方法論記事

準備とインビトロキャラクタリゼーション

DOI：

10.3791/55567

⸱

2017年5月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

現在までに、心血管疾患（CVD）のために利用できる外科および薬理学的治療は限られており、多くの場合、姑息されています。同時に、遺伝子や細胞療法は、CVD処理のための非常に有望な代替的なアプローチです。しかし、遺伝子治療の広範な臨床応用を大幅に適当な遺伝子送達系の欠如によって制限されます。適切な遺伝子送達ベクターの開発は、細胞療法における現在の課題に対する解決策を提供することができます。特に、このような負傷者の臓器における限ら効率と低い細胞保持などの既存の欠点は、移植前に、適切な細胞工学（ すなわち、遺伝）によって克服することができます。提示プロトコルは、ポリエチレンイミン超常磁性ナノ粒子（PEI / MNP）に基づく送達ベクターを使用して、内皮細胞の効率的かつ安全な過渡変形を記載しています。また、セルの特性評価のためのアルゴリズムおよび方法が定義されています。成功intracelluヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）へのマイクロRNA（MIR）のLAR送達は、細胞生存率、機能、または細胞間通信に影響を与えることなく達成されました。また、このアプローチは、導入された外因性のmiRに強い機能的な効果を引き起こすことが証明されました。重要なことに、このMNPベースのベクターの適用は、磁気ターゲットと非侵襲的MRIトレースの可能性を伴って、細胞磁化を確実にします。これは、MRIで非侵襲的に監視することができる磁気誘導、遺伝的に操作された細胞治療のための基礎を提供することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遺伝子や細胞治療は、CVD処理における現在の課題を解決する可能性を持っている強力なツールです。これらのアプローチの両方が、現在臨床試験で検証されているという事実にもかかわらず、彼らはまだ広い臨床応用1のための準備ができていません。特に、遺伝子や細胞治療の課題に取り組むための一般的なアプローチは、臨床応用に適した多機能の遺伝子送達ベクターを開発することです。安全かつ効率的な遺伝子送達システムの欠如は遺伝子治療の主要な関心事です。同時に、移植前に細胞産物の遺伝子工学は、 例えば、心臓の分野では、機能改善のわずか約5％がポスト幹細胞移植1を達成している（例えば、低効率として、細胞治療の深刻な課題を克服することができ時間Poに数分以内に10％ - ）と損傷部位での貧弱な保持/移植は（ すなわち、細胞保持は5を下回りますST-アプリケーションにかかわらず、投与経路2、3、4）。

現在までに、ウイルスベクターは大きく、臨床試験におけるそれらの広い応用をもたらした効率の点で、非ウイルス系（〜67％）5上回ります。しかし、ウイルスビヒクルは、免疫原性などの重大なリスク（およびその後の炎症性の重篤な合併症を伴う応答、）、発癌性、および実施遺伝物質6の大きさに制限を運びます。これらの安全性の問題およびウイルスベクターの生産の高コストのため、非ウイルス系の使用は、特定のケース7,8で好ましいです。このような（CVD処理用など）血管新生を制御する成長因子の発現のような一過性の遺伝的補正を必要とする障害、又はdeliveに特に適していますワクチンのRY。

我々のグループでは、送達システムは、分枝25-kDaのポリエチレンイミン（PEI）及びビオチン-ストレプトアビジン相互作用9によって一緒に結合された超常磁性酸化鉄ナノ粒子（MNP）を組み合わせることにより設計しました。このベクターは、移植前に彼らの同時磁化を考慮して、細胞の遺伝子工学のための潜在的なツールです。後者は、高度な磁気ターゲティング技術が成功10を開発されているように、最近特に有望である磁気誘導/維持のための基礎を提供します。また、得られた磁気応答性細胞は、非侵襲的磁気共鳴画像法（MRI）または磁性粒子イメージング11,12によって監視される可能性を有しています。

PEI / MNPベクターの場合には、ポリアミンは、核酸縮合従って因子を分解からの保護を確実にします sの、細胞内でのベクターの内在、およびエンドソーム脱出5。 MNPは、磁気誘導の観点からだけでなく、公知のPEIの毒性7、13、14を還元することによってだけでなく、PEIの特性を補完します。以前に、PEI / MNPベクトル特性は、線維芽細胞およびヒト間葉系幹細胞15、16を用いて送達効率（ すなわち、のpDNAおよびmiRNA）及び安全性の点で調整しました。

