冷痛覚のための新規アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

サマリー

ここでは、 ショウジョウバエの幼虫に冷たい痛覚を研究するための新規なアッセイを示しています。このアッセイは、焦点有害冷たい刺激を印加することが可能な特注のペルティエプローブを利用し、定量化可能な冷たい固有の動作になります。この技術は冷たい痛覚の更なる細胞および分子解剖を許可します。

要約

どのように生物が感知し、まだよく理解されている有害な温度に反応します。さらに、そのような末梢神経障害または損傷誘発性感を経験する患者のような感覚機械の感作を、基礎となるメカニズムは、十分に特徴付けられていません。遺伝的に扱いやすいショウジョウバエモデルは、有害な熱の検出に必要な細胞および遺伝子を研究するために使用されています これは、関心のある複数の保存された遺伝子が得られました。リトルは、細胞および有害な寒さの検出のための重要な受容体についてはしかし、知られています。 ショウジョウバエは、彼らが感知し、多分有害な冷たい刺激を避ける方法を、低温（≤10ºC）への長期暴露に耐えられないので、涼しい避けるだろう、行動好みアッセイにおける気温の上昇を好む、が、ごく最近研究されています。

ここでは、説明との最初の有害な寒さ（≤10ºC）の行動分析を特徴付けますショウジョウバエ。このツールおよびアッセイを使用して、我々は、定性的および定量的に冷たい侵害受容行動を評価するための方法を研究者を示しています。これは、通常の/健康な培養条件の下で、あるいはおそらく疾病、傷害または感作のコンテキストで行うことができます。さらに、このアッセイはthermosensation、疼痛、または侵害受容感に影響を与える可能性があり、所望の遺伝子型のために選択された幼虫に適用することができます。痛みはさらにそう脊椎動物を含む他の種の痛みプロセスの重要な理解を収集します熱痛覚を研究するために、このアッセイを用いて、高度に保存されたプロセスであることを考えます。

概要

ショウジョウバエは、新規保存された遺伝子と複合行動の根底にある神経回路の同定のため非常に有用であることが証明されています。ハエは、洗練された遺伝的ツールキットおよび痛覚^5、6、7の細胞および分子の塩基を分析するために、正確な遺伝的および神経操作^{1、2、3、4}を可能にする簡略化し、神経系を提供します。幼虫は^、優しい肌触り^{8、9、10、}有害な熱^11、12、13及び侵害刺激⁴の機械的感覚のための行動アッセイことを考えると、これらの分析に特に有用です ^11は 、既に確立されている、透明幼虫キューティクルは、表皮とその下にある感覚ニューロンのライブまたは固定のイメージングが可能になります。最近では、有害な寒さのためのアッセイはまた、我々は、ここでより詳細に説明^7を 、開発されました。

罰金、円錐先端が冷たいプローブを使用して、我々は、 ショウジョウバエの幼虫が展示優しいタッチ、次の通常の歩行運動中に観察された行動とは別個の冷特有の反応行動のセットを、その、または過酷な機械的または高温刺激^7、8、11の後に示して。冷たい固有の動作は、堅牢なフルボディの収縮（CT）、後部セグメント（PR）の45-90ºレイズとU字型（US）への前部と後部セグメントの同時昇給が含まれています。これらの行動の有病率は減少温度が、Sの各ピークに増加します軽く異なる低温。最近の研究は、CT応答が有害な熱や過酷な機械的刺激⁷に対応するものとは異なる末梢感覚ニューロンによって媒介されることを示唆しています。

多くの脊椎動物の侵害受容器のように、 ショウジョウバエの複数の樹状（MD）末梢感覚ニューロンは、表皮¹の上にarborize複雑な樹枝状構造を有しています。 MDニューロンは、腹側神経索¹⁴への軸索を投射する、すべての幼虫の身体セグメント中に存在します。 MD感覚ニューロンは、樹状形態に基づいて、4つの異なるクラス（I-IV）に分離され、感覚機能^{4、9、10、15、16、17を}変化しています。クラスIVニューロンは、幼虫の横車体ロール応答のために必要とされる一方で高温や過酷な機械的刺激^4、クラスIIIニューロンは穏やかタッチ応答^9、10のために必要とされるのみ冷によって活性化されていないだけでなく、冷誘発行動応答⁷のために必要とされます。両方のクラスIIIおよびクラスIVニューロンが刺激^{9、10、17、19 7、11、18}侵害および非侵害に対する行動反応を促進するために、離散的一過性受容体電位（TRP）チャネルを利用します。さらに、幼虫侵害受容は、細胞²⁰および行動レベル^12、21で、次の傷害を感作されています。

