次世代シークエンシングに適した植物オルガネラDNA濃縮法の最適化と比較分析

サマリー

2つの植物細胞小器官DNA濃縮方法の比較および最適化が提示される：従来の分画遠心分離およびメチル化状態に基づく全gDNAの分画。得られたDNAの量と品質を評価し、短期間の次世代シーケンシングでの性能を実証し、長時間読み取り単一分子シークエンシングで使用する可能性について検討します。

要約

植物オルガネラゲノムは、複雑な構造および/またはサブゲノム断片を形成するために対合または組換えを受ける可能性がある、大きな反復要素を含む。オルガネラゲノムはまた、所与の細胞または組織型（ヘテロプラスミー）内での混合物として存在し、多量のサブタイプは、発達中またはストレス下で変化し得る（化学量論的部分シフト）。オルガネラゲノムの構造と機能をより深く理解するためには、次世代シーケンシング（NGS）技術が必要です。伝統的な配列決定研究は、細胞小器官DNAを得るためにいくつかの方法を使用する：（1）大量の出発組織を使用する場合、それをホモジナイズし、分画遠心分離および/または勾配精製に供する。 （種子、材料、又は空間が限られている場合、すなわち、）（2）組織の少量が使用される場合、同じプロセスが（1）十分なDNAを得るために、全ゲノム増幅に続いてのように行われます。 （3）バイオインフォマティクス分析は、seq総ゲノムDNAを調べ、オルガネラの読みを解析する。これらの方法にはすべて固有の課題とトレードオフがあります。 （1）では、そのような多量の出発組織を得ることは困難であり得る。 （2）において、全ゲノム増幅は配列決定バイアスを導入し得る; （3）において、核ゲノムとオルガネラゲノムとの間の相同性が、アセンブリおよび分析を妨害する可能性がある。大きな核ゲノムを有する植物では、オルガネラDNAを濃縮して、バイオインフォマティクス分析の配列決定コストおよび配列複雑性を低減することが有利である。ここでは、伝統的な微分遠心分離法を第4の方法、適合したCpG-メチルプルダウン法と比較して、全ゲノムDNAを核および細胞小器官画分に分離する。いずれの方法も、ミトコンドリアおよび葉緑体において異なる比率であるにもかかわらず、細胞小器官配列に対して高度に濃縮されたNGS、すなわちDNAに対して十分なDNAを生じる。我々は、小麦の葉組織のためのこれらの方法の最適化を提示し、主要な利点およびdサンプル入力、プロトコルの容易性、および下流のアプリケーションの文脈における各アプローチの長所である。

概要

ゲノム配列決定は、重要な植物形質の根底にある遺伝的根拠を解明するための強力なツールです。ほとんどのゲノムシーケンシング研究は、遺伝子の大部分が核内に位置するため、核ゲノムの内容に焦点を当てています。しかし、（真核生物にわたる）ミトコンドリアと色素体（植物中で、特殊な形式、葉緑体、光合成で動作）を含む細胞小器官のゲノムは、生物の開発、ストレス応答、および全体的なフィットネス¹に不可欠な重要な遺伝情報を貢献します。オルガネラゲノムは、通常、核ゲノム配列決定を目的とした全DNA抽出に含まれますが、DNA抽出に先立つオルガネラ数を減らす方法も使用されています² 。多くの研究は、オルガネラゲノムを組み立てるために、総gDNAの抽出からの配列決定結果を使用していた^3、4、5、外部参照"> ^6、7。しかし、多くの人がしている読み取るための研究の目標は、合計のgDNAは、シーケンシングコストを増大させ使用して、細胞小器官のゲノムに焦点を当てているとき、『特に大きな核ゲノムを有する植物で、核DNA配列に』失われましたまた、による核ゲノム中へのオルガネラ配列の複製、転写および細胞小器官の間に、配列決定の正しいマッピング位置を解決することは、適切なゲノムに読み出しバイオインフォマティクス^2,8に挑戦されている。核ゲノムからオルガネラゲノムの精製が1でありますミトコンドリアと葉緑体との間の相同性領域にマッピングされる読み取りを分離するために、さらなるバイオインフォマティクス戦略を使用することができる。

多くの植物種からのオルガネラゲノムが配列決定されているが、オルガネラゲノム多様性の幅についてはほとんど知られていない野生の集団または栽培された繁殖プールで利用可能である。オルガネラゲノムはまた、反復配列間の組換えのために重要な構造的再編成を受ける動的分子であることが知られている⁹ 。さらに、オルガネラゲノムの複数のコピーが各オルガネラ内に含まれ、複数のオルガネラが各細胞内に含まれる。これらのゲノムの全てのコピーが同一であるとは限らず、ヘテロプラスミーとして知られている。 「マスターサークル」の正統図とは対照的に、サブゲノム円、線状染色体、線状コンカテマー、分枝構造など、細胞小器官ゲノム構造のより複雑な画像の証拠が増えています¹⁰ 。植物オルガネラゲノムの集合は、それらの比較的大きなサイズおよび実質的な逆方向反復および直接反復によってさらに複雑になる。

