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方法論記事

定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

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DOI:

10.3791/55505

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2017年6月27日

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1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

この記事について

サマリー

ここでは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ラット腹膜におけるマイクロRNA発現の検出のためのプロトコールを提示する。この方法は、いくつかの病理学的状態におけるラット腹膜におけるマイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。

要約

マイクロRNA（miRNA）は、転写後にメッセンジャーRNAの発現を調節する小さな非コードRNAです。 miRNA発現プロファイルは、ラットの様々な器官および組織において研究されている。しかしながら、miRNAの精製およびラット腹膜におけるそれらの発現の検出のための標準的な方法は十分に確立されていない。我々は、ラット腹膜における定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を用いて、miRNAを精製および定量するための効果的かつ信頼できる方法を開発した。このプロトコルは、4つのステップからなる：1）腹膜試料の精製; 2）腹膜試料からのmiRNAを含む全RNAの精製; 3）cDNAを産生するためのmiRNAの逆転写;および4）miRNA発現を検出するためのqRT-PCR。このプロトコールを用いて、6つのmiRNA（miRNA-142-3p、miRNA-21-5p、miRNA-221-3p、miRNA-223-3p、miRNA-327、およびmiRNA-34a-5p）の発現が増加したラット腹膜線維症モデルの腹膜が対照群に比べて有意に高かった。このプロトコルは、多くの病的状態におけるラットの腹膜におけるmiRNA発現のプロファイルを研究するために使用することができる。

概要

マイクロRNA（miRNA）は、メッセンジャーRNA（mRNA）発現を転写後調節する短い非コーディングRNAです。 miRNAの発現の変化は、癌、炎症、代謝障害、および線維症2,3,4,5,6,7,8を含む様々な病理学的状態において重要な役割を果たす多くのmRNAの発現を調節する。したがって、miRNAは、新規バイオマーカーおよび治療標的2,3,4,5,6,7,8として潜在的可能性を有する。 miRNA発現プロファイルは、様々なラットにおいて決定されている肝臓、心臓、肺、および腎臓を含む器官および組織9 。しかしながら、ラット腹膜におけるmiRNAの精製および検出のための標準的方法は十分に確立されていない。

このプロトコールの全体的な目標は、ラット腹膜中のmiRNAを首尾よく精製および検出することである。最初に、腹膜試料をガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、続いて微量遠心分離機スピンカラム10内のバイオポリマー - 細断システムに曝露した。次に、シリカ膜を用いたスピンカラム10を用いて、腹膜試料からmiRNAを含む全RNAを精製した。次に、逆転写酵素、ポリ（A）ポリメラーゼ、oligo-dTプライマー11を用いて精製トータルRNAからcDNAを合成した。最後に、挿入色素11を用いてqRT-PCRによりmiRNAの発現を決定した。このプロトコルの理論的根拠はbこれまでの研究では、単純なプロセスでmiRNAの組織内での有意な精製および検出が示された8,10,11。ミクロ遠心分離スピンカラムとシリカ膜ベースのスピンカラムでのバイオポリマー粉砕システムの使用は、組織からの高品質の全RNAを精製できることが報告されています10 。逆転写酵素、ポリ（A）ポリメラーゼ、オリゴdTプライマーを用いた精製トータルRNAからcDNAを合成する方法、およびインターカレーティング色素を用いたqRT-PCRによるmiRNA発現の検出法は、感度11 。さらに、これは簡単なプロセスであり、時間を節約し、技術的なエラーを防止します。したがって、このプロトコルは、広範囲の病理学的状態におけるラット腹膜におけるmiRNAの高精度かつ高感度な検出を必要とする研究において有用である。

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プロトコル

全ての動物実験プロトコールは、Jichi Medical Universityの動物倫理委員会によって承認され、実験動物のためのJichi Medical University GuideのExperimental Animals Use and Care of Experimental Animalsガイドラインに従って行われた。

