ハイスループットインヒビタースクリーニングによる胚性幹細胞の多能性を調節するキナーゼを同定するための簡単な方法

サマリー

ここで、我々は、ナイーブプライム多能性転移のキナーゼレギュレーターの標的小分子スクリーニングを実施するための定量的かつスケーラブルなプロトコルを提示する。

要約

胚性幹細胞（ESC）は、自己複製するか、または多能性として知られる現象であるすべての細胞型に分化することができる。明確な多能性状態が記載されており、「ナイーブ」および「下塗り」多能性と呼ばれる。ナイーブプライム遷移を制御するメカニズムはあまり理解されていません。特に、我々は、キナーゼ機能をプローブするための高品質のツール化合物の利用可能性が高まるにもかかわらず、ナイーブ及びプライムされた多能性状態を指定するプロテインキナーゼについて十分に知られていないままである。ここでは、マウスESCにおけるナイーブプライム化多能性転移のキナーゼ調節剤のための標的化された小分子スクリーニングを実施するためのスケーラブルなプラットフォームを記載する。このアプローチは、単純な細胞培養条件および標準的な試薬、材料および装置を利用して、多分化能に対するこれまで評価されていない効果を有するキナーゼ阻害剤を明らかにし、検証する。我々は、この技術の潜在的な用途について論じている。これには、他の小分子ますます洗練されたキナーゼ阻害剤やエピジェネティックなツール化合物の新興ライブラリーなどのコレクションです。

概要

胚性幹細胞（ESC）は、多能性¹として知られる現象である、成体における任意の細胞型に自己複製または分化する能力を有する。最近の証拠によれば、発達的に異なる多能性状態が存在し、「ナイーブ」および「プライミング」多能性²と呼ばれる。ナイーブESCは、着床前胚^3に見られるものと同様の発達状態を表す。対照的に、初回刺激多能性ESCは、多能性を終了し、特殊な胚系統に分化する^4,5 。

ナイーブおよびプライムされた多能性状態は、異なる遺伝子調節ネットワークによって特徴付けられる。ナイーブ多能性は、Nanog、Krueppel様転写因子（Klfs）、Rex1 ²およびEsrrbなどの主要多能性転写因子の発現によって特徴付けられる 6。マウスESC（mESC）では、プライミングされた多能性は、ナイーブマーカーの発現の減少、および特異的なDNAメチルトランスフェラーゼDnmt3b ⁷を含む特定の遺伝子発現サインを特徴とする。 インビボで 、初回刺激多能性移植後胚盤葉幹細胞（EpiSC） ^{4,5 は} 、EpiblastマーカーFgf5およびBrachyury ^8のような系統プライミングのマーカーをさらに発現する。

mESCは、 in vitroでナイーブプライミング多能性移行を制御する機構をプローブするための扱いやすいモデルを提供する。白血病抑制因子（LIF）およびウシ胎児血清（FBS）で培養すると、mESCはナイーブおよびプライムド多能性状態の間で動的な移行を起こす^9,10 。ナイーブな遺伝子調節ネットワークを促進するLIF-Jak-Stat3シグナル伝達機能¹¹ 12への移行を促進する。しかしながら、異なる多能性状態を特定する際のプロテインキナーゼの役割を系統的に評価することは依然として課題である。

ここでは、ナイーブプライム化多能性移行のキナーゼ調節剤のための標的化された小分子スクリーニングを行うための定量的かつスケーラブルなプラットフォームを説明する。私たちは単純なmESC培養条件と標準的な試薬、材料と機器を使用して、これまで知られていなかった未知の多能性を安定化させるキナーゼ阻害剤を発見して検証します。さらに、エピジェネティックレギュレーターを標的とする新興インヒビターライブラリーのような他の小分子コレクションのスクリーニングを含む、この技術の潜在的な応用を議論する。