オルガネラ単離、DNA精製およびその後のゲノムに関する従来のプロトコール E配列は、多くの場合、煩雑であり、いくつかのグラム、組織入力の大容量を必要とするように上方に始点^{11、12、13、14、15、16、17、}必要に応じて、若い葉の組織のグラム数百。これは、組織が限られている場合、細胞小器官のゲノム配列決定が不可能になります。いくつかの状況では、交配によって維持されなければならない雄性不稔性系統または世代別に配列決定する必要がある場合など、種子の量は限られる。このような状況では、細胞小器官のDNAを精製してから全ゲノム増幅を行うことができます。しかしながら、全ゲノム増幅は、構造変化、サブゲノム構造、およびヘテロプラスミーレベルを評価する際に特に問題となる、有意な配列決定バイアスを導入することができる> 18。短リードシーケンシング技術のライブラリ作成における最近の進歩は、全ゲノム増幅を回避するために低入力障壁を克服してきた。例えば、Illumina Nextera XTライブラリー調製キットでは、1 ngのDNAを入力¹⁹として使用できます。しかしながら、PacBioまたはOxford Nanopore配列決定技術のような長時間配列決定アプリケーションのための標準ライブラリー調製は、オルガネラゲノム配列決定のための課題を提起することができる比較的多量の入力DNAを依然として必要とする。最近、新しいユーザー作られた、長読みシーケンシングプロトコルは、入力量を低減し、DNAのマイクログラム-量を得ることが^21、20困難なサンプルではゲノム配列決定を促進するために開発されてきました。しかしながら、これらのライブラリー調製物に供給するための高分子量の純粋なオルガネラ画分を得ることは、依然として課題である。

私たちは全ゲノム増幅を必要とせずに、NGSに適したオルガネラDNA濃縮および単離法を比較し最適化する。具体的には、葉のサブサンプルなどの限られた出発物質から高分子量細胞小器官DNAを濃縮するためのベストプラクティスを決定することでした。この研究は、（1）市販のDNA CpG-メチル結合ドメインタンパク質プルダウンアプローチの使用に基づく（2）DNA分画プロトコルに対する、改変された伝統的な微分遠心分離プロトコルである細胞小器官DNAを濃縮する方法の比較分析を提示する^22は、組織^23を植える適用しました。我々は、小麦葉組織からのオルガネラDNAの単離のためのベストプラクティスを推奨しており、これは他の植物および組織タイプに容易に拡張することができる。

プロトコル

臓器単離およびDNA抽出のための植物材料の生成

1. 小麦の苗の標準的な成長
   1. バーミキュライトの植物の種子を角のついた4〜6個の種子を持つ小さな四角い鉢に入れる。 16時間の光サイクル、23℃/ 18℃の夜間温室または成長チャンバーに移す。
   2. 毎日植物に水を注ぎます。発芽時および発芽後7日目に、顆粒20-20-20 NPK肥料の¼ティースプーンで植物を肥料化する。
2. 小麦の苗の代替的栽培
   1. ステップ1.1に従いますが、ポットを暗室で23℃、16時間/ 18℃で8時間置きます。あるいは、温室内の植物を覆う（ 例えば、貯蔵容器を用いるが、適切な換気が維持されなければならない）。
3. 成長および組織収集
   1. 12〜14日間植物を栽培してください。ほとんどの小麦遺伝子型苗の75〜100苗は約10〜12gの組織を産生し、これは分画遠心分離法（セクション2）を用いた2回の細胞小器官の抽出に十分である。核DNAから細胞小器官を分画するためにDNA CpG-メチル化に基づくプルダウン法を利用する場合には、1つの植物のみが必要である（第3節）。
   2. ディファレンシャル遠心法を利用する場合は、組織を新鮮なものにして、セクション2で説明したように、サンプルの処理に直ちに進んでください。
   3. CpGメチルプルダウンアプローチを利用する場合、マイクロ遠心チューブに若い葉組織の収穫20mgのセクション（ 代表的な結果を参照して、いずれかの標準の成長または黄化組織を使用）。液体窒素でスナップフリーズし、使用するまで-80℃で凍らせます。セクション3で説明したように、DNAのプルダウン分画に進みます。

2.方法＃1：示差遠心分離（DC）を用いたDNA抽出

注：differential遠心分離プロトコルは、両方の細胞小器官を単離が、ミトコンドリア^17、24を濃縮するために条件を最適化された2巻の刊行物から改変しました。得られたプロトコールは、従来の方法よりも時間がかかりにくく、毒性の少ない化学物質を使用する。具体的には、STE抽出緩衝液へのポリビニルピロリドン（PVP）の添加およびフッ化ナトリウム（NaF）を含有するNETF緩衝液中の最終洗浄工程の除去を含む、緩衝液および洗浄工程を改変した。

注意：STE緩衝液の調製および使用は、このバッファーに2-メルカプトエタノール（BME）が含まれているため、適切な個人用保護具を備えた化学薬品フードの下で行う必要があります。

