャスティング用(タンパク質定量ゲル用)。標準供給源
1 Mトリスアセテート、pH 7.8Universal Scientific Supply Co. 1981年または標準供給源から
70%エタノール標準供給源から
塩化マグネシウム (1 M solution)Life TechnologiesAM9530G
塩化ナトリウムSigma-AldrichS7653
酢酸ナトリウムSigma-AldrichS8750
20x SSCUniversal Scientific Supply Co. 1665または標準供給源
からβ-メルカプトエタノール(2-BME)Sigma-Aldrich63689
テアーゼ阻害剤カクテルSigma-AldrichP8849
ペプチン半硫酸塩Sigma-AldrichL8511
レプトアビジン常磁性ビーズPromegaZ5482
0.5 M EDTA、pH 8 ユニバーサル・サイエンティフィック・サプライ株式会社 0718または標準供給源
0.2 M EDTA、pH 6Universal Scientific Supply Co. 標準的な供給源から;最初にNaOHでpHを調整し、次にHClでpHを下げます。  
A-ラクトアルブミン(ウシ乳由来1型)Sigma-AldrichL5385
コバルト金属アフィニティービーズClonetech635502
L-ヒスチジンSigma-AldrichH8000
酢酸、氷フィッシャーサイエンティフィックA38-500
アデノシン5'-三リン酸(細菌源由来)SigmaA7699
40% アクリルアミド/ビス溶液 (37.5:1)Biorad161-0148
GlycineSigma-Aldrich50046でタンパク質ゲルランニングバッファー (192 mM グリシン、25 mM トリス塩基、0.1% SDS)
10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)Universal Scientific Supply Co. 1667タンパク質ゲルランニングバッファー (192 mM グリシン、25 mM トリス塩基、0.1% SDS) を調製するか、または標準供給源
10x TBE Sigma-Aldrich、標準供給源
TrisベースであるFisher ScientificBP152-1タンパク質ゲルランニングバッファー(192 mMグリシン、25 mMトリスベース、0.1%SDS)を調製します。標準供給源
から TEMEDSigma-Aldrich411019
過硫酸アンモニウム (APS)Sigma-AldrichA3678
広範囲タンパク質 MW マーカーPromegaV8491
ビオチン化 Z33 オリゴ ("Z33-Bio")オリゴ Etc5'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-ビオチン 3'
TAMRA-Z33オリゴ("Z33-TAM")オリゴなど5'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'
フッ素コーティングTLCプレートライフテクノロジーAM10110
FicollSigma-AldrichF263730% in H2O
Coomassie R-250Sigma-Aldrich27816
メタノールFisher ScientificA412
マルチバンドUVランプ365nm
でUV光を放射可能卓上遠心分離機(スイングバケットローター付き)4°Cまで冷却可能。C
マイクロ遠心分離機4°Cに冷却可能。C
デジタル SonfierBransonまたは超音波処理パルスを送達できる同等品 (30% 振幅、2 秒 ON/2 秒 OFF)
50 °CウォーターバスZ33を4重37°Cに形成するため
。CインRosetta2 E. coliの大規模な培養物の細菌の形質転換および初期一晩成長に、TriEx4-DHX36
37 °C/14 °Rosetta2E. coliの大きい文化の成長そして蛋白質の誘導のための細菌のための TriEx4-DHX36
光度計; 塩基配列(Biorad SmartSpec 3000のような)に基づいてオリゴマーの集中を読める
計標準的な源
のPCRストリップの管標準ソースから
15 mL および 50 mL 遠心チューブ (ポリプロピレン)標準ソースから
微量遠心チューブ (2.0 mL)標準ソースから
500 mL 遠心分離ボトル (ポリプロピレン)Thermo Scientific3141-0500
ピペットチップおよび血清学的ピペットソースから
ゲルローディングのヒント標準ソースから
自動繰り返しピペットrG4R1の迅速な分注に。標準ソースから
サーマルサイクラー標準ソースから
液体窒素標準ソースから
ドライアイス標準ソースから
Laemlli サンプルバッファー Biorad161-0737
大型スラブゲルを実行するための装置BioradProtean II xiセル装置を使用しています
Lambda(現在はThermo Fisher Scientificブランド)の磁石を使用しています。そして、LifeもThermoの子会社であるため、ここにリストされている磁石は適切な交換
用カミソリの刃である必要があります標準ソースから
濾紙と漏斗標準ソースから
ガラスキャセロール皿標準ソースから
オービタルシェーカー標準ソースから
キワイプ標準ソースから
クリアシートプロテクター標準ソースから
スキャナーおよび関連TWAINソフトウェア標準ソースから
Fuji Multiguageなどの画像解析ソフトウェア
Microsoft Excelまたは同等のもの 
プロロイスト河 はのを11666703001または標準供給源から使用して、ズ キュベーター OD600 を読むことができる分光 温度からの標準配列 標準 私たちは、Biorad Magnet Life Technologies 12301Dの One 、または同等の

参考文献

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