インビトロイメージングと蛍光標識のGnRH類似体の薬物ターゲティング効率の定量化で

サマリー

選択的に標識された蛍光のGnRH-I、-IIおよび-III誘導体は、それらの細胞への取り込みを追跡し、定量化するための信頼性の高いツールです。本稿では、可視化、定量化、および種々の細胞株におけるこれらのGnRHの結合体の取り込み効率を比較するための実験を紹介します。

要約

GnRH類似体は、ターゲティング部分、効果的かつ高度にGnRH受容体を発現する悪性腫瘍細胞に選択的に抗癌剤を送達することができます。しかしながら、GnRH類似体」細胞取り込みの定量分析とのGnRHに基づく薬物送達系で調べた細胞型は現在制限されています。先に紹介した、選択的に標識された蛍光のGnRH I、-IIおよび-III誘導体は素晴らしい検出性を提供し、彼らは再現性と堅牢な実験に適した化学的特性を有しています。我々はまた、これらの標識されたGnRH類似体との適切な最新の方法は、のGnRHに基づく薬物送達システムに関する新たな情報を提供できることを見出しました。 GnRH-I、[D-Lysの^6（FITC）] - -のGnRH-IIおよび[Lysの^8（FITC）] -のGnRHこの原稿は、[D-Lysの^6（FITC）]の細胞への取り込みに関するいくつかの簡単かつ迅速に実験を紹介しますEBC-1（肺）に-III、たBxPC-3（膵臓）、デトロイト-562-（咽頭）に悪性トンumor細胞。これらのGnRH-FITCコンジュゲートと並行して、のGnRH-I受容体の細胞表面レベルはまた、共焦点レーザー走査顕微鏡でのGnRH処理前後のこれらの細胞系で調べました。 GnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みは、蛍光活性化細胞ソーティングにより定量しました。これらの実験でのGnRH類似体および細胞型間の主な相違点間のわずかな違いが観察されました。細胞株の間で有意差は、細胞表面のGnRH-I受容体のそれらの異なるレベルと相関しています。導入された実験では、可視化、定量化、およびさまざまな接着細胞培養物に対する時間および濃度依存的にのGnRH-FITC複合体の取り込み効率を比較するために実用的なメソッドが含まれています。これらの結果は、与えられた細胞培養上のGnRH結合体の薬物ターゲティング効率を予測し、のGnRHに基づく薬物送達システムの検査でさらなる実験のための良い基盤を提供することができます。

概要

ペプチドに基づく標的化薬物送達システムは、過去数年^1、2にわたって癌治療で急速に発展し、有望な領域となっています。ヒトゴナドトロピン放出ホルモン受容体I型（たGnRH-IR）は、主に脳下垂体に位置するだけでなく、自己再生³を担当しているいくつかの他の組織中に存在します。 GnRH-IRはまた、生殖系^4,5に関連または関係のない、癌組織の数で表されます。健常組織と比較して、いくつかの悪性腫瘍細胞上のGnRH-IRの高発現は、標的治療^5、6のための機会を提供しています。

多くのゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）類似体は、標的化部分として使用することができる最後の数十年に開発されていますF "> ^7、8、9。これらのペプチドは、その過剰発現のGnRH-IR ⁶悪性腫瘍細胞に選択性の高い抗がん剤を送達することができます。対応する非コンジュゲートよりも高い選択性と優れた効率性を有するいくつかのGnRH結合抗腫瘍薬遊離薬物は^{、7、8、9を}報告されています。

GnRHペプチドとその受容体についての前の出版物はのGnRH-IRはのGnRHは^10を類似体に対して異なる選択性を有する様々な立体配座をとることができることを報告しました。非常に可変性のGnRH-IRは、複雑で多様なシグナル伝達経路は、それらの天然と人工のリガンド¹¹に対して異なるアクティビティに恵まれているしています。これらの事実は挑戦のGnRHベースのシステムの調査を行います。一方、 Yは、有望な治療可能性を有します。放射性標識のGnRHペプチドといくつかの実験は、以前に^{12、13、14、15に}報告されたが、蛍光標識されたGnRH類似体が使用された実験はまだ限られている。し放射性標識は高感度を提供していますが、蛍光標識は、いくつかの他の利点、例えば扱いやすく、かつ異なる蛍光体で対比染色する能力を持っています。正常薬物送達のために使用されている3つの一般的なGnRH類似体は、ターゲティング部分として、[D-Lysで^6] -GnRH-I、[D-Lysで^6] -GnRH-IIとのGnRH-III、これらのペプチドの有効性であるですめったに^16、17を比較しません。一方、別の癌細胞およびGnRH類似体が使用された別個の実験からの結果は、多様です。

