ここでは、肺結核病変および腔からのカゼムとの薬物結合を測定するための迅速な平衡透析（RED）法を説明する。このプロトコールはまた、発泡マクロファージ由来のマトリックスと共に使用され、これは、カゼムの有効な代用物である。
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この記事について
サマリー
要約
結核病の根絶には、複雑な肺病変の複数の層に浸透することができる薬物レジメンが必要である。窩洞および病変の大部分のコアにおける薬物分布は、一般に害虫とも呼ばれる薬物耐性細菌の亜集団を収容するため、特に重要である。結核病変における薬剤浸透の測定のための既存の方法は、 生体分析または画像化技術に結合された経費のかかる時間のかかる生体内薬物動態研究を必要とする。この結合は、カゼムを介する薬物分子の受動的拡散を妨げるので、カゼイン高分子への薬物結合のインビトロ測定は、そのような技術の代替として提案されている。迅速な平衡透析は、血漿タンパク質および組織結合研究を行うための迅速かつ信頼性の高いシステムである。このプロトコールでは、excisであるカゼウムのホモジネートへの薬物結合を測定するために、高速平衡透析（RED）装置を使用した結核に感染したウサギの病変および腔から滲出した。このプロトコールはまた、カゼムの代わりに使用する脂質負荷THP-1マクロファージから代理マトリックスを生成する方法も記載している。このカゼウム/サロゲート結合アッセイは、結核薬の発見において重要なツールであり、他の疾患によって引き起こされる病変または膿瘍の薬物分布を研究するのに役立つことができる。
概要
肺結核疾患の治療には、様々なタイプの病変への薬物の効果的な分配が必要である。壊死病巣および腔は、薬剤耐性または「持続性」細菌の亜集団を有する大腸菌センターを含む。 1、2空洞病は、劣悪な治癒率と不良な予後と関連している。以前の研究では、定量的および画像技術を用いて、カゼムを浸透させる能力が薬物クラスごとに著しく異なることが示されている。しかし、これらの方法は、遅く退屈な動物感染モデルの使用を必要とする。 ex vivoカゼウムへの薬物結合を測定するインビトロアッセイを設計した。この結合は、肉芽腫の薬物浸透と逆相関することが判明し、したがって、予測ツールとして使用。 7
平衡透析は、血漿蛋白質結合研究に金標準的なアプローチとみなされています。迅速平衡透析（RED）デバイスは、そのようなアッセイを実施するための、迅速で使いやすいと信頼性の高いシステムを提供します。 8デバイスは、2つのコンポーネントで構成され：使い捨て、半透膜の垂直シリンダによって分離された2室からなる使い捨てインサート。一度に48個のインサートまで保持することができ、再使用可能なベース板。透析膜は、8 kDaの分子量カットオフ（MWCO）を有する薬物 - 高分子結合研究のために理想的です。膜区画の高い表面積対体積比は、急速透析および平....
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プロトコル
すべての動物研究は、NIAID（NIH）、Bethesda、MDの機関動物管理および使用委員会の承認を得て、国立衛生研究所の実験動物の管理および使用のガイドに従って実施した。 結核菌を含むすべての研究は、生物安全性封じ込めレベル3（BSL-3）の実験室で実施された。
1.ウサギ感染モデルとカゼムコレクション
- 以前に記載されたような鼻のみのエアロゾル曝露システムを使用して、 結核菌でニュージーランドの白色ウサギに感染させる。 12、13感染が12〜16週間進行するようにします。ウサギを35mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンで筋肉内に静置し、ウサギに0.22mL / kgのペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウムを静脈内に安楽死させ、剖検を続ける。
- ピンセットとメスを使用して、胸部から肺を取り除く。vity。各肺葉から、個々の空洞および大きな壊死肉芽腫をメスを用いて切開する。空洞と肉芽腫の壁からカゼムを慎重にこすり落とす。使用準備が整うまで-20℃で2 mLスクリューキャップチューブに試料を計量し、記録し、保存する。
- 3メガラドのドライアイスで感染性のカゼウムサンプルをガンマ線照射して、BSL-2ラボでの使用に不快で安全なものにします。
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結果
このプロトコルを使用して、我々は浸透カゼムでの予測された効率のために何百もの結核薬開発化合物を試験した。 図1は、REDアッセイの基本概念を視覚化しています。 REDインサートの透析膜は、未結合の小分子がドナーウェルからレシーバウェルに拡散し、最終的に両方のコンパートメント間の平衡を達成することを可能にする。タンパク質または脂質のような巨大分子に結合した小分子は、ドナーウェルに捕捉される。両方の区画からの試料の定量分析により、カゼムまたは代理母材中の各小分子の未結合画分（ f u ）を計算することが可能になる。この画分は、インビボでのカゼウムの薬物浸透と直接的に相関することが示されている 。 図2が示すように、MALDI（マトリックス支援レーザー脱離/イオン化）質量分析メトリー画像では、 f uが高くなればなるほど、薬剤はカゼムに拡散する。したがって、これは、薬物分子が病変の細胞層との界面か.......
