選択的に標識された蛍光のGnRH-I、-IIおよび-III誘導体は、それらの細胞への取り込みを追跡し、定量化するための信頼性の高いツールです。本稿では、可視化、定量化、および種々の細胞株におけるこれらのGnRHの結合体の取り込み効率を比較するための実験を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
GnRH類似体は、ターゲティング部分、効果的かつ高度にGnRH受容体を発現する悪性腫瘍細胞に選択的に抗癌剤を送達することができます。しかしながら、GnRH類似体」細胞取り込みの定量分析とのGnRHに基づく薬物送達系で調べた細胞型は現在制限されています。先に紹介した、選択的に標識された蛍光のGnRH I、-IIおよび-III誘導体は素晴らしい検出性を提供し、彼らは再現性と堅牢な実験に適した化学的特性を有しています。我々はまた、これらの標識されたGnRH類似体との適切な最新の方法は、のGnRHに基づく薬物送達システムに関する新たな情報を提供できることを見出しました。 GnRH-I、[D-Lysの6（FITC）] - -のGnRH-IIおよび[Lysの8（FITC）] -のGnRHこの原稿は、[D-Lysの6（FITC）]の細胞への取り込みに関するいくつかの簡単かつ迅速に実験を紹介しますEBC-1（肺）に-III、たBxPC-3（膵臓）、デトロイト-562-（咽頭）に悪性トンumor細胞。これらのGnRH-FITCコンジュゲートと並行して、のGnRH-I受容体の細胞表面レベルはまた、共焦点レーザー走査顕微鏡でのGnRH処理前後のこれらの細胞系で調べました。 GnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みは、蛍光活性化細胞ソーティングにより定量しました。これらの実験でのGnRH類似体および細胞型間の主な相違点間のわずかな違いが観察されました。細胞株の間で有意差は、細胞表面のGnRH-I受容体のそれらの異なるレベルと相関しています。導入された実験では、可視化、定量化、およびさまざまな接着細胞培養物に対する時間および濃度依存的にのGnRH-FITC複合体の取り込み効率を比較するために実用的なメソッドが含まれています。これらの結果は、与えられた細胞培養上のGnRH結合体の薬物ターゲティング効率を予測し、のGnRHに基づく薬物送達システムの検査でさらなる実験のための良い基盤を提供することができます。
概要
ペプチドに基づく標的化薬物送達システムは、過去数年1、2にわたって癌治療で急速に発展し、有望な領域となっています。ヒトゴナドトロピン放出ホルモン受容体I型（たGnRH-IR）は、主に脳下垂体に位置するだけでなく、自己再生3を担当しているいくつかの他の組織中に存在します。 GnRH-IRはまた、生殖系4,5に関連または関係のない、癌組織の数で表されます。健常組織と比較して、いくつかの悪性腫瘍細胞上のGnRH-IRの高発現は、標的治療5、6のための機会を提供しています。
多くのゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）類似体は、標的化部分として使用することができる最後の数十年に開発されていますF "> 7、8、9。これらのペプチドは、その過剰発現のGnRH-IR 6悪性腫瘍細胞に選択性の高い抗....
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プロトコル
細胞培養および試薬の調製
- 10％（v / v）のウシ胎児血清および抗生物質（と呼ばれる完全培地）を補充し、製造業者の推奨する培地中で細胞培養物を維持します。 37℃で加湿し、5％CO 2雰囲気のインキュベーター中で細胞培養フラスコを保管してください。 （10X位相差対物レンズを使用して）倒立顕微鏡で細胞の増殖および密集度に従ってください。
- 細胞が適切なコンフルエンシーに達したとき、培地を除去し、2-3 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で培養物を洗浄します。 PBSを削除し、細胞培養物に0.5 mLを、無菌の0.25％トリプシン-EDTA溶液を追加し、細胞が（約10分）を切り離すまで37℃でインキュベートします。
- トリプシンを停止し、滅菌遠心管にそれらを転送するために3-4 mLの滅菌、完全培地中の細胞を一時停止します。室温（RT）で4分間、150×gで細胞を遠心します。慎重に上清を捨て、Pを一時停止2-3 mLの滅菌完全培地中でエレト。
- 100μLの細胞懸濁液を取り出し、100μLの0.4％（M / V）トリパンブルー溶液と混合し、死細胞を染色します。血球計数器にロードし、この混合物の10μLをし、倒立顕微鏡により生細胞の数を決定します。
- 4×10 4細胞/ mLを含む無菌の完全培地で10 mLにステップ1.3で調製した細胞懸濁液の必要量を、希釈します。
- 第一のガラス....