1. 開始前のこと
   1. すべての装置がきれいになっていることを確認して、オートクレーブが可能な装置をオートクレーブしてください（ 例：粉砕シリンダー、高速セントリフュージチューブなど ）。
      注：クロスコンタミネーションを避けるために、ピペッティングが必要なすべての手順に、フィルターチップを使用することをお勧めします。
   2. 必要な機器と試薬のリストを参照し、方法＃1（ 表1 ）のために必要な緩衝液と作業ストックを準備する。極低温粉砕ブロックを-20℃に冷却し、ローターとバッファーを4℃に冷却し、微量遠心分離機を4℃に設定し、37℃の水槽に入れます。
2. オルガネラの分離
   1. 新鮮な組織を5g採取し、冷たいビーカーの氷冷した滅菌水ですすいでください。
      注記：遠心分離機、ヒュームフードなどのすべての操作および輸送中は、サンプルを氷上に置いておきます。プロトコールを実行するのに十分なスペースと設備があれば、冷蔵室で作業してください。
   2. はさみを使用して、葉の組織を2cmのセラミック研削を含む50mLのチューブに直接〜1cm片に切断するシリンダー。
      注：クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間のハサミを清掃または交換してください。
   3. 組織ホモジナイザーがない場合は、乳鉢と乳棒を使用して、ステップ2.2.4-22.9を置き換える。
      1. 氷上のあらかじめ冷却した乳鉢に葉組織を切断する。 15mLのSTE（ヒュームフード内）で2〜3分間サンプルを粉砕する。
      2. バッファーをあらかじめ濡らした滅菌濾過クロス（〜22μm〜25μmの孔径;詳細は主なプロトコールを参照）の1層を含む漏斗を通して緩衝液（モルタル中に組織を残す）から別の50mLチューブ。さらに10 mLのSTEを乳鉢に加え、乳棒で掻き混ぜ、再度ホモジナイズする。
      3. ホモジナイズした組織とバッファーを同じ漏斗に注ぎます。乳鉢をすすぎ、10mLのSTEで乳化し、漏斗に注ぐ。できるだけ多くの液体を回収するために、濾布を絞って漏斗に絞ってください。
         注：クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間の手袋を交換してください。プロと続けるステップ2.2.10でトコール。
   4. 各50 mLチューブに20 mLのSTE（ヒュームフード内）を添加する。
   5. 試料を、組織粉砕装置中の予め冷却した極低温粉砕ブロックに入れ、1,750rpmで2×30秒間試料を粉砕する。サンプルの位置を回転させ、粉砕の間に約1分間氷上にサンプルを置く。
      注：乳鉢と乳棒、ブレンダー、または他の組織粉砕/均質化装置をこの工程で使用することができる。しかし、各方法は結果として得られるDNA品質に異なる程度で影響を与えるため、DNAの長さおよび品質を評価してから、下流のアプリケーションを続行する必要があります。
   6. 氷中に置かれた清潔な50mLチューブに漏斗を入れる。ろ液の一層を漏斗に入れ、5mLのSTEであらかじめぬらします。フロースルーを廃棄しないでください。
   7. ホモジナイズした組織を漏斗に注ぎます。 15 mLのSTEで粉砕チューブをすすいだ後、チューブを逆さにして反転させて壁と蓋をすすぎ、ファーンに注ぎますエル。
   8. 慎重に陶器の石を取り除き、濾過布を絞って漏斗に絞ってください。
      注：クロスコンタミネーションを避けるために、サンプル間の手袋を交換してください。
   9. こぼれないようにパラフィルムでチューブキャップを包みます。 4℃で10分間2,000 xgで遠心します。
   10. 慎重に血清ピペットを使用して上清を吸引し（ペレットを乱さないように）、50 mLの高速遠心分離チューブに入れます（密封ガスケットがない場合はパラフィンでチューブキャップを包んでください）。ペレットを捨てる。
   11. STEを使用してチューブを0.1g以内に収め、得られた上清を18,000 xgおよび4℃で20分間遠心します。チューブのバランスを取るために、氷の小さなビーカーを天びんに置き、風袋を秤量し、サンプルを氷上で秤量して冷たく保ちます。あるいは、冷たい部屋で天びんとヒュームフードを使用してください。
   12. 上清を捨てる。ペレットに1 mLのSTを加え、穏やかに再懸濁するやわらかな絵筆を描く。 24mLのST（25mLの最終容量）を加え、混合/渦巻き（ すなわち、チューブの側面のペイントブラシを押してすべての液体を除去する）。
   13. STを使用してチューブを0.1g以内に収めます。 18,000 xgおよび4℃で20分間遠心分離する。一方、DNaseI溶液を調製してください（ストック溶液および作業溶液レシピについては表1を参照）。各サンプルについて、1.5mLチューブで200μLのアリコートを1つ作成します。