1.腹膜試料採取

  1. イソフルラン、コルクシート、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を入れたペトリ皿、外科用ハサミ、および鉗子に綿を掛けた50 mL遠心チューブ。
  2. イソフルランの過量でラットを安楽死させ、70％エタノールでラットの腹部の皮膚に噴霧し、その背中のコルクシートにラットをマウントする。
  3. はさみと鉗子を使用して、腹部の皮膚、筋肉、および腹膜に縦に切開する。
  4. 鉗子を使用して腹膜をピックアップし、ダイアフラムの下の最も低い肋骨に沿ってその上部に水平切開を行い、そのl外科用ハサミを使用して側方領域の上にある。次に、外科用ハサミを使用して身体から腹膜を除去するために横方向の縦方向の切開を行う。次に、ペトリ皿でPBSで洗浄します。
  5. 外科用はさみと鉗子を使用して、次のステップに適したサイズの腹膜サンプルを20mg（3〜5mm 2 ）切り取り、整える。

2.腹膜試料からの全RNAの精製

注：ここでは、体重20mgの腹膜サンプルを、ガラスホモジナイザーおよび微量遠心分離機スピンカラム内のバイオポリマー粉砕システムを使用してホモジナイズする。次いで、腹膜試料からの全RNAを、シリカ膜ベースのスピンカラムを用いて単離する。

  1. 以下の項目を採取する：1.5または2.0 mLのマイクロ遠心チューブ、100％エタノール、クロロホルム、ガラスホモジナイザー、氷、バイオ遠心分離システム、マイクロ遠心分離スピンカラム10
  2. 20mgの腹膜サンプルをガラスホモジナイザーに入れ、700μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加える。
  3. 腹をゆっくりと試料にねじって腹膜試料を均質化する。腹膜試料がフェノール/グアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで、このプロセスを氷上で数十回繰り返す。
  4. さらなるホモジナイゼーションのために、ホモジナイズしたライセートを、2.0mLのコレクションチューブ内のマイクロ遠心分離スピンカラムのバイオポリマー粉砕システムに移す。次に、14,000 xgで4℃で3分間遠心します。
  5. ホモジナイズしたライセートを新しいマイクロ遠心チューブに移す。
  6. ホモジナイズしたライセートに140μLのクロロホルムを加え、タブをキャップする。安全に。次に、チューブを反転させて15秒間混合する。
  7. サンプルを室温で2〜3分間インキュベートする。次に、12,000 xgで4℃、15分間遠心します。
  8. 沈殿物を乱さずに上清（通常300μL）を新しい微量遠心管に移し、100倍エタノールの容量（通常450μL）を1.5倍加える。次に、5秒間ボルテックスしてサンプルを混合します。
  9. サンプル700μLを2.0mLのコレクションチューブに入れたシリカ膜ベースのスピンカラムにピペットで移します。カラムのキャップを閉めます。次に、15,000 xgで15秒間遠心します。遠心分離後、回収チューブ内の流出液を捨てる。
  10. ストリンジェント洗浄するために700μLの洗浄バッファー1をシリカ膜ベースのスピンカラムに加えます。カラムのキャップを閉めます。次に、15,000 xgで15秒間遠心します。遠心分離後、回収チューブ内の流出液を捨てる。
  11. 500μLの洗浄バッファー2をシリカメンブレンに加えますラーンベースのスピンカラムを使用して塩の痕跡を除去します。カラムのキャップを閉めます。次に、15,000 xgで15秒間遠心します。遠心分離後、回収チューブ内の流出液を捨てる。
  12. 2.11を繰り返します。
  13. シリカ膜ベースのスピンカラムを再び15,000 xgで1分間遠心します。遠心分離後、回収チューブ内の流出液を捨てる。
  14. シリカ膜ベースのスピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに入れます。次に、25μLのRNaseフリー水をカラムに移す。カラムのキャップを閉めます。サンプルを室温で5分間放置する。その後、15,000 xgで1分間遠心します。
  15. 全RNAを含む25μLの溶出液を新しいマイクロ遠心チューブに移す。その後、使用する前に-80℃で保存してください。

3.全RNAの逆転写

注：定量的リアルタイムPCR実験の発表のための最小情報への参照と遵守iments（MIQE）ガイドラインは、より良いプラクティスを奨励し、信頼性の高い明瞭な結果を得るのを助けます12 。
注：ここでは、逆転写酵素、ポリ（A）ポリメラーゼ、およびオリゴdTプライマーを使用して、合計1.0μgの単離されたRNAを逆転写する。