これらの考察に基づいてntentは">は、これらのGnRHペプチドの腫瘍標的薬物送達の可能性に焦点を当て、それによって合成し、[D-Lysの^6（FITC）]特徴付け-のGnRH-I、[D-Lysの^6（FITCを）] -のGnRH-IIおよび[Lysの^8（FITC）] -のGnRH-IIIペプチド結合体¹⁸これらの類似体が選択的にLysまたはD-Lysの側鎖（ペプチド-FITC比1にFITCで標識されています。それぞれに1。コンジュゲート）。アイデアは、選択的蛍光標識は、これらのペプチドについての新たな情報を提供し、それらの良好なトラッキングと信頼性の定量化を可能にすることができるということでした。これらのコンジュゲートは、それが簡単に彼らの腫瘍標的効率を比較することを可能にする安全な取り扱いと信頼性の高い検出能を、持っている、と悪性腫瘍細胞の多くのタイプのスクリーニング。我々は、これらのペプチド複合体とアップへの日付の実験はのGnRH - 薬物複合体を標的とする新たな癌の発展に貢献し、新たな治療タールを識別するために助けることができることを願っています同様になります。

現在の原稿はのGnRH-FITCコンジュゲートといくつかのよく再現性と高速実験を示しています。 GnRH-Rの細胞表面発現は、したがって、我々は、同時に試験した細胞株でのGnRH-IRの細胞表面レベルを調べ、のGnRH取り込みに関して決定的な条件です。我々は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によってのGnRH-IRとのGnRH-FITC複合体を可視化し、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いたGnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みを定量化しました。

プロトコル

細胞培養および試薬の調製

1. 10％（v / v）のウシ胎児血清および抗生物質（と呼ばれる完全培地）を補充し、製造業者の推奨する培地中で細胞培養物を維持します。 37℃で加湿し、5％CO ₂雰囲気のインキュベーター中で細胞培養フラスコを保管してください。 （10X位相差対物レンズを使用して）倒立顕微鏡で細胞の増殖および密集度に従ってください。
2. 細胞が適切なコンフルエンシーに達したとき、培地を除去し、2-3 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で培養物を洗浄します。 PBSを削除し、細胞培養物に0.5 mLを、無菌の0.25％トリプシン-EDTA溶液を追加し、細胞が（約10分）を切り離すまで37℃でインキュベートします。
3. トリプシンを停止し、滅菌遠心管にそれらを転送するために3-4 mLの滅菌、完全培地中の細胞を一時停止します。室温（RT）で4分間、150×gで細胞を遠心します。慎重に上清を捨て、Pを一時停止2-3 mLの滅菌完全培地中でエレト。
4. 100μLの細胞懸濁液を取り出し、100μLの0.4％（M / V）トリパンブルー溶液と混合し、死細胞を染色します。血球計数器にロードし、この混合物の10μLをし、倒立顕微鏡により生細胞の数を決定します。
5. 4×10 ⁴細胞/ mLを含む無菌の完全培地で10 mLにステップ1.3で調製した細胞懸濁液の必要量を、希釈します。
6. 第一のガラス底8ウェル顕微鏡スライドの7ウェルにウェル当たり（ステップ1.5で調製した）細胞懸濁液250μLを加える（10 ⁴細胞/ウェル）。 GnRH取り込み方法でこのスライドを使用してください。
7. 第8ウェル顕微鏡スライドの5ウェルにウェル当たり（ステップ1.5で調製した）細胞懸濁液250μLを加える（10 ⁴細胞/ウェル）。このスライドのGnRH-IR発現方法で使用されます。
8. 7 WELにウェル当たり（ステップ1.5で調製した）細胞懸濁液の1ミリリットル（4×10 ⁴細胞/ウェル）を追加します12ウェルプレートのLS。このプレートのGnRH定量方法に使用されます。
9. 細胞は、2つの顕微鏡スライドプレートに付着してみましょう。 48時間37℃で加湿5％CO ₂雰囲気のインキュベーター中でそれらを培養します。
10. インキュベーション後（10X位相差対物レンズを使用して）倒立顕微鏡で細胞を確認してください。細胞が健康で取り付けられている場合は、次の手順に進みます。
11. 3コンジュゲート¹⁸のそれぞれからのジメチルスルホキシド（DMSO）中の10mMのGnRH-FITCストック溶液を準備します。 （これらの希釈濃度を使用してください：16.43μgの/μL[D-Lysの^6（FITC）] -のGnRH-I、16.97μgの/μL[D-Lysの^6（FITC）] -のGnRH-II及び16.47μgの/μL[リス^8（ FITC）] - のGnRH-III）、室温で暗所でこれらのストック溶液を維持し、数週間以内にそれらを使用します。
12. 1.7μL1.7 mLの完全培地中で3の10mMのGnRH-FITCストック溶液のそれぞれを希釈します。これらのソリューションを振ります。 （THESeは、10μMのGnRH-FITCは、メディアを処理することがあります。）3、10μMのGnRH-FITCのそれぞれが1.35 mLの完全培地で培地を処理する150μLに希釈します。 （これらは1μMのGnRH-FITC媒体を治療している）だけでなく、これらのソリューションを振ります。
    注：処理培地を含むすべてのGnRH-FITCは、光から保護し、数時間以内に使い切るべきです。
13. 37°Cまでの6のGnRH-FITC処理培地（ステップ1.12で調製した）および4 mLの完全培地を予熱。
14. 5μMに3 mLのPBS中の5mMの3μL蛍光プローブ溶液（物質一覧に記載された核の対比）を希釈します。この溶液を室温でそれを維持し、数時間以内にそれを使用し、光から保護されるべきです。