本稿において、miRNA修飾細胞の生成のためのPEI /のMNPのアプリケーションに関する詳細なプロトコールは、17に記載されています。この目的のために、HUVECを用い、in vitroでの血管新生のために確立されたモデルを表しています。彼らは、トランスフェクトするために挑戦していると毒性影響18、19の影響を受けやすいですお尻= "外部参照"> 20。また、我々は彼らの標的化、細胞間コミュニケーション、およびMRI検出を含むin vitroでのこのような細胞を、評価するためのアルゴリズムを提供します。

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プロトコル

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細胞分離のためのヒト臍帯は、ヘルシンキ宣言に従って、研究のために、この材料の使用に彼らの書面による同意を与えた知らせ、健康な女性から産後を得ました。ロストック大学の倫理委員会が提示研究（REG。番号A 2011年06、長引く2013年9月23日）を承認しました。

トランスフェクション複合体の調製

  1. ポリエチレンのビオチン化（PEI）。
    1. 室温（RT）で24時間400rpmで0.18 mmの溶液を得るために光から保護 - 300で、磁気撹拌下、超純水に分枝PEIを溶解します。 4°Cで溶液を保管してください。
    2. 得られた溶液を21、22における第一級アミノ基の濃度を測定します。
      1. PRの100μLを混合することにより、アミン検出試薬23として2％ニンヒドリン試薬溶液を使用ediluted試料（1：超純水で200）とニンヒドリン試薬75μL。 80℃で30分間インキュベートします。それを冷却し、安定化のための50％エタノール100μLを追加します。吸収分光光度計で550 nmの吸光度を測定します。
      2. グリシンを使用して標準曲線を作成します。
        1. 1：1：5 1:10 1:20 1:40、1:80、1：0.1 Mアミノ-N-ストック溶液（0.75脱イオン水100mL中のグリシンのg）およびその希釈液1を調製100、1：200および1：400、1：600。ステップ1.1.2.1のようにこれらのソリューションを測定し、軸上の濃度と吸光度とのプロットを作成します。
        2. 得られたプロットとPEI溶液の測定された吸光度に基づいて、PEIにおけるαアミノ基の濃度を規定します。
          注：注意。ニンヒドリン試薬溶液は、排他的にフードの下で使用しなければならないし、窒素雰囲気下で保存しなければなりません。溶液の色は、酸化による変更されたときには使用できません。
    3. 使用直前に100 mgのビオチンリンカーを超純水に溶解し、0.01 mM溶液を得る。ビオチン化試薬の必要量（モル）を得るために、PEI（工程1.1.2で測定）中のα-アミノ基の濃度に20を掛けて、PEIに加えるビオチンの必要量を計算する。
      1. pH 8-9でPEI溶液にビオチン溶液を添加し、室温で磁気撹拌しながら16時間インキュベートする。
    4. サイズ排除クロマトグラフィー23によって未反応ビオチンを除去する。 25-kDA PEIの精製に適したゲル濾過媒体を含む市販のカラムを使用し、製造元の指示に従ってください。精製後にアリコートをとり、アミン検出試薬（ステップ1.1.2）を用いてアミン濃度を測定し、ビオチン抱合効率を決定する（ステップ1.2.2）。得られたビオチン化PEIを4℃で保存する。
  2. キャラクタービオチン化PEIの化。
    1. ステップ1.1.2で説明したように、ビオチン化後のPEIにおけるαアミノ基の濃度を決定します。
    2. 結合手順を確認するために、PEIのビオチン化の程度を決定します。定量化のために、ビオチン化レベル24、25の正確な比色決意を確保するため、HABA色素（4'-ヒドロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸）のアプリケーションに基づいている市販のキットを使用します。製造元の指示に従ってください。
  3. MNPとその特性のろ過。
    1. 大きな毒性凝集物を排除するために0.45μmのシリンジ駆動式フィルター16を介して市販のストレプトアビジンでコーティングされたMNPをフィルタリングします。標準測光アッセイ26を用いて最終鉄濃度を測定します。
    2. 記録によってフィルタリングのMNPの品質を調べ磁化曲線及び標準プロトコル27、28に従ったTEMイメージングによる。
      1. 蒸留水でMNP懸濁液を希釈し、TEM分析のために300メッシュホルムバール炭素被覆銅グリッド上に得られた懸濁液の3μLを置きます。その後、加熱プレート上でスライドガラス上にこのグリッドを配置し、それを乾燥させてください。
      2. 120キロボルトの透過型電子顕微鏡で試料を分析して、X線検出器27を用いて元素含有量を確認します。
  4. 超解像顕微鏡のためのトランスフェクション複合体の3色のラベル。
    1. 製造業者の指示に従ってNHSエステルアトー488色素とPEIで測定一級アミノ基の0.5％にラベルを付けます。上記のように、サイズ排除クロマトグラフィーにより過剰の未結合色素を除去する（ステップ1.1.4）。ニンヒドリンASSAを用いてアミノ基の得られる濃度を測定Y（ステップ1.1.2）。
    2. 市販のラベル（材料リストに示される）は、適切な標識キット15を用いCyanine5色素でのmiR（SCR-MIR）をスクランブル。分光光度法による蛍光団のmiR濃度を測定します。
    3. 新たに1にビオチン結合色素（ 例えば、アト565-ビオチン）とMNPたびにラベルを付ける：1,000 / wの比wです。直接Delyangina ら詳細あたり、トランスフェクション複合体の形成中のmiR / PEIにMNPを追加した後に染料を適用します。 16。