   14. 上清を捨て、チューブをブロットし、軟ペイントブラシを使用して300μLのST中でペレット（高速遠心チューブに依然として）を再懸濁する。 200μLのDNaseI溶液を含む先に調製した1.5mLチューブにペイントブラシを置き、ペイントブラシを渦巻かせてブラシに付着した残留ペレットを除去する。 DNaseI溶液をピペットで高速遠心チューブに戻し、穏やかに混合して混和させます。
   15. 37℃で30分間、水浴中でインキュベートする（チューブ上部のパラフィルムを包んで、凝縮漏出を防ぐgをキャップに入れる）。インキュベーションの間に2回旋回させることにより静かに混合する。
   16. ピペットチップを用いてペレット混合物をチューブからゆっくりとピペットで広げ、1.5mLの低結合チューブに入れる。 500μLの400mM EDTA、pH 8.0を高速遠心管に加え、ゆっくりとピペットで残ったペレットをすべてチューブから取り出します。ペレット混合物と同じ1.5mLの低結合チューブにEDTAを移し、穏やかに転倒混和する。
   17. 4℃で18,000 xgで20分間遠心する。上清を捨て、チューブをブロットし、DNA単離のためにすぐに使用する。必要に応じて、-20℃でペレットを凍結しますが、残存するDNaseIがすぐに処理されないとサンプルDNAを分解させる可能性があるため、収率が低下する可能性があります。
3. 市販のカラムを用いた単離されたオルガネラからのDNA抽出
   注記：完全プロトコールについては、キットハンドブックを参照してください（ ²⁵ ）。 Prオルガネラ単離からDNA抽出へ直接移行することが好ましい。反復凍結および融解は、DNA断片サイズを減少させ、残留DNaseIによるDNA分解をもたらす。ボルテックスや激しいピペッティングはDNAを剪断することができますので、制限してください。 DNA回収を最大にするために、低結合マイクロ遠心チューブの使用を推奨します。
   1. DNA抽出手順
      注：バッファが適切に作成/保存され、スピンカラム手順が理解されていることを確認する前に、詳細な商用プロトコール²⁵をお読みください。
      1. ペレットを用いて180μLのBuffer ATLをチューブに直接添加する（予め凍結してベンチトップ上で室温に平衡化していれば解凍する）。
      2. 手順3で30分の溶解、オプションのRNase A消化を含むキットハンドブックの「DNA Purifications from Tissues」の手順3に進み、3×200μLのAEに溶出する。それぞれのパラメートチューブを開き、溶出液を合わせる）。
      3. qPCRのためにアリコート（少なくとも20μL）を保存する（ステップ4.1参照）。濃縮前に定量するために、高感度定量のために1μLをさらに保存します。
      4. 必要に応じて、サンプルの濃縮を進めてください。
4. 市販のフィルターユニットでのサンプル濃度
   注：詳細については、商用プロトコル²⁶を参照してください。下流の用途に応じて、（ 例えば、エンドポイントPCRおよびqPCRアプリケーションのための）サンプル濃縮を行う必要はないかもしれない。しかし、NGSライブラリー構築のためには、DNA抽出後に得られる希薄オルガネラDNAを濃縮する必要があると思われる。
   1. 濃縮カラム手順
      1. デジタル分析天びん上の清潔な秤量紙に空のフィルターユニット（チューブなし）を注意深く事前に計量してください（ 表2参照）。体重を記録する。
      2. Pi合わせた溶出液をフィルターユニットに注入し、再び注意深く秤量する。
         注：商用マニュアル^26によると、フィルタユニットの最大容量は500μLですが、オーバーフローなしで最大575μLをユニットに一度に追加できます。
      3. 充填されたフィルターユニットをチューブ（カラムに付属）に慎重に置きます。 500xgで所望の時間遠心分離して、必要な濃縮物の容量を達成する。 〜575μLのサンプル量では、20分のスピンは通常15〜30μLの濃縮液量になります。
      4. フィルターユニットをチューブから取り外し、再度秤量します。この表を使用して、所望の濃縮物量が達成されたかどうかを決定する。そうでない場合は、500 xgでもう一度短時間遠心し、再び体重を測定します。所望の濃縮物の容量に達するまで繰り返す。
      5. 新しいチューブ（カラムに付属）をフィルターユニットの上に置き、反転させます。 1000 xgで3分間遠心分離して、チューブに移す。
      6. 回復されたボリュームを決定します。これは通常、フィルターの保持のために、計算された容量より3〜5μL少なくなります。過剰に濃縮された場合は、滅菌水またはTEで希釈して所望の容量を達成する。
      7. 高感度定量を使用してDNAを定量する（製造業者の指示に従って）。