2.共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）

1. GnRH取り込み方法
   1. ステップ1.6で調製した第1顕微鏡のスライドを取り、よく7のそれぞれから完全培地をピペット。予熱完了メディの250μLを追加umの最初のウェルに。ネガティブコントロールとして、これを使用してください。次の6ウェル（10μMと1μMおよび3で3ウェル）のそれぞれに（1.13から）メディアを治療予熱したGnRH-FITCの250μLを追加します。 5時間37℃で加湿し、5％CO ₂雰囲気のインキュベーター中でスライドをインキュベートします。
   2. 各ウェルから培地をピペットで250μLのPBSで細胞を洗浄。 10分間、各ウェルに固定液（10％中性緩衝ホルマリン）の250μLを加え、室温でスライドをインキュベートします。
   3. 各ウェルからの定着液をピペットで250μLのPBSで細胞を洗浄。 10分間、各ウェルにステップ1.14で調製した5μM蛍光プローブ溶液を含むPBSの250μLを加え、室温でスライドをインキュベートします。
   4. 各ウェルからの蛍光プローブ溶液をピペットし、慎重に250μLのPBSで2回細胞を洗浄します。最後に、各ウェルに封入剤の3-4滴を追加します。イメージングまで、室温で暗所でスライドを保管してください。
2. GnRH-IR発現方法
   1. ステップ1.7で調製した第8ウェル顕微鏡スライドを取り、5ウェルのそれぞれから完全培地をピペット。
   2. この陰性対照として使用し、第一のウェルに予熱した完全培地の250μLを追加します。あまりにも第2のウェルに予熱した完全培地の250μLを追加し、のGnRH処理前のGnRH-IRの発現を調べるためにこれを使用します。
   3. 次の3つのウェルに250μL3予熱した10μMのGnRH-FITC治療メディアのそれぞれを追加します。 GnRH-IR発現を調べる前のGnRH-FITC結合体で細胞を前処理するためにこれらのウェルを使用してください。 1時間37℃で加湿し、5％CO ₂雰囲気のインキュベーター中でスライドをインキュベートします。
   4. GnRH治療後のGnRH-IRの発現を検査し、予熱した完全培地の250μLでこれらのウェルを洗浄するために使用される3つのウェルのそれぞれから治療培地をピペット。 250を追加します。3つのウェルのそれぞれに予熱した完全培地μL。 1時間37℃で加湿し、5％CO ₂雰囲気のインキュベーター中でスライドをインキュベートします。
   5. 5各ウェルから培地をピペットで250μLのPBSで細胞を洗浄。 10分間、各ウェルに固定溶液の250μLを加え、室温でスライドをインキュベートします。
   6. 各ウェルからの定着液をピペットのPBS 250μLで細胞を洗浄。各ウェルにブロッキング溶液を5％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS 250μLを加え、室温でスライドをインキュベートし、1時間。
   7. （：100比1）1 mLのPBS中のGnRH-IR一次抗体の10μLを希釈します。 RTでそれを維持し、数時間以内にそれを使用します。
   8. ネガティブコントロール（第一のウェル）を除く各ウェルからBSAブロッキング溶液をピペットで。 （陰性対照ウェルを除く）250μLのPBSで細胞を洗浄。 EACにステップ2.2.7で製造したGnRH-IR一次抗体を含むPBS250μLのを追加します。（ネガティブコントロールを除く）時間も。暗い場所で、1時間、室温でスライドをインキュベートします。