2.細胞調製

  1. HUVEC分離。
    1. 直接コード静脈の内部からコラゲナーゼ消化を使用してコードを取得した後臍帯から細胞を単離します。以前に開発されたプロトコル29に従ってください。
      1. Tにロード - 〜60個の単位緩衝液中のコラゲナーゼタイプIV溶液/ mLで各コードをインキュベート彼臍帯静脈 - 37°Cで13分間。
    2. すべての実験のために、5人の患者の最小値からのHUVECをプール。
      注：栽培は4-5継代を超えないようにしてください。これは、トランスフェクション効率を低下させる原因となるよう、マイコプラズマで汚染された細胞を使用しないでください。マイコプラズマ汚染は、マイコプラズマの高感度検出のためのPCRキットを使用してプロトコルを開始する前にするために試験されるべきです。
      1. マイコプラズマの存在をテストします。
        1. 10分（13,000×gで）のための細胞培養上清の遠心1 mLです。 3分間17件のdH 2 OのμLおよび沸騰（93℃）でペレットを懸濁します。種々のマイコプラズマ種の高度に保存されたリボソームRNA（16S-rRNAの）をコードするDNA領域を増幅するためにサスペンションの2μLを使用します。
        2. 10pmolの各プライマーを用いてPCRを行う（フォワードプライマー：5'-CTGACGACAACCATGCACCATCTGTC-3 ';リバースプライマー：5'-GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG-3'）櫛で以下の条件で商用PCRキットでination：3分間94°C; 30秒、30秒、50℃、および30秒間72℃、94℃の45サイクル。 10分間72℃で最終伸長。
        3. アガロースゲル電気泳動を用いてPCR産物（292塩基対）を分析します。
    3. いずれかの5％CO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で100 U / mLのペニシリンおよび100μg/ mLのストレプトマイシンを補充した内皮増殖培地中で得られた細胞を液体窒素または培養それらを長期間保存します。
  2. HUVECの特性評価。
    1. 、基底膜マトリクス（ 例えば、マトリゲル）で管を構築するためにそれらの機能的能力と、標準的なプロトコル30以下内皮マーカーCD31（血小板内皮細胞接着分子、PECAM-1）の発現の観点から、単離されたHUVECを特徴付ける31。