  1. 以下の項目を採取する：1.5mLのマイクロ遠心チューブ; 8ウェルストリップチューブ; RNアーゼフリー水;氷;逆転写酵素キット（材料表参照） 11 。
  2. 2.0μLの10x核酸ミックス、2.0μLの逆転写酵素ミックス（キットから）、4.0μLの5xハイスペックバッファーを含むマスターミックス溶液をチューブあたり合計8.0μLに調製します。
  3. 8.0μLのマスターミックス溶液（キットから）を各チューブに分注する。
  4. 分光光度計を用いて総RNA量を測定する。腹膜サンプルから精製した1.0μgの単離された全RNAを各チューブに添加する。
    注：qRT-PCRは、精製された全RNAの品質管理のために、逆転写を伴わずに鋳型としての全RNAを含む。いずれかのDNAが汚染されている場合、予想外の増幅産物がqRT-PCRによって観察される。
  5. 各チューブにRNaseフリー水を加えて合計20μLとします。次に、ピペッティングにより完全に混合し、15秒間遠心分離する。
  6. サンプルを37℃で60分間インキュベートする。直ちに95℃で5分間インキュベートする。
    注：このステップは、サーマルサイクラーで行うことができます。
  7. 新しい微量遠心管にcDNAを移し、RNaseフリー水で10倍に希釈する（1:10）。
  8. 希釈したcDNAを氷上に一時保存し、長期間使用する前に-80℃で保存する。

4. miRNAのqRT-PCR

注：miRNAのqRT-PCRは、挿入色素を用いて行われる。ここで、RNA、U6小核2（RNU6-2）、miRNA-142-3p、miRNA-21-5p、miRNA-221-3p、miRNA-223-3p、miRNA-327、miRNA-34a-5pに使われていた。

  1. qRT-PCRのための96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレートの接着フィルム、miRNA特異的プライマー、緑色染料ベースのPCRキット（材料表参照） 11 、およびリアルタイムPCR装置。
  2. 12.5μLの2x PCRマスターミックス、ヌクレアーゼフリー水に溶解した5μMの各miRNAプライマー2.5μL、および各ウェルの10倍ユニバーサルプライマー1.25μLを含むマスターミックスを調製します。
  3. 96ウェルプレートの各ウェルに22.5μLのマスターミックスを分注する。
  4. 2.5μLの鋳型cDNAを各ウェルに加える。
  5. 96ウェル反応プレート用の接着フィルムでプレートをシールする。次にプレートを1000 xgで30秒間遠心します。
  6. 以下のようにリアルタイムPCR装置およびソフトウェアを用いてPCRサイクリングプログラムを実行する。
    1. プレートをリアルタイムPCR装置にセットする。リアルタイムPCRソフトウェアでは、実験的特性を定義する（実験的実験装置のタイプに "96-wells"を選択し、定量方法に "2 - ΔΔCT法"を選択し、試薬に標的配列を検出させる "SYBR緑色試薬"を選択し、計器運転）。
    2. 次に、各ウェルのサンプルおよび標的miRNAに名前を割り当てる。サンプルは、結果を検証するのに十分なデータを得るために、常に二重または三重にテストされます。参照サンプルと内因性コントロールを選択する。染料を受動参照として使用する場合は、「なし」を選択します。
    3. 以下の指示に従って、反応液量「20μL」および以下のPCRサイクル条件を指示に従って入力する：95℃で15分間のプレインキュベーション、次いで94℃で15秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、および70℃で30秒間の伸長を含む。
  7. qRT-PCRデータの解析リアルタイムPCR装置のソフトウェアを歌います。ソフトウェアによって自動的に決定される閾値およびベースラインが各ウェルに適切であることを確認する。
  8. 各サンプルのターゲットmiRNAの閾値サイクルを確認してください。閾値サイクルは、増幅曲線と閾値線との間の交差点である。次に、内因性対照としてのRNU6-2に対する標的miRNAの発現レベルを標準化し、2 - ΔΔCT法13を用いて標的miRNAの相対発現レベルを算出する。
    注：内因性コントロールmiRNAの発現レベルの安定性を検証する必要があることに注意する必要があります。この実験において、RNU6-2は、高レベルで発現され、各群にわたって比較的不変であることが確認された。