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結果
共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によって得られた画像は、時間および濃度依存的な様式で与えられた細胞培養上のGnRH-FITC複合体の取り込みについての見事な情報を提供します。これらのGnRH-FITCコンジュゲートと並行して、細胞表面上のGnRH-IRの存在は、CLSM実験によって検証可能です。また、遠赤DNA染色の蛍光プローブを用いることにより、のGnRHとのGnRH-IR以外の細胞の核を対比染色することが可能です。共焦点画像は、定量化はないがしかし、単純な「のGnRH取り込み方法は、「容易に試験された細胞は、のGnRH-FITCコンジュゲートのより高いまたはより低い量を含むかどうかを推定することができます。必要に応じて適用されたGnRH-FITC複合体、それらの濃度、および治療の時間は、この方法では可変です。 図1に示すように、異なる癌細胞は濃度依存的様式でのGnRH-FITCの異なるレベルを含みます。
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ディスカッション
本明細書に記載した実験は、付着スクリーニングするために選択的に標識されたGnRH類似体を使用します インビトロでの細胞培養物。共焦点顕微鏡および方法は追跡と時間および濃度依存的にこれらのGnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みを定量化するのに適しているフローサイトメトリー。これらの実験は、以下の重要なステップがあります：1）無菌、健康な細胞培養を維持します。 2）のGnRHペプチドは、高品質のものでなければなりません。 3）合理的な濃度およびインキュベーション時間に従わなければなりません。 4）処理及び洗浄工程; 5）機器の設定をよく調整しました。
細胞を、10％（V / V）ウシ胎児血清および抗生物質（完全培地）を補充し、製造業者の推奨培地中で維持されています。細胞は（たGnRH-FITCコンジュゲートでの）処理工程まで保持し、無菌環境で処理する必要があります。実験の前に、倒立顕微鏡を用いて細胞を確認してください。彼らは健康でなければなりません、取り付けられており、必要な量に到達しなければなりません。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
プロジェクトは国立研究基金OTKA（K 104045）の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | ヒト肺扁平上皮がん |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | ヒト膵臓腺がん |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | ヒト咽頭がん |
| RPMI-1640 L-グルタミン含有培地 | Lonza | BE12-702F | BxPC-3細胞用培地 |
| イーグルスミニマムエッセンシャル培地 | ロンザ | BE12-611F | EBC-1細胞用の培養培地、およびデトロイト-562細胞用の0.1%ピルビン酸ナトリウムで補完 |
| シ胎児血清 | ユーロクローン | ECS0180L | 培地 |
| MycoZap Plus-CL を | ロンザ | VZA-2012 | は、培地(抗生物質)を補完します標準 |
| ライン細胞培養フラスコVWR | 10062-872 | に一貫した無菌成長環境を提供します | |
| 。 | ロンザ | BE17-161E | 付着細胞の除去 |
| リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) | ロンザ | BE17-516F | 溶剤 |
| ジメチルスルホキシド | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | 溶剤 |
| トリパンブルー溶液、0.4% | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15250061 | のカウントに使用 |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | 製 | - | 純度 ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | 当社製 | - | 純度 ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | 当社製 | - | 純度 ≥98% (HPLC) |
| ガラス底 8 ウェル顕微鏡スライド | Ibidi | 80826 | CLSM 実験での使用 |
| Corning Costar 細胞培養プレート、12 ウェル | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | FACS 実験での使用 |
| 固定溶液 (10% 中性緩衝ホルマリン) | Bio-Optica | 01V60P | 接着細胞 |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | A7906-10G | 抗体の非特異的結合を防ぐ |
| GnRHR 抗体 | Proteintech | 19950-1-AP | 免疫細胞化学試薬、ヒト I型 GnRH 受容体に結合 |
| 二次抗体、Alexa Fluor 546 コンジュゲート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A11035 | 免疫細胞化学試薬、一次抗体に結合 |
| 蛍光プローブ溶液 (Draq5) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 62254 | 対比染色核 |
| フルオロマウント 水性封入剤 | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | CLSM実験に使用し、蛍光を保持 |
| 倒立顕微鏡 | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | 細胞培養の表現型とコンフルエンシーをチェック |
| 逆共焦点レーザー走査型顕微鏡 | Zeiss | LSM-710 | CLSM実験での使用 |
| フローサイトメーター | BD Biosciences | BD FACSCalibur | FACS実験での使用 |
参考文献
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
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再版と許可