3.トランスフェクション

  1. ストックHUVEC培養物をトリプシン処理（ステップ4.1.2を参照。）、手動血球計数器を用いて細胞を数えます。 70~80％のコンフルエンスに到達するまで、トランスフェクション前に48時間、約13,000細胞/成長表面のcm 2での出発細胞密度で、適切なサイズのプラスチック製細胞培養ウェルプレート上のHUVECを播種。
  2. 新鮮なのmiR / PEI / MNPは毎回錯体準備します。
    注：最初に、該miR / PEI複合体が得られるはずである（ステップ3.2.1 - 3.2.3）。その後、のMNPは、トランスフェクション（ステップ3.3）に使用される最終のmiR / PEI / MNP製剤を得るために（ステップ3.2.4）のmiR / PEI溶液に添加されるべきです。
    1. 適切な市販のmiRの量を計算し、製造業者によって提供される株式の濃度を用いて（タグ付きまたは機能、スクランブル、ステップ4を参照）。細胞成長表面ののmiR / cm 2の2.5ピコモルを使用してください。 O 5％グルコース溶液中でのmiRを希釈miR /μLの0.125ピコモルの最終濃度btain。
    2. ステップ3.2.1からのmiR量及び25〜32の最適なNP比に基づいて、その測定された濃度（ステップ1.1.2）を使用して、PEIの必要量を計算します。 5％グルコース溶液の等量（算出必要な体積当たり）PEIを希釈します。 （ステップ3.2.1）からのmiR溶液に、得られた予備希釈PEIを添加し、30秒間得られた混合物をボルテックス。
    3. RTで30分間得られたmiR / PEI混合物をインキュベートします。
    4. 、室温で超音波処理水浴（材料リストを参照）で少なくとも20分間35 kHzでのMNPを超音波処理のmiR / PEIにMNP溶液の適切な量を加える（5 - 調製のmiR / PEIの鉄を25μg/ mLの/ MNP混合物16）、30秒間ボルテックスし、準備ができるまで、RTで30分間インキュベートします。
  3. 細胞上の培地に直接調製したmiR / PEI / MNP混合物を滴下して加えます。細胞CULの得られた混合物を使用してくださいmiR / PEI / MNPとトゥーレ培地は、トランスフェクション溶液としてグルコースで希釈しました。新鮮な培養培地を6時間トランスフェクション後で、この混合物を置き換えます。