プロトコル

1.低分子キナーゼ阻害剤ライブラリーの照合

1. ハーバードメディカルスクールの統合ネットワークベースの細胞シグネチャー（LINCS）ライブラリー、228の強力かつ選択的なキナーゼ阻害剤（http://lincs.hms.harvard.edu）の標的収集物など、公開されているキナーゼ阻害剤コレクションのインヒビターライブラリーを、 、および酵素キナーゼ阻害剤セット（PKIS）は、産業研究者（https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS）によって組み立てられた376の化合物コレクションである¹³ 。あるいは、市販の化合物から注文されたキナーゼ阻害剤コレクションを組み立てる。
   注：私たちの研究室では、51の一次標的キナーゼをカバーする72種類の強力かつ選択的なツールキナーゼ阻害剤を集めました。これらはすべて商業的な情報源から入手できます。
2. 複数の濃度で最適なハイスループット処理を行うために、キナーゼインヒビターを96ウェルプレートに組み込む（1,1,0 and 0.01mM）。ナイーブおよびプライムされた多能性状態をそれぞれ促進することが知られている、DMSOのみを含有する各プレート対照ウェルおよび参照対照インヒビターPD173074（FGFRi）およびルキソリチニブ（JAKi）を含む。スプレッドシートまたは類似のソフトウェアに注釈を付ける。

2. mESC培養条件とスクリーン作製の手順

1. 0.1％（w / v）ゼラチン5mLを10cmプレートに添加して0.1％ゼラチン被覆10cm皿を調製し、室温で5分間インキュベートする。ゼラチンを吸引し、プレートを2分間乾燥させる。
2. 100ng / mLのGST-LIF、10％のウシ胎仔血清および5％のノックアウト血清を含有する標準mESC培地（ 材料表参照）中の0.1％ゼラチンコート10cmディッシュ上の37℃5％CO _2での任意の標準mESC系統を培養する。置換。培地を毎日交換し、継代mESCを2日毎に約80％コンフルエンシーで1：5〜1：10の希釈率で交換する。
3. mESCを通過させるために、培地を吸引し、5mLの水で洗浄する（PBS）をプレートあたり1個ずつ含む。
4. 1mLのmESCsあたり1mLのトリプシン-EDTA（0.05％トリプシン、0.02％EDTA）を添加し、37℃で10分間インキュベートする。
5. トリプシン処理した細胞を4mLのmESC培地に再懸濁し、1,200rpmで5分間遠心分離する。
6. 徹底的に細胞ペレットを5mLのmESC培地に再懸濁し、上下にピペッティングして単一細胞懸濁液を生成する。
7. 10μLの細胞懸濁液と10μLのTrypan Blue（0.4％）を組み合わせて細胞を計数する。細胞計数室に置くか、または血球計算盤および光学顕微鏡を使用する。
8. マルチチャンネルピペットを使用して、0.1％ゼラチンコートした96ウェルプレートに3×10 ^3個の mESCを最終体積100μLで播種する。
9. マルチチャネルピペットを使用して、1：100希釈（1μL阻害剤を100μLの培地に加えた）でキナーゼ阻害剤を適用する。穏やかに培地を混合し、阻害剤と細胞懸濁液を混合し、細胞が均一な分布のアクロを確保するために1時間組織培養フードに定着することを可能にするめっき表面はssです。培地を交換することなく48時間培養した。
   注：1 / 0.1 / 0.01mMのストックプレートは、それぞれ10/1 /0.1μMの最終阻害剤濃度を与えるであろう。オフターゲット効果を最小限に抑えながら一次標的キナーゼの効果的な阻害を確実にするために、1μMの最終濃度でスクリーニングを開始することを推奨する。