ここに記載されるアッセイはquantificatioすることができます通常の、又は潜在的に周囲温度（18〜22ºC）に有害な冷（≤10ºC）の範囲の低温、無害クール（11-17ºC）に対する行動応答の改変のいずれかのN。このアッセイで使用される低温は、堅牢で再現性のカルシウムが増加し、定性的および定量^7を分析することができる冷誘発行動応答を誘発する、直接クラスIII感覚ニューロンを活性化することができます。このアッセイは、実質的に任意の遺伝子型、ならびに冷痛覚、侵害受容感または侵害受容可塑性に影響を与える遺伝的および環境的双方の因子を決定するために、多様な環境条件（変更された栄養、傷害、薬理学的物質）に曝露された幼虫の幼虫に適用することができます。 thermosensationは、多くの種間でユビキタスであることを考えると、このアッセイは、痛覚の研究のための貴重なツールを提供し、新たな遺伝子標的または改善される神経細胞の相互作用を明らかにします脊椎動物痛覚の我々の理解。

特注コールドプローブは、（コールドプローブ、 材料の表を参照）、熱伝導を介してアルミニウム軸と円錐形先端を冷却する閉ループ温度制御されたペルチェ素子を利用します。アルミニウム円錐形先端は、制御ユニットにリアルタイムの温度を報告内部サーミスタが埋め込まれています。ヒートシンクとファン（熱制御ユニット、 材料の表を参照のこと）を達成することができるペルチェ効果の熱負荷（QC）は（22-0℃）での所望の温度範囲を調節するために、熱電モジュールに取り付けられています。コールドプローブ先端の有害な冷刺激が前方および後方端部から等距離セグメント（単数または複数）に、背側正中線に手で適用される幼虫の（おおよそセグメントA4、 図1Aを参照）。フルボディ：冷たい刺激に応答して、幼虫は、一般的に10秒のカットオフ内の3つの冷誘発行動の1を生産します収縮（CT）、U字状に前方および後方セグメントの45-90º昇給（US）、または（ 結果を参照）後部セグメント（PR）の昇給。これらの行動はいずれも正常な蠕動運動や採餌行動の間に実行されません。これらの挙動も優しいタッチレスポンスと高い温度や有害な機械的刺激に対する嫌悪ローリング応答とは区別されます。

プロトコル

幼虫の調製

1. 25ºCインキュベーターで株式や遺伝的交雑を上げます。
   1. クロスを培養する場合は、20-25処女雌と通常のコーンミールフライメディアを含むバイアルあたり15〜20人の男性を使用しています。女性は、食品の新しいバイアルにそれらを転送する前に、約48時間産卵させます。
2. 4-5日産卵後、穏やかにどろどろ食品及び幼虫への水の流れを噴出することにより、所望の遺伝子型の^第3齢幼虫を収集し、中型、清潔なペトリ皿に内容物を注ぎ出す（60ミリメートル×15ミリメートル）。
3. 次に、穏やかに鉗子を使用して、サイズまたは試験されることから、より大きな「放浪^第3齢」又は小さな病弱幼虫を排除する絵筆によって幼虫を並べ替えます。望ましくない遺伝子マーカーやバランサーを含む幼虫を捨てます。
4. 実験者が元に「ブラインド」になるようにソートされた幼虫が配置される仲間のラボのメンバーのラベルの皿や容器を持っていますperimental状態または該当する場合は幼虫の遺伝子型。実験者は、実験室部材によって生成された鍵を使用して実験した後に収集されたデータに復号化されたラベルを適用することができます。
5. 薬さじを用いて、（34ミリメートル×10ミリメートルまたは60ミリメートル×15ミリメートル）を室温の水できれいに、標識されたペトリ皿充填途中に生鮮食品のダイムサイズの量を転送します。
6. 穏やかに鉗子またはペイントブラシを使用して（テストは20分以上かかると予想される場合飢餓や乾燥を防止するために）食品にソートされた幼虫を移動させます。