ベクターの安全性4.分析

  1. 細胞生存率の検討。
    1. （3.1および3.2ステップ）HUVECを24ウェル培養プレートに播種トランスフェクション;テストプローブとしてのCy3-MIRを使用して、フローサイトメトリーのための制御ゲートプローブとしてのmiR（SCR-MIR）をスクランブル。 24時間5％CO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃でインキュベートします。
    2. PBSで希釈した1×トリプシン-EDTAを用いてトリプシン処理により上清およびトランスフェクトされた細胞を収集し、37℃で4分間、細胞に添加しました。 10分間、300×gで遠心分離し、分析のために使用します。
    3. リビング/死細胞を区別するために、市販の染色を適用することにより、フローサイトメトリーを用いて、トランスフェクション後に細胞生存率およびmiR取り込み効率24時間を調べます。標準プロトコル15を使用アップ。生存能力の陽性対照として非トランスフェクト細胞を適用します。
  2. 機能アッセイにおける細胞のためのmiR / PEI / MNP複合体の安全性を調べます。
    1. トランスフェクションされた細胞の増殖活性を評価します。
      1. トランスフェクトHUVECを機能的アンチセンスのmiR（ 例えば、HUVECを31抗miR92a）と（3.1および3.2ステップ）12ウェル培養プレートに播種し、24時間CO 2 5％を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃でインキュベートします。
      2. レーザーベースの共焦点顕微鏡でのEdU（5-エチニル-2'-デオキシウリジン）および走査で染色することによって増殖細胞の数を定義するために市販のキットを使用します。次顕微鏡設定を使用：油浸と40Xの目的。 （647 nmの染料用）633 nmの励起レーザ。 5つのランダムフィールドは、各サンプルに記録されます。総核数（HoechによってのEdU染色された核の数を割ることによって増殖細胞の割合を計算しますST-染色）。
    2. 以前に17、31に記載されているように、チューブ状構造を形成するためにトランスフェクトされた細胞の能力を評価します。
      1. SCR-MIRと（3.1および3.2ステップ）HUVECを24ウェル培養プレートに播種トランスフェクトし、5％のCO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で48時間インキュベートします。 （ステップ4.1.1のように）トランスフェクトされた細胞を集めます。
      2. 基底膜マトリックスの140μLで被覆した24ウェルプレート中の修飾されたHUVECの種3.5×10 4。 5％CO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で18時間インキュベートします。
      3. レコードの各ウェル用いたレーザー走査型共焦点顕微鏡で10のランダムフィールドの画像（微分干渉コントラスト）とは、「血管新生アナライザ」プラグインでImageJソフトウェアを用いて分析します。分岐の合計長さ、分岐の数、及びjunctiの数などのパラメータを含みます評価でアドオン。未処理の対照に、この比較。
  3. 調べギャップジャンクション（GJ）でトランスフェクション複合体の可能性のある毒性影響が3Dに（FRAP）33を光退色後の3D蛍光回復を試験することにより細胞間コミュニケーション（GJIC）を媒介しました。
    1. 生細胞イメージング（油浸）に適した薄い底でゼラチン被覆スライドガラス上の細胞を播種します。ステップ3.2において上述したように非標識、非機能性のmiR（SCR-MIR）を用いて細胞をトランスフェクトし、24時間インキュベートします。
    2. 顕微鏡検査の前に直接カルセインでそれらをロードすることにより、イメージングのための細胞を準備します。特に、5μMのカルセインを含有する新鮮な培地で培地を交換し、20分間インキュベートし、PBSで洗浄し、新鮮な培地を加えます。 37℃に顕微鏡のインキュベータを予め加温し、5％までのCO 2濃度を調整します。
      注：すべての試薬は、細胞contracを避けるために暖かいはず測定前ション。
    3. 細胞の可視化およびFRAP実験のために561 nmの励起レーザーを使用します。まず、手動で関心領域（ROI）として測定するためのセルを選択。試験細胞は、少なくとも3つの隣接セルを有するべきです。漂白されることはありません明るい、安定した蛍光を有する基準セルを定義します。 zスタックの限界を定義します。 15層 - 10を含むように底への細胞の上からの蛍光を記録します。
    4. 100％レーザー出力を使用して試験セルを漂白し、次の15分の間（これは隣接セルからGJ特異的色素転写に）後続の蛍光回復を記録します。 Z-スタック60秒毎に生データを記録します。実験あたり10試験細胞 - 合計で、5未満ではないとFRAP測定を行います。非トランスフェクト細胞への結果の比較。

トランスフェクション効率の5.テスト

  1. miR取り込みの検討。
    1. STEに記載されるようにプローブを調製P 4.1およびフローサイトメトリーでのmiRの取り込みを定義するためにそれらを同時に使用しています。
  2. 確認し、共焦点と超解像構造化照明顕微鏡（SIM）によりトランスフェクション複合体の細胞内局在を記載しています。
    1. （ステップ3.1）の前に記載されているように、24ウェル培養プレートのウェルに入れたゼラチン被覆ガラスカバースリップ上のHUVECを播種。 3色標識のmiR / PEI / MNP（ステップ1.4）を用いて細胞をトランスフェクトし、CO 2 5％を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で24時間インキュベートします。
    2. ちょうどPBSで、次いでリン酸緩衝食塩水（PBS）中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）を有する第1のカバースリップを洗浄し。標準的なプロトコル16以下DAPIで15分間染色し、核を37℃で4％パラホルムアルデヒド（PFA）中でインキュベートすることによって細胞を固定。過剰の染料を除去するためにシェーカー（それぞれ15分）で3回洗浄します。
      注：PFAは発がん性であると慎重に処理しなければなりません。
    3. PRを配置後述のように顕微鏡でeparedカバースリップは、少なくとも1時間のためにそれらを乾燥させ、そして顕微鏡検査のためにそれらを使用し、適切な封入剤を使用してスライドします。
    4. 63X油浸対物レンズを用いて画像と次のSIM設定取得：励起用の405-、488-、561-、および633 nmのレーザーラインを、 4の平均で5角、5つの段階で32ビットの深さzスタックモード、。 633と405のレーザーライン、561と488、G4とG3とG5とG2グリッド。
  3. 未処理の対のmiR / PEI / MNP-たHUVECにおけるRT-QPCRによって提供されたmiRの機能性を評価します。
    1. HUVECを機能的アンチセンスのmiR有する12ウェル培養プレートのステップ（3.1および3.2）（ 例えば、HUVECを31のための抗miR92a）に播種トランスフェクトし、5％のCO 2を含有するhumidiのfi ED雰囲気下で37℃で48時間インキュベートします。
    2. （材料参照）市販のキットを用いてRT-QPCRを有する抗miR92a配信および処理を評価します。トンに従ってください彼メーカーの指示、他の場所で17、31説明したように。並行して、標的遺伝子の発現を調べる（ 例えば、ITGA5 31）。
      注：それはのmiRの実際の結果ではなく、単にその細胞内蓄積の測定を確実にするので、内因性のmiRに対するアンタゴの配信は、模倣よりも好ましいです。