   9. （：500比1）1.25 mLのPBSでアレクサ546標識二次抗体の2.5μLに希釈します。
      注：このソリューションは、光から保護し、室温でそれを維持し、数時間以内にそれを使用する必要があります。
   10. 5ウェルのそれぞれのソリューションをピペット250μLのPBSで細胞を洗浄。各ウェルにステップ2.2.9で製造したAF 546標識二次抗体を含むPBS250μLのを追加します。暗所で1時間、室温でスライドをインキュベートします。
   11. 各ウェルからの溶液をピペットで250μLのPBSで細胞を洗浄。各ウェルにステップ1.14で調製した5μM蛍光プローブ溶液を含むPBSの250μLを加え、室温で、10分間、スライドをインキュベートします。
   12. 各ウェルからの蛍光プローブ溶液をピペットで、慎重に250μLのPBSで2回細胞を洗浄します。その後、各ウェルに取り付けメディアの3-4滴を追加します。暗所でスライドを保ちますRTで顕微鏡イメージングまで。
3. イメージング
   1. 画像（63X油浸対物レンズを使用して）、反転共焦点レーザー走査顕微鏡により細胞
      1. 以下の励起/発光波長を使用してください。 GnRH結合体：514分の488 nmで、アレクサ546標識抗体：546分の488 nmの（唯一のGnRH-IR表現方法のために使用）、DRAQ5蛍光プローブ：680分の633 nmの。
      2. 陰性対照細胞を用いた撮像パラメータを設定します。これらのパラメータは、画像処理した細胞（ 図3）に使用します。分析の開始時に各顕微鏡スライド上の撮像パラメータを再調整します。必要な場合は、メーカーが提供するソフトウェアとの微調整と輸出の画像。

3.蛍光活性化細胞選別（FACS）

1. GnRH定量法
   1. ステップ1.8で調製したプレートを取り、EAからの完全培地をピペット7井戸のCH。最初のウェルに予熱した完全培地の1 mLを加え。ネガティブコントロールとして、これを使用してください。追加1 mLの次の6ウェルに培地（1μMおよび10μMで3ウェルとの3ウェル）を治療する予熱6の各。 5時間37℃で加湿し、5％CO ₂雰囲気のインキュベーターでプレートをインキュベートします。
   2. 各ウェルから培地をピペット。慎重に2 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルにトリプシンEDTA溶液500μLを追加します。細胞は（約10分）デタッチするまで、37℃でプレートをインキュベートします。
   3. トリプシンを停止するには、各ウェルに、完全培地1mlを加えます。プレートを振ります。ピペットで穏やかに細胞を懸濁し、FACSチューブに各ウェルからサスペンションを転送します。 4℃で、4分間、150×gでチューブを遠心。
   4. 一手で、慎重に上清を注ぎます。各FACSチューブに氷冷PBSの500μLを加え、穏やかに細胞を再懸濁。最後まで氷上でチューブを保ちます実験の。
2. 分析と計算
   1. フローサイトメトリーにより細胞を分析します。励起のため、488nmのアルゴンレーザーの波長を使用して、検出のために530nmの波長を使用します。ネガティブコントロール細胞を実行することにより、パラメータフローサイトメーターを設定します。処理した細胞（ 図4A）を分析するためにこれらのパラメータを使用します。 、メーカーのソフトウェアを使用してデータを評価し、中央値蛍光強度（MFI）値を決定し、相対的なMFI値を計算します。