方法＃2：全ゲノムDNAからのオルガネラDNAを濃縮するメチル分画（MF）アプローチ

注：このプロトコールは、植物および真菌²⁷および市販のMicrobiome DNA Enrichment Kitプロトコール²⁸について、ユーザーが開発したゲノムチップキットDNA抽出プロトコルから変更されました。理論的には、高分子量のDNAを生じる任意のDNA単離プロトコールをプルダウンに使用することができる。短リードシーケンシングの場合、プルダウンでの使用には、主に15 kb以上の断片を生じる抽出が適切です。 For lo読取りシーケンシングでは、より大きなフラグメントが望ましい場合があります。したがって、我々は高分子量のDNAを得るためにこのプロトコルを最適化した。

1. 全DNAの単離
   注記：必要な機器と試薬のリストを参照し、方法＃2（ 表1 ）のために必要なバッファーと作業ストックを準備します。溶解緩衝液ストックに溶解酵素を加えて、溶解緩衝液を作用溶液にする。サーモミキサーの電源を入れ、37℃に設定します。水浴を50℃にし、QF緩衝液を浴に入れる。冷凍庫に70％EtOHを置き、微量遠心分離機を4℃に設定する。
   1. 市販のDNA抽出カラムを用いた全DNA抽出
      注：開始する前に、重力流動陰イオン交換カラムの使用に関する詳細については、コマーシャルハンドブック²⁹を参照してください。特別なラックを使用してカラムを設置するか、付属のプラスチックリングを使用してチューブの上に置くことができます。 gを含むすべてのステップエノミックチップは、重力流によって進行させるべきであり、残留液体は強制的に通過させてはならない。
      1. 2mLチューブ用に設計された手持ち式粉砕乳棒を使用して、2mLの低結合チューブ中の液体窒素中の凍結組織20mgを粉砕する。
      2. 2mLの溶解緩衝液を加える（チューブは非常にいっぱいになる）。
      3. 300 rpmで穏やかに攪拌しながら、37℃のサーモミキサーで1時間インキュベートする。サーモミキサーが利用できない場合は、ヒートブロック上でインキュベートし、15分ごとに穏やかなフリックで混合することが適しています。
      4. RNアーゼA（100mg / mL、最終濃度200μg/ mL）4μLを添加する。 37℃で30分間、サーモミキサー中で混合し、インキュベートし、300rpmで穏やかに攪拌する。
      5. 80μLのプロテイナーゼK（20mg / mL、最終濃度0.8mg / mL）を添加し、混合物に転化させ、300rpmで穏やかに攪拌しながら、50℃で2時間サーモミキサー中でインキュベートする。
      6. 4℃、1分間で20分間遠心分離する。不溶性破片をペレット化するために5,000×g。
      7. サンプルを遠心分離しながら、カラムを1 mLのBuffer QBTで平衡化し、カラムを重力流によって空にします。
      8. ワイドボアピペットチップを使用して、平衡したカラムにサンプルをすばやく塗布し（ペレットを避ける）、完全にカラムに流してください。サンプルは、カラムに適用する前に、再び曇り、フィルターや遠心分離機になった場合（詳細は²⁹商業用ハンドブックを参照してください）。
      9. サンプルが完全に樹脂に入ったら、4×1mLのBuffer QCでカラムを洗浄する。
      10. 清潔な2 mLの低結合マイクロ遠心チューブにカラムを懸濁する。 50℃であらかじめ温めた0.8 mLのBuffer QFでゲノムDNAを溶出する。
      11. 溶出したDNAに0.56mL（0.7容量の溶出バッファー）の室温イソプロパノールを加えてDNAを沈殿させます。
      12. 逆転（10X）して混合し、すぐに15,000×gおよび4℃で20分間遠心分離する。お手入れゆるく付着したペレットを妨害することなく上清を完全に除去する。
      13. 冷たい70％エタノール1mLで遠心分離したDNAペレットを洗浄する。 15,000 xgおよび4℃で10分間遠心分離する。