評価と磁気細胞分離をターゲット6セル

  1. in vitroでの静的な条件で細胞標的。
    1. （2.5ピコモル/ cm 2のSCR-MIR、NP 25、および15〜25 / mlのMNP）24ウェルプレート中のHUVECをトランスフェクト、24時間インキュベート洗浄し、（ステップ4）上述したように集めます。
    2. ウェルの新鮮な培地1mLで1から得られた細胞ペレットを混合し、12ウェルプレートのウェルに配置します。テープを使用して、プレートの底部に局所的に（側）の小磁石を固定します。
    3. 24時間細胞懸濁液をインキュベートし、磁石なし磁石上及び領域内の領域における細胞の付着および成長を観察します。定性的な評価のために、従来の倒立顕微鏡を使用します。
  2. 試験管内でシミュレートされた動的な条件で細胞標的。
    1. ステップ3.1および3.2（2.5ピコモル/ cm 2でのCy3-MIR、NP 25、及び15から25 / mlのMNP）あたり24ウェルプレート中のHUVECをトランスフェクション24時間インキュベートし、洗浄、及び1Xを用いてトリプシン処理によって収集PBSで希釈したトリプシン-EDTAを37℃で4分間、細胞に添加しました。 10分間、300×gで遠心分離。
    2. ウェルの新鮮な培地1mLで1から得られた細胞ペレットを混合し、12ウェルプレートのウェルに配置します。テープを用いて（ウェルの側に）局所的に小さな磁石を固定します。シェーカー上で培養プレートを配置し、動的条件34をシミュレートするために、150rpmで12時間、細胞懸濁液をインキュベートします。
    3. 細胞を洗浄し、修正それらは、4％PFAを使用しました。 DAPI 16で核を染色します。分析のための画像を作成するために、生データを得るために - （12スライス5）、及び最大値投影画像処理514 nmの励起レーザー、zスタックモードを有するレーザ走査型共焦点顕微鏡を用いて細胞付着を記録します。
  3. 磁気応答性および非応答性細胞の定量分析。
    1. 24ウェルプレート中のHUVECをトランスフェクト（2.5ピコモル/ cm 2のSCR-MIR、NP 25、および15〜25 / mlのMNP）、（ステップ6.2.1）の前に説明したように洗浄し、24時間インキュベートし、収集。プレ暖かいPBSとセルソーティング緩衝液（濾過により滅菌し、マテリアルのリストを参照）37℃です。細胞選別緩衝液500μlで各ウェルから得られた細胞ペレットを再懸濁。
    2. 磁石上に新鮮な細胞ソーティング緩衝液で3回カラムを洗浄し、供給された磁石によって固定磁性選別列にこの細胞懸濁液を適用し、そしてフロースルーMAGNETIなどを収集的に応答しない画分（Mag含有）。
    3. 磁石からカラムを取り外し、直ちにプランジャーを用いて、カラムを通して新鮮な細胞ソーティングバッファを押して磁気応答性細胞画分（MAG +）を収集します。
    4. 10分間、300×gで遠心分離Mag含有及びMAGの両方+。 PBSで細胞ペレットを再懸濁、細胞を計数し、トリパンブルー排除アッセイ35を用いて細胞生存率を評価します。長期分析のために（ すなわち、再シードと24、48、及び培養17における72時間後に評価する）、または直接、フローサイトメトリーのためのいずれか（ステップ4.1。）得られた細胞ペレットを使用します。
  4. トランスフェクションされた細胞の鉄負荷を定義します。
    注：準備中に、鉄の酸化物材料および機器を用いた細胞プローブのいずれかの接触は避けなければなりません。
    1. （ステップ4.1.1のように）トランスフェクトされたHUVECおよび非トランスフェクションコントロールを集めます。 PBS 36（b）に2％BSAで二回採取した細胞を洗浄 yが注意深くこの洗浄用緩衝液1mlで細胞を混合し、次いで10分間、300×gで遠心分離します。再懸濁、PBS 250μLで得られた細胞ペレットを4％PFAの100μLを添加し、細胞を固定するために20分間インキュベートします。上述したように、PBSで3回洗浄します。
    2. PBS 110μLで得られた固定細胞ペレットを再懸濁し、100μLのPCRチューブに移します。
      1. 細胞計数のために、10μLのアリコートを取り、磁性粒子分光法（MPS）の残りのサンプルを使用します。
    3. 市販のMPSデバイス上で測定を行います。測定中に、以下の設定を適用する：0 = 25 kHzのF = 25 MTおよび周波数磁場B ドライブ 。サンプルの鉄定量のために、2.1μgの既知の鉄量にMNP参照試料の対応3、refにMPS-スペクトルの3第三高調波を正規化外部参照"> 37。コントロールとして、未処理の細胞を使用してください。