キナーゼ阻害剤スクリーニング分析

1. マルチチャネルアスピレーターとピペットを使用して200μLのPBSで96ウェルmESCプレートを洗浄する。
2. 150μLの溶解緩衝液（20mM Tris pH7.4,150mM NaCl、1mM EDTA、1％NP-40（v / v）、0.5％デオキシコール酸ナトリウム（w / v）、10mMβ-グリセロホスフェート、10mMのピロリン酸ナトリウム、1mMのNaF、2mMのNa ₃ VO ₄ 、完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤）。
3. V底96ウェルプレート中で1,500×gで30分間遠心分離して抽出物を清澄化する。
4. 100μLの上清をニトロセル上に固定化する96穴バキュームドットブロットマニホールドを使用して1μgの膜で洗浄した。
5. 膜を乾燥させ、40mLのPonceau Sで染色して一貫した転写を確実にする。
6. 膜をTBSTで洗浄し、TBST / 3％（w / v）ミルク中でブロックする。
7. TBST / 3％（w / v）のミルクパウダー中で1：1,000（v / v）の希釈度で一晩、NanogおよびDnmt3b抗体をインキュベートする。
8. 膜をTBST中で3×10分で洗浄し、TBST / 3％（w / v）ミルク中で1：10,000（v / v）の希釈で30mLの二次抗体中でインキュベートする。
9. デジタルイムノブロッティングイメージングシステムを使用して開発します。
   注：可能であれば、定量的蛍光イムノブロッティングを使用してNanogおよびDnmt3bを検出します。しかし、蛍光イムノブロッティングによるDnmt3bのバックグラウンドシグナルは高すぎます。したがって、800nmの蛍光抗ウサギ（Nanog）および抗マウスHRP（Dnmt3b）二次抗体が使用される。

4.真正多能性調節因子としてのスクリーニングデータの解析と阻害剤の検証

注記：これは、真正多能性モジュレーターのみを同定するための重要なステップです。 mESC生存に悪影響を与えるキナーゼ阻害剤がさらなる分析のために選択されないことを確実にするために、Nanog：Dnmt3b比および全体的シグナルの両方に基づく阻害剤をトリアージすることが不可欠である。

1. イムノブロッティング解析ソフトウェアを使用してNanogおよびDnmt3bシグナルを定量し、スプレッドシートまたは同様のソフトウェアに値をインポートします。 DMSOコントロールと比較して、すべてのサンプルについてNanog：Dnmt3b比を計算する。また、キナーゼ阻害剤がmESC生存率を変化させることによってNanog：Dnmt3b比に影響しないことを確実にするために、全NanogおよびDnmt3bシグナルを決定する。
2. ナイーブ多能性（Nanog：対照より高いDnmt3b比）およびプライムされた多能性（Nanog：対照よりも低いDnmt3b比）を促進する阻害剤を同定するために、ランク付けされたNanog：Dnmt3b比を使用する。コントロール値から2倍の偏差でカットオフを設定し、合計Nanog + Dnmt3bシグナルを生成するキナーゼ阻害剤を除外するナイーブ（高Nanog：Dnmt3b比）および下塗り（低Nanog：Dnmt3b比）多能性状態を安定化させるキナーゼ阻害剤の高い信頼性のリストを生成するために、DMSO対照値の50％。
3. 2mLの培地で6ウェルあたり2×10 ⁵個の細胞にmESCを播種し、培地を交換することなく、1μMで48時間、キナーゼ阻害剤を添加することにより、キナーゼ阻害剤を検証する。
4. 溶解緩衝液中のmESCを溶解し、従来のSDS-PAGEイムノブロッティングによりNanogおよびDnmt3b発現を分析する。
5. ナイーブ多能性マーカーKlf2およびKlf4、およびOct4についてのSDS-PAGEイムノブロッティングによるヒットをさらに検証し、48時間のインヒビター処置後に多能性が維持されることを確実にする。

結果

ここに示した手順（ 図1 ）を用いて、mESC多能性を調節するものを同定するために、228の強力かつ選択的なキナーゼ阻害剤のLINCSライブラリーをスクリーニングする。ライブラリーは、1：100希釈については0.1mMの濃度で、mESCでは1μMの最終スクリーニング濃度で調製する。 48時間後、mESCを溶解し、NanogおよびDnmt3b発現の定量的ドットブロット分析のために抽出物を調製した（ 図2 、上）。他のスクリーニング濃度の結果は、簡潔にするためにここには示していない。 Nanog：各キナーゼ阻害剤および化合物ランクでDnmt3b比を決定し、2倍カットオフを適用する（ 図2 、下）。コントロールに対する全NanogおよびDnmt3bシグナルをインヒビターランキングに重ね、0.5xカットオフに供して、有意なmESC毒性を示すインヒビターのトリアージを可能にする。ナイーブStaを安定化させるキナーゼ阻害剤を選択するteは、従来のNanog / Dnmt3bイムノブロッティング（ 図3 ）を用いて検証されている。これらの阻害剤の主要キナーゼ標的を表1に示す 。我々はまた、このスクリーニングの適用可能性が、下塗り状態^14を安定化させるインヒビターを同定することを実証している。