      14. ペレットを乱すことなく上清を注意深く除去する（このステップでも注意する）。 5〜10分間空気乾燥させ、0.1mLの溶出緩衝液（EB）にDNAを再懸濁する。 DNAを室温で一晩溶解させる。 DNAを剪断するピペッティングは避けてください。
      15. 高感度のDNA定量アッセイを使用してサンプルを定量する（製造者の指示に従う）。
2. メチル化および非メチル化DNAのビーズに基づく分画
   注：最近の刊行物は、ヒトIgG Fc断片（MBD2-Fcタンパク質）に融合されたCpG特異的メチル結合ドメインタンパク質を利用して、分画するプルダウンアプローチを利用する市販のキット²⁸の使用を示した核ゲノム（高度にメチル化された）含量から植物オルガネラゲノム（非メチル化）を食べた²³ 。コムギ試料中の分画効率は、この市販のMFキット²⁸を用いて以前に試験されなかった。
   1. 開始前のこと
      1. 80％エタノール（反応あたり少なくとも800μL）を新鮮に調製する。氷上で解凍するために5x結合/洗浄緩衝液をセットし、サンプルあたり1x緩衝液5mLを調製する（無菌のヌクレアーゼフリー水で5倍に希釈し、プロトコール中に氷上に保つ）。
   2. MBD2-Fcタンパク質結合磁気ビーズを調製する
      1. 必要数のビーズセットを準備します。 1〜2μgの全入力DNAを使用するように反応をスケールすると、160〜320μLのビーズが必要です。下に列挙した反応は1μgの全入力DNAに対応するため、160μLのビーズが必要であることに注意してください。必要に応じて反応を拡大します。
      2. ワイドボアのチップを使用して、Protein A Magnetic B均一な懸濁液を作るためにスラリーを上下させる。代わりに、4℃で15分間ビーズのチューブを静かに回転させます。
         注：ビーズをボルテックスしないでください。
      3. メーカーの説明書²⁸あたりの方向に進みます。
   3. メチル化された核DNAを捕獲する
      1. 個々のサンプルについて、1μgの入力DNAを160μLのMBD2-Fc結合磁気ビーズを含むチューブに加える。
      2. 最終濃度が1x（添加する5倍の結合/洗浄緩衝液の容量（μL）=入力DNAの容量（μL）/ 4）になるようにDNA入力試料の容量を考慮して、必要に応じて5x結合/洗浄緩衝液を加える。サンプルを数回上下にピペットし、ワイドボアピペットチップを使用して混合します。
      3. チューブを室温で15分間回転させる。サンプルをゆっくりとワイドボアピペットチップでピペットにかけ、ビーズ凝集を防ぐためにインキュベーション中2〜3回サンプルをフリックします。
         注：ピペッティングとフリッキーメチル化DNAの効率的なプルダウンを確実にするために重要である。
   4. 豊富な非メチル化オルガネラDNAを集める
      1. DNAおよびMBD2-Fc結合磁気ビーズ混合物を含むチューブを短時間スピンさせる。チューブを磁気ラックに少なくとも5分間置いてビーズをチューブの側面に集める。その解決策は明確に見えるはずです。
      2. ワイドボアのチップを使用して、ビーズを乱すことなく清澄な上清を注意深く取り除きます。上清（メチル化されていないオルガネラが豊富なDNAが含まれています）を清潔で低結合の2mL微量遠心チューブに移します。このサンプルを-20℃または-80℃で保存するか、精製のためにステップ3.2.6に直接進んでください。
   5. MBD2-Fc結合磁気ビーズからの核DNAの捕獲
      1. 核分画もまた望むならば、MBD2-Fc結合磁性ビーズから核DNAを溶出させるために製造業者の説明書²⁸に従う;ステップ3.2.7で説明したように精製する。
   6. ビーズベースの核酸精製
      1. 精製ビーズが室温で、完全に混合されていることを確認してください。 MFキットのマニュアル^28の手順に従ってプロトコールを進めてください。
         注：このサンプルは、NGSライブラリー構築または別の下流解析に使用できるようになりました。