7.定義MRI検出限界

  1. 細胞の調製。
    1. （ファントムを調製するための）細胞の必要量に応じて複製または三連で-種子6ウェルプレートおよびトランスフェクションでのHUVEC（25 / mlのMNP 2.5ピコモル/ cm 2のSCR-MIR、NP 25、および15）。 24時間細胞をインキュベートし、洗浄し、収集し、（ステップ4）の前に説明したように、4％PFAで固定し。
    2. 適切な細胞数（ 例えば、10 3、10 4、10 5、 等 ）を用いてアリコートを調製し、得られた細胞を計数し、50μLにその音量を調節。
  2. アガロースファントムの準備
    1. 層38との間に埋め込まれたトランスフェクトされた細胞の異なる量の50-mLチューブ中の2％アガロースの複数の層を準備します。準備、超音波処理および遠心分離器中に高温アガロース38へアーティファクトの原因となる気泡を破壊します。
      注：重要なことに、非磁性のmiR / PEI複合体で処理した5.5×10を含むファントム5個の HUVECを対照として役立つように同じ方法で調製されるべきです。
  3. コイルの中心にファントムを配置した後、7.1 T動物MRIシステムを用いたin vitroファントムで得られたスキャン、磁場のz軸に平行です。
    1. グラジエントエコーシーケンスの取得のために、以下のシーケンスパラメータを適用する：TR = 66ミリ。 TE 1 / TE 2 / TE 3 / TE 4 / TE 10 / TE 6 = 1.44 / 2.88 / 4.51 / 6.11 / 7.60 / 9.01ミリ。フリップ角= 3°; 256×256に補間マトリックス= 128×128、。ビュー= 42 [mm]のフィールド。 100％。平均= 1、エコートレイン長= 1。スライス厚= 1.5ミリメートル。そして16のスライス。
    2. すべての4つのエコー時間の信号の減衰を評価し、他の場所39記載したように、適切なソフトウェアを使用して、R2 *マップ（R2 * = 1 / T2 *）を計算します。

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結果

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提案されたプロトコルの主な目的は、磁気応答性のmiR-改変細胞を生成し、それらの正確な特性（ 図1）を行うことです。その結果、磁気選択および誘導およびMRIで検出可能に反応効率的にトランスフェクトされた細胞は、得られるべきです。

まず、単離されたHUVECの同一性は、内皮マーカーCD31（PECAM）（ 図2A）を有する典型的な染色によって、適切な基底膜マトリックス（ 図2B）に管を形成する能力によって確認しました。得られた細胞は、miRは非常に効率的にPEI / MNPによって導入され始めました。顕微鏡検査は、すべてのセルがタグ付けされたmiR（Cy3の）24時間トランスフェクション後（ 図3A）の信号に対して陽性であったことを実証しました。重要なことには、全く細胞死は、未処理細胞（ 図3B）