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ディスカッション
結核に感染した患者の肺壊死病変および空洞には、薬物治療に対して反抗的な細菌の亜集団が含まれる。これらの構造の大部分のコアは、細胞外環境においてこれらの胞子を保持することに特に関与する。これらの離れた場所への抗菌剤の好都合な分布は、結核薬効の重要な決定要因であると考えられている。このプロトコールのバリデーションの前に、大腸病変における創薬化合物の分布を予測できるインビトロ技術は存在しなかった。結果として、これらの重大な病巣における薬物分布の評価は、動物感染モデル、病巣中心の薬物動態学的研究およびMALDI質量分析イメージング技術に大きく依存していた。 5,17
インビトロアッセイでは、再は、in vivo薬物動態試験の退屈とコストをかけずに結核病変における薬剤の浸透を予測するための迅速かつ効果的な方法です。プロトコルは、本来RED装置の使用目的であった血漿タンパク結合アッセイの改変です。ピペット可能な一貫性の組織試料の均質化は、同じ装置を用いて測定する結合組織タンパク質を可能にしま.......
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開示事項
競合する金銭的利益はない。
謝辞
私たちは、それぞれ、PA-824（pretomanid）、AZD5847、radezolidとtedizolid bedaquilineを提供するためのジョンソン・エンド・ジョンソン、TBアライアンス、アストラゼネカ、リブ-XとTrius治療に感謝したいです。ブレンダンプリドー、マシュー・ツィンマーマン、ステファン・ジャズウィン、エマ・レイ・フラド、ナンシールーエル、レヤン・リおよびダニエル・ウェイナー MALDI分析、生物分析方法、caseumサロゲートの調製、化学合成、およびウサギcaseumの単離と支持を提供しました。この作品は、センターオブエクセレンスのためにビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団とウェルカム・トラストからビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団、賞＃OPP1044966とOPP1024050からV・ダートイス、NIH共有計装グラントS10OD018072だけでなく、共同資金に資金調達を行いましたP・ワイヤットに発展途上国の疾患のためのリード最適化のために。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ニュージーランド白ウサギ | |||
| 結核菌BEI | リソース | NR-13647 | |
| ケタテシア(ケタミン)100 mg / mL C3N | ヘンリーシャインアニマルヘルス | 56344 | |
| アナセド(キシラジン)100 mg / mL | ヘンリーシャインアニマルヘルス | 33198 | |
| ユータゾール(ペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウム)溶液 | Virbac | 710101 | |
| THP-1 単球細胞株 | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm²TC処理フラスコ(T175) | フィッシャーサイエンティフィック | T-3400-175 | |
| RPMI 1640培地、グルタミンなし | フィッシャーサイエンティフィック | MT-15-040-CV | |
| ハイクロンウシ胎児血清、ガンマ線照射 | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-グルタミン、200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC ディッシュ、145 mm x 20 mm、ベント付き | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| エチレンジアミン四酢酸 | Sigma | E6758 | |
| オレイン酸 | フィッシャーサイエンティフィ | ICN15178101 | |
| ピアスREDデバイス再利用可能なベースプレート | フィッシャーサイエンティフィック | PI-89811 | |
| スREDデバイスインサート、50 /ボックス | フィッシャーサイエンティフィック | PI-89809 | |
| ピアスレッドインサート取り外しツール | フィッシャーサイエンティフィック | 89812 | |
| 粘着プレートシール | フィッシャーサイエンティフィック | 08-408-240 | |
| PBS、pH 7.4、10x 500 mL(Gibco) | ライフテクノロジーズ | 10010-049 | |
| DMSO | シグマ | 472301 | |
| アセトニトリル | Sigma | 34998 | |
| メタノール | Sigma | 34860 | |
| ベラパミル塩酸 | Σ V4629 | ||
| ジクロフェナクナトリウム塩 | Σ | 93484 | |
| トリパン ブルー ソリューション、0.4% | フィッシャー サイエンティフィ | 15-250-061 | |
| エタノール、200プルーフ | フィッシャーサイエンティフィック | 04-355-451 | |
| 2010 ジェノ/グラインダー | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| ビーズミル ホモジナイザーアクセサリー、金属バルクビーズ | フィッシャーサイエンティフィック | 15-340-158 | |
| 484R コバルト60照射器 | JLシェパード | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chipディスポーザブル血球計算盤 | フィッシャーサイエンティフィック | 22-600-100 | |
| 直立光顕微鏡 | ライカ | DM1000 | |
| バイナリ液体クロマトグラフィーシステム | Agilent | 1260 | マルチペンセント |
| 質量分析計 | AB Sciex | 4000 |
参考文献
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Fron....
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