Method Article

リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

DOI:

10.3791/55575

⸱

April 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, 2Inflammation Research Center, VIB, 3Center for Medical Genetics, Ghent University Hospital, 4Cancer Research Institute Ghent (CRIG), 5Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 6Helmholtz Center for Infection Research, 7Mammalian Functional Genetics Laboratory, Division of Blood Cancers, Australian Centre for Blood Diseases, Department of Clinical Haematology, Monash University and Alfred Health Alfred Centre

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

タンパク質は、多くの場合、異なる細胞機能を発揮することができ、複数のドメインを含みます。遺伝子ノックアウト（KO）は、この機能的多様性を考慮していません。ここでは、様々な機能ドメインまたはタンパク質の変異体の分子解剖を可能KO胚性幹細胞における組み換え媒介カセット交換（RMCE）ベースの構造と機能のアプローチを報告しています。

Abstract

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マウスの胚または胚性幹細胞における遺伝子工学（たmESC）は、与えられたタンパク質の機能を研究することができます。タンパク質は、細胞の主力であり、しばしば翻訳後修飾によって影響を受けることができる複数の機能ドメインからなります。条件付きまたは構成ノックアウト（KO）マウスでは、全タンパク質の枯渇を考慮に入れ、この機能的多様性と規制を負いません。 MESCラインとFLPe組換え媒介カセット交換（RMCE）のためのドッキング部位がROSA26（R26）遺伝子座内に挿入された誘導されたマウスモデルは、以前に報告されました。ここでは、マルチドメインタンパク質の異なる機能の分子解剖することができます構造 - 機能アプローチについて報告します。このため、RMCE互換マウスは、KOマウスと交配されている必要があり、その後、RMCE互換KOたmESCを分離する必要があります。次に、推定レスキュー構築物のパネルは、RMCE targetiを介してR26遺伝子座に導入することができますNG。候補レスキューcDNAを容易組換えクローニングを使用してターゲティングベクターのRMCE部位の間に挿入することができます。次に、KOのたmESCはFLPeリコンビナーゼ発現プラスミドと組み合わせたターゲティングベクターでトランスフェクトされます。 RMCEは、ROSA26ドッキング部位でプロモーターレスネオマイシン耐性遺伝子を再活性化し、正しい標的化事象の選択を可能にします。このように、100％に近い高いターゲティング効率は、半高スループット様式での複数の推定レスキュー構築物の挿入を可能にする、得られます。最後に、R26駆動型救助構築物の多くは、親のKOたmESCで観察された表現型を救出する能力について試験することができます。私たちは、P120カテニン（p120ctn）表現型の読み出しとして胚様体（EB）中胚葉分化を使用してのKOたmESCにおける実証の原則構造と機能の研究を提示します。このアプローチは、重要なドメイン、推定下流経路、および疾患関連点の識別を可能にします与えられたタンパク質のためのKO表現型の基礎となる変異。

Introduction

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哺乳動物のゲノムは、約20,000のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていると推定されています。選択的スプライシングと翻訳後修飾は、さらに、タンパク質のレパートリーを増やします。タンパク質は、モジュラー構造1を有し、しばしば、異なるタンパク質複合体へのそれらの動員および複数の細胞プロセス2への参加を可能にする、複数の相互作用ドメインを含みます。一つの例は、p120ctnと呼ばれる多機能性タンパク質です。 p120ctnはCtnnd1遺伝子によってコードされ、N末端およびC末端領域によって隣接大きな中央アルマジロリピートドメインから構成されています。 p120ctnのアルマジロドメインは、細胞 - 細胞接着に関与している古典的カドヘリンの高度に保存された膜近傍ドメインに結合し、それはまた、転写リプレッサーKaisoに結合します。 p120ctnのN末端ドメインは、異なるキナーゼ、ホスファターゼ、小さなRhoGTPases、及び微小管関連Pと相互作用しますroteins 3。興味深いことに、選択的スプライシングの結果として、p120ctnアイソフォームは、4つの代替開始コドン4から生成することができます。それは最も5' 開始コドンから翻訳および全長N末端セグメントを含むようp120ctnアイソフォーム1Aは、最長です。 p12....