図1：ナイーブプライミング移行を調節するキナーゼ阻害剤のスクリーニングのためのワークフロー。 mESCを、1μMの最終濃度で228化合物キナーゼ阻害剤ライブラリーで処理した。溶解物を調製し、免疫ドットブロット分析のためにニトロセルロース膜上に移し、NanogおよびDnmt3bレベルを決定した（図はWilliams ら ¹⁴から適合した）。 他を見るにはここをクリックしてくださいこの数字のアーガーバージョン。

図2：ナイーブプライム化多能性スクリーニング分析およびインヒビター同定。 （Top）代表的なNanogおよびDnmt3bイムノドットブロット画像。 （底部）各キナーゼ阻害剤についてのNanogおよびDnmt3b値をDMSO対照に対して決定し、Nanog：Dnmt3b比および全相対Nanog + Dnmt3bシグナルを決定し、阻害剤をDMSO対照と比較してランク付けした。 DMSO対照の2倍の閾値を超えるNanog：Dnmt3b比を変更することが判明した阻害剤は、ナイーブまたはプライムされた多能性の原動力として同定された。 DMSO対照より2倍低い閾値は、mESC生存を損なうトリアージインヒビターに設定した。さらなる確認のために選択された阻害剤が強調表示されている。 （図はWilliams ら ¹⁴から適応されている ）。s / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3：選択されたヒット化合物の確認。 mESCを、1μMAZD4547（選択的FGFR阻害剤）または図2のスクリーニングから同定された指示された阻害剤のいずれかで処理した。ナノグ：標準SDS-PAGEおよびイムノブロット分析により決定したDnmt3bレベル。相対Nanog：Dnmt3bおよびNanog + Dnmt3bの数値は下の表に示されており、ナイーブ多能性状態を安定化する阻害剤は緑色で強調されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

化合物	主要ターゲット		その他のターゲット
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL、BRAF、RET、CSF1R、EGFR、EPHA8、FGFR、FLT3、KIT、LOK、MAP4K1、p38b、MUSK、PDGFR、TAOK3、TNNI3K
WH-4-023	Lck		Src
R4406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R、DDR1、EGFR、TIE1、PDGFR2
WZ-7043	CSF1R、DDR1、FGFRおよびTAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2、VEGFR3、＃160;
AZD-1480	JAK2

表1：選択されたヒット化合物およびその主要キナーゼ標的。

ディスカッション

ここでは、ナイーブプライム多能性移行の制御におけるキナーゼシグナル伝達経路の役割を調べるための広くアクセス可能な方法論を示す。これは、ESC分野の重要な問題に取り組んでいます。ナイーブおよびプライムされた多能性状態の主要な転写調節因子を同定するために、ハイスループットのゲノミクスおよび転写ミックスアプローチが日常的に使用されているが、多能性シグナル伝達ネットワークを解明することは困難であることが判明している。私たちは今、mESCにおけるナイーブプライム多能性転移を制御するキナーゼを同定するために、化学的インヒビターを用いる柔軟な戦略を提供する。これは、細胞シグナリングおよびESC生物学を研究するほとんどの研究所で利用可能な単純な機器、試薬および材料に依存する。このプラットフォームの成功にとって重要なのは、ナイーブおよびプライムド多能性状態間の移行を定量化するための堅牢なアッセイの開発です。このアッセイを確立するためには、細胞プレート密度、インヒビターインキュベーション時間およびイムノブロッティング条件。