4.サンプル定量および品質管理

1. オルガネラ濃縮を評価するためのqPCRアッセイ
   注記：ここに記載されたqPCR反応およびアッセイパラメーターは、R​​oche LightCycler 480での使用のために設計されており、さまざまな機器および試薬に合わせて調整する必要があります。 qPCRが利用できない場合、エンドポイントPCRおよびアガロースゲル上での可視化を、本明細書に記載されたのと同じプライマーおよび条件を使用して、サンプル純度の定性的尺度として使用することができる。アンプリコンのサイズはすべてのプライマーセットに対して〜150 bpになります。プライマーシーケンシングについては表3を参照セックスとペアリング。
   1. qPCR反応セットアップ
      1. 20μLのqPCR反応を個別に設定するには、96ウェルqPCRプレートの1つのウェルに次のものを慎重にピペットで入れます：10μLの2x SYBR Green I Master; 2μLの10μMフォワードおよびリバースプライマーミックス（0.5μMの最終濃度用）。鋳型2μL（標準曲線の範囲内）。 6μLの滅菌ヌクレアーゼフリーH ₂ Oを含む。ピペッティング誤差を減らすために、テンプレートを除くすべての反応成分を含むマスターミックスを作製することが好ましい。 qPCRプレートにマスターミックスを添加し、目的のテンプレートを各ウェルに添加する。ピペッティングエラーの影響を最小限に抑えるために、各サンプルについて3回の技術的複製を行う必要があります。
         注：最終的には、核と細胞小器官の定量サイクルの比がサンプル間で比較されるため、濃度のわずかな差は許容されます。しかし、DNA濃度はおよそeach。
      2. 高品質のqPCRシーリング・フィルムでシートをシールします。サンプルを静かにボルテックスし、気泡の発生を避けるよう注意してください。簡単に4℃で2分間プレートを回転させてサンプルを集め、小さな泡を除去する。
      3. プレートを機械にセットします。下記のガイドラインに従ってqPCRプログラムを実行してください。
   2. qPCR反応パラメーター
      注：これらは、増幅ステージのアニールサイクルを除いて、デフォルトのパラメータです。使用するプライマーが本プロトコールで提示されているプラ​​イマーと異なる場合は、この設定を調整して特定のプライマーに対応させます。
      1. 95℃で5分間、4.4℃/ sの上昇率でプレインキュベートする。
      2. 4.4℃/ sの上昇率で、（1）95℃で10秒間45回の増幅サイクルを実施する。 （2）20℃で60℃、2.2℃/ sのランプ速度; （3）72℃10秒間、4.4℃/ sの上昇率（（3）で得られたデータ）。
      3. オプティオを使用する4.4℃/ sのランプ速度で5秒間95℃の融解曲線サイクル; 65℃で1分間、2.2℃/ sのランプ速度;および97℃、連続取得モード。
      4. 40°Cの冷却サイクルを30秒間、1.5°C / sのランプ速度で使用してください。
   3. アッセイパラメータ
      1. SYBRテンプレートを選択します。実験ボタンでプログラムのパラメータを確認します。プレートがロードされると、アッセイを開始することができ、アッセイが実行されている間、設定を調整することができる。
      2. サンプルエディタを使用してサンプルを割り当てます。 Abs Quantをワークフローとして選択し、サンプルを未知、標準、または陰性対照として指定します。レプリケートを指定し、各レプリケートの最初のサンプル名を記入します。濃度と単位を基準に加える。
      3. 分析のためのサブセットを設定する。これらはサブセットエディタで割り当てられます。
      4. 分析するには、「新規分析の作成」リストからAbs Quant / 2nd Derivative Maxを選択します。外部保存された標準曲線をインポートし（該当する場合）、次に計算を押します。レポートには選択した情報が含まれます。
      5. コピー数または濃度の決定のための正確な絶対定量を行うためには、試験されているサンプル（ 例えば、上記の方法から単離されたオルガネラDNA）を代表する標準曲線を使用する。標準曲線を作成するために必要なミトコンドリアDNAの量は、妥当な量の組織で達成するには高すぎるため、ソフトウェアによって提供されるコピー数計算を利用せず、クロスポイント（Cp）値を調べて相対濃縮を決定するサンプル中の核DNAと比較してオルガネラの存在を示している。これらの相対量を全ゲノムDNAの相対量と比較する（ 代表的結果参照）。完全に軽く増殖した2週齢コムギ苗からの全ゲノムDNAの5倍の1:10希釈物に対するプライマーの効率を試験する（代表的な効率は、図2の伝説）。
2. パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）
   注：このプロトコールは、高分子量DNAを分解するためにPFGEを実施する製造業者のガイドラインに基づいています。 材料表を参照してください。
   1. ゲルとサンプルの準備
      1. ゲルとサンプルの準備に関するガイドラインに従って、利用可能なシステムに合わせてください。
   2. パラメータを実行する
      1. 電気泳動システムを設定するためのガイドラインに従い、初期スイッチ時間2秒、最終スイッチ時間13秒、ランタイム15時間16分、V / cm 6、および120°の夾角。
   3. ゲルの汚れと画像
      1. 選択した色素（ 例えば、エチジウムブロマイドまたは適切な代替物）でゲルを染色し、適切なゲルドキュメンテーションシステムで画像化する。
4. 製造元の指示に従って、DNA Library Prep Kitの入力として1 ngのDNAを使用してください。
5. 1回の操作でシーケンシング用のバーコードとサンプルをプールします。製造元のガイドラインに従ってシーケンシングを行います。
   注：プーリングおよびシーケンシングパラメータは、目的の種、所望のカバレッジレベル、およびライブラリーの配列に使用されるプラットフォームに応じて変更することができます。例えば、HiSeqレーンはMiSeqレーンより実質的に多くの出力を有するので、より多くのサンプルを多重化することができる。オルガネラゲノムのカバレッジレベルが下流分析に適しているかどうかを判断するために、サンプルのより小さなサブセットをシーケンスします。
6. FastQC ³¹を使用して読み取り品質を調べ、データに必要なトリミングとフィルタリングの程度を判断します。
7. Trimmomatic ³²または他の同等のプログラムを使用して未加工の読み込みをトリムおよびフィルタリングします。次の設定を使用してください：ILLUMINACLIP 2:30:10（アダプターを取り外すため）、3回、3回、SLIDINGWINDOW4：10、およびMINLEN 100。
8. 、品質濾過およびアダプタートリミングペアエンド（PE）は、中国のスプリングミトコンドリア（NCBI参照配列NC_007579.1 ^33）、葉緑体（NCBI参照配列NC_002762.1 ^34）、及びBowtie2 ^36を用いて、核^35の参照ゲノムに読み出す地図-I 0 -X 800 - sensitiveと設定します。
9. samアラインメントファイルをbam形式（samtools）に変換し、bamファイルをソートします。 bamファイルを使用して、ベッドツールでゲノム全体のカバレッジとベースごとのカバレッジを計算します。 R-プロット関数を使用して結果を視覚化します。

結果

この原稿で提示されたプロトコルは、植物組織からオルガネラDNAを富化するための2つの異なる方法を記載している。ここに示した条件は、小麦組織の最適化を反映しています。プロトコルの重要なステップ、必要な組織入力、およびDNA出力の比較を図1に示します。我々がテストしたDCプロトコールのステップは、以前に記載されたものと同様の条件に従う（ 図1A ）。収穫された組織は、新たに処理され、インタクトな細胞小器官を単離するために示差遠心分離および/または勾配に供されなければならない。オルガネラが溶解される前に核DNAが除去され、最後にDNAが抽出され、下流の用途に使用される。対照的に、MFプロトコルでは、使用前に植物組織を採取して保存することができ、完全な細胞小器官は不要である。その代わりに、核および細胞小器官のDNAは、 DNAのメチル化状態。両方のプロトコールは、ほぼ同量の細胞小器官DNAを産生する（ 図1C