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ディスカッション

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それらのさらなる磁気的に制御指導のための超常磁性ナノ粒子を搭載した遺伝子操作された細胞の生産は現在のプロトコルに提示されています。この戦略の成功した適用は、移植のために標的化可能細胞生成物を提供することによって、そのような損傷した領域2、3、4における低い保持および乏しい生着などの細胞療法のいくつかの問題の解決を可能にします。また、適切に選択された遺伝物質の同時導入は、細胞の性質を促進することができ、したがって、機能的利益41を増大させる可能性があります。

現在のプロトコルは、モデルとしてのHUVEC上で開発されてきました。これらの細胞をトランスフェクトすることが困難と毒性影響18、19、20

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開示事項

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我々は、開示することは一切競合する金融利害関係を持っていません。

謝辞

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私たちは、フィルタ処理された超常磁性ナノ粒子のTEM像を取得する際、そのX線分析を行う上での技術サポートのためにG.フルダ（電子顕微鏡センター、ロストック大学、ドイツ）を感謝したいと思います。 RTCロストックで行わ作品は、連邦教育研究省ドイツ（FKZ 0312138A、FKZ 316159およびVIP + 03VP00241）とEU構造基金と国家メクレンブルク=フォアポンメルン州（ESF / IV-WM-B34-によってサポートされていました0030/10及びESF / IV-BM-B35-0010 / 12）とDFG（DA 1296から1）、ダンプ・財団、ドイツ心臓財団（F / 01/12）。フランク・ウィークホースト EU FP7の研究プログラム "ナノMAG" FP7-NMP-2013-LARGE-7でサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335
PD-10 脱塩カラムGE Healthcare17085101Sephadex G-25 中ニン
ヒドリン試薬溶液 2%Sigma Aldrich7285
GlycineSigma Aldrich410225
Pierce Biotin Quantitation KitThermo Scientific28005
Microplate reader Model 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere 常磁性粒子PromegaZ5481
Millex-HV PVDF FilterMerckSLHV013SL0.45 µm
Libra 120 透過型電子顕微鏡Zeiss加速電圧 120 kV
サファイアX線検出器EDAX-Amatek
細胞培養プラスチックTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA ラベル ITキットMirus BioMIR 9650
Biotin Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
コラーゲン IV型 GibcoThermo Scientific17104019
内皮増殖培地、EGM-2ロンザCC-3156 &CC-4176
ペニシリン/ストレプトマイシンThermo Scientific15140122100 U/mL, 100 & micro;g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
抗PECAM-1抗体Santa Cruzsc-1506
MS MACS カラムMiltenyi Biotec 130-042-201
近赤外生細胞/死細胞染色キットThermo ScientificL10119
Cy3 色素標識 Pre-miR ネガティブコントロールThermo ScientificAM17120原稿の「Cy3-miR」または「Cyanine-miR3」
Pre-miRNA Precursor Molecules - Negative Control Thermo ScientificAM17110scr-miR" 原稿
Anti-has-miR92a-3p 合成阻害剤 Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 systemZeiss
ParaformaldehydeSigma Aldrich1581274% solution in PBS
DAPI nuclear stainThermo ScientificD1306
NucleoSpin RNA isolation KitMachery-Nagel740955
mirVana miRNA Isolation KitThermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA 逆転写キットThermo Scientific4366596
StepOnePlus リアルタイム PCR システムApplied Biosystems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqMan assayThermo Scientific000431Mature miRNA Sequence:UAUUGCACUUGCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready Mix日本ジェネティクスLS27
ITGA5 TaqMan アッセイThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan アッセイThermo Scientific001093
18S rRNA 内在性コントロールThermo Scientific4333760F
ゼラチンSigma AldrichG7041
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS bufferMiltenyi Biotec 130-091-221
アガロースSigma AldrichA9539
7.1 テスラ動物 MRI システムブルカー コーポレーションA7906
ImageJ ソフトウェア国立衛生血管新生アナライザー (NIH)
MPS デバイスでブルカー バイオスピン
Matlab ソフトウェアMathworks
リングネオジムマグネット magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 mm; 残留電流は~1.3 T、保磁力 ≥955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 イメージングキットThermo ScientificC10340
FluorSave 試薬Merck345789
超音波浴バンデリン 電子タイプ: RK 100 SH
"研究所 アップグレード

参考文献

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