小分子アプローチは、治療用ESCアプリケーション^15,16における合理的使用のための牽引力を獲得している。小分子スクリーニングの主要な強みは、効率的な細胞摂取のためにツール化合物が設計および/または修飾されていることである。トランスフェクション効率は限定されず、レンチウイルスなどの危険な送達系の使用は必要ではない。さらに、インヒビターは、R​​NAiおよびCRISPR / Cas9のような遺伝的/ゲノム干渉技術を妨げる機能的重複を克服する、キナーゼファミリー内の複数のアイソフォーム（ 例えば、 Fgfr1-4、Jak1-3）をしばしば阻害する。より強力で選択的なツール化合物が学術および医薬品創薬プログラムの両方から入手可能になるにつれて、十分に理解されていないキナーゼは、ESC研究の最前線に押し出されます。したがって、我々は、この高いラウンド・プット・スクリーニング・アプローチは、ESCの中核的な規制ネットワークの研究の新たな道を開きます。

この技術の1つの小さな制限は、最も強力で選択的な小分子阻害剤でさえもインビボで複数の無関係なキナーゼに関与し、阻害することである。しかしながら、ますます包括的なキナーゼ阻害剤プロファイリングデータは、キナーゼ阻害剤の機能的標的を容易に同定することを可能にする（http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase - 阻害剤）。最後に、原理的には、高品質イムノブロッティング抗体が利用可能な小分子収集および/または細胞アッセイを調べるために、我々のプラットフォームを適用することができる。これにより、多能性調節における複数の調節系の研究が可能になり、多様な細胞プロセスを改変する小分子阻害剤の同定が容易になる。具体的には、本発明者らは、エピゲンのような新生小分子コレクションStructural Genomics Consortium（http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics）によって開発されているticプローブは、多能性移行のさらなる新規レギュレーターを明らかにする可能性を秘めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
mESC media
CCE mESCs	ATCC	ATCC SCRC-1023
DMEM Media	Gibco	11965092
L-Glutamine	Gibco	25030081	最終:2 mM
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	15140122	最終:50 U/ml
2-メルカプトエタノール	Sigma	M6250	最終:0.1 mM
白血病抑制因子 (GST 融合)	MRC-PPU 試薬およびサービス		最終: 100 ng/mL
白血病抑制因子	Thermo	PMC9484	最終:100 ng/mL
非必須アミノ酸	Gibco	11140050	最終:0.1 mM
ピルビン酸ナトリウム	Gibco	11360070	最終:1 mM
ノックアウト血清補充	Invitrogen	10828-028	最終:5%
定義 ウシ胎児血清	Fisher	10703464	最終:10%
名前	会社	カタログ番号	コメント
TC材料
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	サーモ	25300054
豚の皮からのゼラチン	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo	156545
DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし	Gibco	14190136
V-bottom 96 well plates	Greiner Bio-one	651261
Name	Company<	strong>カタログ番号	コメント<
strong>溶解バッファー
Tris	バッファーVWR	103157P
塩化ナトリウム	VWR	97061
EDTA	シグマ	E4884
1%NP-40	シグマ	9016-45-9
ナトリウムデオキシコール酸	シグマ	D6750-100g
&β;-グリセロリン酸	シグマ	G9422
ピロリン酸ナトリウム	シグマ	13472-36-1
フッ化ナトリウム	シグマ	450022
オルトバナジン酸ナトリウム	シグマ	450243
ロシュ コンプリート プロテアーゼ阻害剤カクテル タブレット	シグマ	CO-RO
strong>名前	会社	カタログ番号	コメント
Chemicals
Tween	Sigma	P1379-1L
	Marvel
Name	Company	カタログ番号	コメント
Western Blotting
Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &micor;M 細孔径 (20cm×20cm) (25枚入)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
名名	企業名	カタログ番号	コメント
Laboratory Equipment
Minifold ISystem	GE	10447850
ChemiDoc イメージャー	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
名前	会社	カタログ番号	strongコメント
抗体
アンチマウスナノグ	リプロセルRCAB001P
抗Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW ロバ抗ウサギ		Licor 926-32213
抗マウス HRP	細胞シグナル伝達技術	7076S
反 KLF2	ミリポア	09-820
抗 KLF4	R&Dシステム	ズAF3158
アンチOct4	サンタクルーズ	sc-5279