ディスカッション

今日まで、ほとんどのオルガネラ配列研究は、特定のDNAを豊富にする伝統的なDC法を中心に研究しています。モス⁴⁰を含む多様な植物からオルガネラを単離する方法が記載されている。小麦¹⁵および小麦¹¹などの単子葉植物;アラビドプシス¹¹ 、ヒマワリ¹⁷ 、ナタネ¹⁴などの双子葉植物が挙げられる。ほとんどのプロトコルは、いくつかの種子¹¹を含む組織型の種々のために適合されたもので、葉組織^{13、14、15、16、17...}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール(β-メルカプトエタノール;BME)	Sigma Aldrich	M3148-100ml
2-プロパノール (イソプロピルアルコール/イソプロパノール)、バイオ試薬	Sigma Aldrich	I9516
アガロース、Bio-Rad Cetified Megabase アガロース	Bio-Rad	1613108 分析
天びん	メトラー・トレド	AB54-S
天びん	Mettler Toledo	PB1502-S
ウシ血清アルブミン(BSA)	Sigma Aldrich	B4287-25G
セラミック粉砕シリンダー、3/8インチ x 7/8インチ	SPEX SamplePrep	2183
50 mLチューブを保持するための組織ホモジナイザーと互換性のある極低温ブロック	SPEX SamplePrep	2664
DNaseI	Sigma	DN25
エタノール、絶対	Decon Laboratories	2716
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.5 M溶液、pH 8.0	Fisher	BP2482-500
イメージングシステム
ゲル			GelRedや臭化エチジウム
粉砕乳棒、2 mLコニカルチューブ
グアニジン-HCl、8 M溶液	ThermoFisher	24115
LightCycler 480 SYBR)Green I Master	Roche	4707516001
液体窒素
Trichoderma harzianum	Sigma	L1412
塩化マグネシウム	G Bioscience	24115
磁気ラック	ThermoFisher	A13346
微量遠心チューブ、LoBind 1.5 mL	Eppendorf	22431021
微量遠心チューブ、標準的なヌクレアーゼフリー1.5 mL	Eppendorf
微量遠心分離機、冷蔵	Sorvall	Legend X1R	または同等の製品は、50 mLチューブ、Oak Ridgeチューブ、および1.5 mLチューブのマイクロ
遠心分離機、室温	のEppendorf	5424	または同等の製品用のローターで少なくとも18,000 x gに達することができる必要があります1.5 mLおよび2 mLのマイクロ遠心チューブ用のローターで少なくとも18,000 x gに達することができる必要があります
Microcon DNA高速フロー遠心フィルターユニット	EMDミリポア	MRCFOR100
ミラクロス、漏斗に合うようにカットされたサンプルあたり1平方	EMD ミリポア	475855
NEBネクストマイクロバイオーム DNAエンリッチメントキット	ニューイングランドバイオラボ	E2612L
パラフィルム	パラフィルム M	PM992
プラスチックポットとトレイ
ポリビニルピロリドン (PVP)	フィッシャー	BP431-100
プロテイナーゼ K	キアゲン	19131
パルスフィールドゲル電気泳動装置 (CHEF DR III など) バイオ	・ラッド	1703697
精製ビーズ、Agencourt AMpureXP ビーズ	ベックマン・コールター	A63881
QIAamp DNA ミニキット	Qiagen	51304
Qiagen 20/g ゲノムチップ DNA 抽出キット	Qiagen	10223
Qiagen バッファー EB (溶出バッファー)	Qiagen	19086
Qiagen DNA抽出バッファーセット	Qiagen	19060
QiaRack	Qiagen	19015
qPCRマシン(例:Roche Light Cycler 480)	Roche
qPCRプレートシーリングフィルム	Roche	4729757001
qPCRプレート、96ウェルプレート	Roche	4729692001
量子ビット アッセイチューブ	ライフテクノロジー	Q32856
キュービットブロードスペクトラムアッセイキット	ライフテクノロジー	ズ Q32850
キュービット高感度アッセイキット	ライフテクノロジー	ズ Q32851
RNaseA	Qiagen	19101
血清ピペット(20 mL)およびピペットエイド	フィッシャー	13-678-11
小さな漏斗、サンプルごとに1つ
塩化ナトリウム	ビオン	AM9759
ソフトペイントブラシ、サンプル
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinderまたは別のタイプの組織ホモジナイザー	SPEX SamplePrep		または別の同等の組織ホモジナイザー。ティッシュホモジナイザーを利用できない場合は、事前に冷却した乳鉢と乳棒で粉砕するだけで十分です(詳細については、プロトコルを参照してください)。ただし、ホモジナイザーを使用すると、より一貫した結果が得られ、総均質化時間が短縮されます。
スクロース	オムニピュア	8550
TBE
サーモミキサー
トリス	シグマ	T2819-100ml
トリトン X-100	プロメガ	H5142
チューブ ローテーラー
チューブ、50 mL 円錐形ポリプロピレン	コーニング	352070
チューブ、50 mL高速ポリプロピレン	ThermoScientific/Nalgene	3119-0050	例:Nalgene Oakridgeチューブまたは同等の
バーミキュライト
水浴
水、滅菌済みでヌクレアーゼフリーの認定水	フィ	ッシャー1481
水、滅菌ミリQ