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結果

ここに示した結果は、これまでに報告された研究8に基づいています。我々は、腹膜線維症におけるmiRNA発現プロファイルを調べた。腹膜線維症は、腹膜透析における主要な合併症である。これは、中皮細胞単層の喪失および細胞外マトリックス成分の過剰蓄積を特徴とし、腹膜破壊を伴う14,15 。腹膜線維症ラットモデルを、100mL / kg腹膜透析液（2.5mMグルコース、100mM NaCl、35mM乳酸ナトリウム、2mM CaCl 2 、および20mMメチルグリオキサールを含む0.7mM MgCl 2 ）の腹腔内注射により、5日間12週齢の雄ラット、および230-250gの体重を有する16週齢の週3週間。以下の群を対照として用いた：無処置のラット（偽ラット）およびラットを注射したメチルグリオキサールを含まない腹膜透析液（対照ラット）を用いた。 miRNAマイクロアレイスクリーニングに基づいて、6つの...

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ディスカッション

この原稿に示されたプロトコールを用いて、ラット腹膜のmiRNAを首尾よく精製し、qRT-PCRを用いて検出した。 qRT-PCRデータ分析の信頼性は、精製されたmiRNAの品質に依存する。したがって、miRNAの純度は、分光光度計を用いて測定することができる280nmの吸光度に対する260nmの吸光度の比によって、qRT-PCRの前に調べることができる。 qRT-PCRを使用してmiRNAの有意な増幅が得られない場合、鋳型cDNAの濃度を増加させることができる。各miRNA特異的プライマーの濃度もまた増加させることができる。

マイクロアレイ、ノーザンブロッティング、およびリボヌクレアーゼ保護アッセイを含む、miRNA発現のレベルを決定するためのいくつかの代替方法がある。 qRT-PCRは、ノーザンブロッティングまたはリボヌクレアーゼ保護アッセイと比較して、最小限の量のサンプルを必要とする高感度で高処理量の手順です。マイクロアレイにより、exp数多くのmiRNAの同時切断があり、このデータは一般にqRT-PCR 17によって得られたデー...

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開示事項

著者らは、利益相反がないと宣言している。

謝辞

優れた技術サポートをしてくれた中田雅子に感謝します。この研究の一部は学術振興会（助成金番号25461252）によって支持された。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
QIAシュレッダーQiagen79654生体高分子シュレッダーシステム スピンカラム
miRNeasy ミニキットQiagen217004シリカ膜ベースのスピンカラム
QIAzol 溶解試薬Qiagen79306フェノール/グアニジンベースの溶解試薬
緩衝液 RLTQiagen79216洗浄緩衝液 1
緩衝液 RWTQiagen1067933洗浄バッファー 2
miScript II RT キット Qiagen218161には10倍が含まれています。デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド三リン酸、およびオリゴ-dTプライマーを含むNucleics Mix。miScript Reverse Transcriptase Mix:ポリ(A)ポリメラーゼと逆転写酵素を含むミックス。miScript HiSpec バッファー
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073には、QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix と miScript Universal Primer
RNU6-2 Primer  QiagenMS00033740未公開
miRNA-142-3p プライマーQiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUUUGGA-3'  
miRNA-21-5p プライマーQiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p
プライマーQiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p
プライマーQiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p
プライマーキアゲンMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327
プライマーQiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'MicroAmp
qRT-PCR 用光学 96 ウェル反応プレートサーモフィッシャー サイエンティフィック431681396 ウェル反応プレート
MicroAmp 光学接着フィルム サーモフィッシャーサイエンティフィ4311971 96ウェル反応プレート用接着フィルム
QuantStudio 12K Flex リアルタイム PCR システムサーモフィッシャーサイエンティフィック4472380リアルタイム PCR 装置
QuantStudio 12K Flex ソフトウェア バージョン 1.2.1.サーモフィッシャーサイエンティフィック4472380リアルタイム PCR 機器ソフトウェア
メチルグリオキサールSigma-AldrichM0252
ミッドペリックテルモ割り当てていません 腹膜透析液
スプレイグ–Dawley ratsSLCは割り当てられていません 
マイクロ遠心分離機のック

参考文献

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