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Protocol

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マウス上の全ての実験は、機関投資家、国、ヨーロッパの動物の規定に従って行われました。

RMCE互換KOたmESCの単離

  1. そのようなROSALUCマウス10またはROSA26-のiPSCマウス21などのRMCE互換マウスとヘテロ接合性KOマウスを繁殖。両方のRMCE互換マウスは、混合129 / C57BL6 /スイスの背景上で維持しました。
    注：ヘテロKOマウスとの交配は、ホモ接合型KOマウスの胚性致死を克服することをお勧めします。
  2. R26座12にRMCEカセットを含有するヘテロ接合性KOマウスを選択するためにPCRを使用します。
  3. ヘテロ接合性KOマウスとRMCE互換性、ヘテロ接合性KOマウスを繁殖し、RMCE互換性、ホモ接合型KO胚盤胞を単離します。
    1. 夕方に時間交配を設定し、交尾が翌朝プラグを確認してください。
      注：プラグは男性の凝固及び小胞腺からの分泌物の凝固で作られています。これらのプラグは、女性の膣を満たし、8持続 - 飼育後24時間。差し込まれ、女性は0.5 DPC（日ポスト交尾）の胚を運ぶことが考えられています。
      1. 、プラグをチェックし、彼女の尾の付け根で女性を持ち上げ、によって白っぽい塊のための彼女の膣口を調べるために。プラグは見ることが困難な場合、わずかに角....

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Results

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RMCE互換KO MESC株を単離するための手順は、図2に示されています。二つの連続交配はRMCE互換KO胚盤胞を得るために必要とされています。まず、ヘテロKOマウスはRMCE互換、ヘテロKOマウスを得ることがRMCE互換のマウスと交配されています。これらのマウスは、次いでRMCE互換3.5 DPC、ホモ接合型KO胚盤胞を得るために、他のヘテロ接合性KOマウスとの時限交配のために使用されます。メンデル遺伝によって予測されるような胚を得るチャンスは8内の1つです。したがって、効率的なMESC分離プロトコルが必要です。それぞれpluripotinベースまたは2Iベースのプロトコルを使用して、我々はたmESC株を単離することができ、RMCE互換p120ctn KOたmESCを含む、約94％の効率で（N = 114個の胚盤胞）および64％（N = 22個の胚盤胞） 12、19。典型的には、胚盤胞の孵化後3〜6日でVI

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Discussion

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私たちのMESC分離法は、ユーザーフレンドリーであり、そのような胚盤胞のマイクロサージェリーなどの高度なスキルや設備を必要としません。したがって、この技術は、科学界の大部分にアクセスできます。基本的な細胞培養の経験を持つ誰もがICMの派生物を伝播したmESCラインを確立することができます。しかし、胚盤胞の洗浄及び取り扱いはいくつかの練習が必要です。口のピペットは、胚盤胞を転送するために使用され、マイクロピペット、マイクロピペットホルダ、チューブ、及び吸引口金28から構成されています。マイクロピペットは、数秒間パスツールピペットの最高の部分を加熱する火炎からピペットを除去し、両端を引っ張ることによって、カスタムメイドすることができます。 （ - 200から100μm）の胚盤胞よりも僅かに大きい直径を有する針を選択します。針は、蒸留水（3×）およびEtOH（3×）で洗浄した後に再使用することができます。我々の経験では、pluripotinベースMESC分離の効率は、2と比較して高くなっていますIベースのプロトコル12。しかしながら、高濃度でpl.......