結果

共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によって得られた画像は、時間および濃度依存的な様式で与えられた細胞培養上のGnRH-FITC複合体の取り込みについての見事な情報を提供します。これらのGnRH-FITCコンジュゲートと並行して、細胞表面上のGnRH-IRの存在は、CLSM実験によって検証可能です。また、遠赤DNA染色の蛍光プローブを用いることにより、のGnRHとのGnRH-IR以外の細胞の核を対比染色することが可能です。共焦点画像は、定量化はないがしかし、単純な「のGnRH取り込み方法は、「容易に試験された細胞は、のGnRH-FITCコンジュゲートのより高いまたはより低い量を含むかどうかを推定することができます。必要に応じて適用されたGnRH-FITC複合体、それらの濃度、および治療の時間は、この方法では可変です。 図1に示すように、異なる癌細胞は濃度依存的様式でのGnRH-FITCの異なるレベルを含みます。

高度な "のGnRH-IRの発現方法は、「前とのGnRH-FITC処理後、免疫細胞化学により、細胞表面のGnRH-IRの...

ディスカッション

本明細書に記載した実験は、付着スクリーニングするために選択的に標識されたGnRH類似体を使用します インビトロでの細胞培養物。共焦点顕微鏡および方法は追跡と時間および濃度依存的にこれらのGnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みを定量化するのに適しているフローサイトメトリー。これらの実験は、以下の重要なステップがあります：1）無菌、健康な細胞培養を維持します。 2）のGnRHペプチドは、高品質のものでなければなりません。 3）合理的な濃度およびインキュベーション時間に従わなければなりません。 4）処理及び洗浄工程; 5）機器の設定をよく調整しました。

細胞を、10％（V / V）ウシ胎児血清および抗生物質（完全培地）を補充し、製造業者の推奨培地中で維持されています。細胞は（たGnRH-FITCコンジュゲートでの）処理工程まで保持し、無菌環境で処理する必要があります。実験の前に、倒立顕微鏡を用いて細胞を確認してください。彼らは健康でなければなりません、取り付けられており、必要な量に到達しなければなりません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	ヒト肺扁平上皮がん
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	ヒト膵臓腺がん
Detroit-562	ATCC	CCL-138	ヒト咽頭がん
RPMI-1640 L-グルタミン含有培地	Lonza	BE12-702F	BxPC-3細胞用培地
イーグルスミニマムエッセンシャル培地	ロンザ	BE12-611F	EBC-1細胞用の培養培地、およびデトロイト-562細胞用の0.1%ピルビン酸ナトリウムで補完
シ胎児血清	ユーロクローン	ECS0180L	培地
MycoZap Plus-CL を	ロンザ	VZA-2012	は、培地(抗生物質)を補完します標準
ライン細胞培養フラスコVWR		10062-872	に一貫した無菌成長環境を提供します
。	ロンザ	BE17-161E	付着細胞の除去
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	ロンザ	BE17-516F	溶剤
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	溶剤
トリパンブルー溶液、0.4%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061	のカウントに使用
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	製	-	純度 ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	当社製	-	純度 ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	当社製	-	純度 ≥98% (HPLC)
ガラス底 8 ウェル顕微鏡スライド	Ibidi	80826	CLSM 実験での使用
Corning Costar 細胞培養プレート、12 ウェル	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	FACS 実験での使用
固定溶液 (10% 中性緩衝ホルマリン)	Bio-Optica	01V60P	接着細胞
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A7906-10G	抗体の非特異的結合を防ぐ
GnRHR 抗体	Proteintech	19950-1-AP	免疫細胞化学試薬、ヒト I型 GnRH 受容体に結合
二次抗体、Alexa Fluor 546 コンジュゲート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A11035	免疫細胞化学試薬、一次抗体に結合
蛍光プローブ溶液 (Draq5)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	62254	対比染色核
フルオロマウント 水性封入剤	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	CLSM実験に使用し、蛍光を保持
倒立顕微鏡	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	細胞培養の表現型とコンフルエンシーをチェック
逆共焦点レーザー走査型顕微鏡	Zeiss	LSM-710	CLSM実験での使用
フローサイトメーター	BD Biosciences	BD FACSCalibur	FACS実験での使用