2.コールドプローブアッセイ

1. それが所望の温度に冷却するためのいくつかの分を可能にコールドプローブユニットをオンにします。より低い温度に設定した場合、結露はおそらくプローブに沿って形成することになります。
2. 実験室での余分な水分を拭き取り幼虫への適用前に拭きます。ない時はすぐに使用で、場所は絶縁するように、両方の、きれいな先端を保つために、損傷を防ぐため、プローブ上のキャップ絶縁。
3. 暗い可動ビニルの薄片上に中間^第3齢幼虫を置き、明視野顕微鏡下（典型的には、ノートブック・バインダーから切断小片を使用）。コントラスト視覚化およびプローブと適切に整列させるために、それに触れることなく、幼虫の移動の黒ビニルエイズ。
4. 顕微鏡を調整し、コントラストを提供し、早すぎる乾燥から幼虫を防止し、光ユニット（ 材料の表を参照）培地明るさ（50から75パーセントの最大輝度）（ 材料の表を参照のこと）。
5. 彼らは結果を混乱させる可能性があるので最初に通常の蠕動運動を示さない任意の幼虫を捨てます。幼虫は、そうでなければ幼虫は、正常歩行を阻害ビニルに付着する水のペトリ皿から湿ったなければなりません。水は幼虫の周りにパドルべきではありません。
6. CORに幼虫を移動するビニルを使用して、前後体軸に対して90°の角度で幼虫に向かって手でプローブを前進RECT位置（ 図1A参照 ）。
7. 東洋は、プローブの先端を穏やかプローブ顕微鏡ステージに対して約45°の角度を有する幼虫の中間背側表面を横切って敷設します。
8. プローブ接触すると、実験室のタイマーを起動します。依然として前方または後方に移動可能にしながら、わずかに幼虫キューティクルの表面にインデントするのに十分な下向きの圧力を加えます。
9. 最大10秒間またはコールド誘発行動応答が観察されるまで、所定の位置にプローブを保持する - いずれか早い方。その後、プローブを削除します。
10. 観察行動応答と応答待ち時間を記録します。 10秒以内に応答しない幼虫は、「非応答者」とみなされます。待ち時間はまた、応答のために記録および応答ロバスト性/振幅の変化を測定するために使用することができます。
11. 幼虫を破棄し、次の準備。
12. 試験幼虫の所望の数が（N 3組= 20-40幼虫がUた達するまで繰り返し2.3から2.11までステップ）ここでのsed。

結果

時折ポーズ、ヘッドターン、および方向²²の変化を含む蠕動運動とショウジョウバエの幼虫移動します。しかし、有害な寒冷刺激の焦点用途に応じて、幼虫は、有害な熱および機械的刺激に対する嫌悪横ロールとは異なり、独自の行動の集合を示します。これらの行動は優しいタッチ^8、9、10または室温プローブのタッチにも反応は異なっています。次のように冷たい誘発行動は、次のとおりです、収縮（CT）で自分の体の中心に向かって彼らの前部と後部セグメントをscrunchingその前部と後部セグメントの上昇（約45-90°）空気中に、U-を作ります形状（US）、または空気中にのみその後部セグメント（約45〜90°）を上昇させる（PR）（ 図1）。実験者これらの動作記述ではなく、定量的カットオフよりも質的なガイドラインがあ...

ディスカッション

ここに記載のアッセイは、定性的および定量的に様々な遺伝的背景、環境の影響、および/または損傷誘導条件の幼虫に痛覚または侵害受容感を評価するために使用することができます。このアッセイは冷刺激の焦点アプリケーションを可能にするため、このツールを使用すると、ワンは、特に低温に応答して、末梢感覚ニューロンのサブセットの機能を評価することができます。興味深いことに、これらの冷誘発行動は熱^7、11によって活性化されるものよりも感覚ニューロンの異なるクラスを利用するように見えるが、完全な熱侵害受容回路は、まだ完全には理解されていません。他の多くのローカル侵害受容アッセイのように、このアッセイは、コールドプローブの用途に応じてユーザ間のある程度の変動を受けます。しかし、（頭と尾を避ける）半ば体内の寒さのプローブの具体的な配置はsignificaを持っているように見えていません冷たい反応にntの影響^7。実践と繰り返しは、このユーザ間のばらつきを最小限に抑えることができます。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コールドプローブ	Pro-Devエンジニアリング	カスタムメイドのオンデマンド	部品番号と構造の詳細は、ご要望に応じて提供することができます
熱制御ユニット	TEテクノロジー	カスタムビルドエンクロージャ	部品番号と構造の詳細は、ご要望に応じて提供することができます
ツァイスステミ2000顕微鏡	ツァイス	NT55-605
ファイバーライトMI-150 高強度イルミネーター	ドラン・ジェンナー・インダストリーズ。	A20500
ショット デュアル グースネック 23 インチ 光ファイバー ライト ガイド	ショット ノース アメリカ インク	Schott A08575
鉗子	FST	FS-1670	幼虫の選別と取り扱いに使用されます。誤って幼虫を穴を開けたり傷つけたりするリスクを下げるために、鉗子の先端を少し滑らかにし、鈍くしてください
ペイントブラシ	ディック ブリック アート マテリアル	06762-1002	幼虫を分類して取り扱うために使用されます。使用中に絵筆が湿っていると助かります。
35 mm x 10 mmポリスチレンペトリディ	ッシュファルコン	351008
60mm x 10 mmポリスチレンペトリディッシュ	ファルコン	351007
ブラックビニールのピース(少なくとも2インチx 2インチ)			を提供し、幼虫を冷たいプローブに向けるために使用されます
フィッシャーブランドスクープラスパチュラ	フィッシャーサイエンティフィック	14-357Q	食品
キムテックサイエンスキムワイプを移動するために使用されます	フィッシャーサイエンティフィック	06-666A	虫を乾燥させ、水分が余っている場合にプローブを冷やすために使用されます

コントラスト幼