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Disclosures

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著者は、開示することは何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、その優れた技術サポートのためにJinke D'Hont、フレデリック・ヴァン・Rockeghem、ナタリーFarla、ケリー・レメアー、およびRietデRyckeに感謝します。我々はまた、彼らの専門家の支援のための炎症研究センターのバイオイメージングコア施設からEEF Parthoens、EvelienヴァンHamme、およびアマンダGoncalvesの感謝します。私たちは貴重な議論のための私たちの研究グループのメンバーを認めます。この作品は、ベルギーの科学政策によってサポートされていました（Belspo大学間アトラクションのポーランド - 賞IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be）エリザベート王妃医療財団、ベルギー（GSKE 2008年から2010年で、;のhttp：// WWW .fmre-gske.be）、およびゲント大学、ベルギー（http://www.ugent.be/en/ghentuniv）の協調研究アクション（GOA 01G01908）によります。 SGフランダース研究費（FWO-V）のポスドクです。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ROSALUC自家製冷凍精子 ご要望に応じて利用可能
R26-iPSCマウス自家製冷凍精子 ご要望に応じて利用可能
容器プローブファインサイエンスツール10160-13交尾プラグを確認するために
M2 mediumSigma-AldrichM7167アリコートを作成し、-20 °Cで保存します。C
ファイン鉗子 (Dumont #5 Standard tip Student Forceps)Fine Science Tools11251-10使用前に 70% EtOH をスプレー (オートクレーブしないでください)
23 G 針Fine-ject8697
1 mL シリンジSoft-ject6680
60-mm バクテリア グレード プレート (フラッシング用) ゴセリンBB60-01
マウスピペット社内製 ディスカッションを参照
マウス胚性線維芽細胞 (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)ATTCSCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae マウスジャクソン研究所3208
マイトマイシン C Sigma-AldrichM0503
カルシウムまたはマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco14190-094
Tg(DR4)1Jae/J マウスJAX3208マウス ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、6-チオグアニン
0.1% ゼラチンに対する耐性を付与0.5 gを500 mLの蒸留水に溶解し、オートクレーブで保存し、4°Cで保存します。
トリプシン(0.25%) ギブコ25200-056
2 μM pluripotinCayman Chemical10009557
pRMCE-DV1BCCM/LMBPコレクション BCCM/LMBPコレクション(http://bccm.belspo.be)から入手可能なLMBP 08870
cre-emlicised pRMCE-DV1BCCM/LMBPコレクション BCCM/LMBPコレクションから入手可能なLMBP 08195
pCAG-FlpE-IRES-プロ-pA Addgene20733
ヒートショックコンピテント DH5α バクテリア 社内
ゲートウェイ pDONR221 ベクターサーモフィッシャー12536-017カナマイシン耐性遺伝子
BP クローナーゼ II ミックスサーモフィッシャー11789-020
LR クローナーゼ II ミックスサーモフィッシャー11791-020 
ルリアブロス(LB) 
アンピシリン 
Applied Biosystems 3730XL DNA AnalyzerThermo Fisher3730XL
G418Thermo Fisher11811-023
Lipofectamine 2000 トランスフェクション試薬Thermo Fisher11668027
Lipofectamine LTX トランスフェクション試薬Thermo Fisher15338100
Effectene トランスフェクション試薬Qiagen301425
GATEWAY pENTR 1A ベクターサーモフィッシャーA10462組換え適合ベクター
マウスモノクローナル抗p120ctn抗体BDトランスダクションラボラトリーズ610134
マウスモノクローナル抗エカドヘリン抗体BDトランスダクションラボラトリ610181
<ストロング>ジェネラル機器<ストロング>
滅菌解剖ツール子宮を解剖するための細かいハサミと鉗子
滅菌ピペット:5 mL、10 mL、25 mL
15 mLおよび50 mL、円錐形遠心チューブ、
96ウェル培養プレート、V字型底部と平底部) 
培養皿:24ウェル、12ウェル、6ウェルマルチ
チャンネルピペット(ピペット30、50、100、200μL) 
滅菌マルチチャンネルリザーバー
層流
37°Cのインキュベーターへのアクセス。5%CO<サブ>2
C逆さま顕微鏡
ベンチトップ遠心分離機
透過光付き実体顕微鏡へのアクセス 
Culture Media<
strong>MEF Medium4°Cで保管されています。C;37°Cで30分間温めます。C使用前の
ダルベッコ '修正されたイーグル」S medium (DMEM)Gibco41965-062
10% ウシ胎児血清 (FBS)Sigma-AldrichF-7524
L-グルタミン (2 mM)Gibco25030-024 
ピルビン酸ナトリウム (0.4 mM)ギブコ11360-039 
ペニシリン (100 U/mL)Gibco15140-122 
ストレプトマイシン(100 µg/mL)ギブコ15140-122 
SRベースのmESC中4°Cで保存。C;37°Cで30分間温めます。使用前のC
DMEM/F12Gibco31330-0381:1 の比率で混合
15% ノックアウト血清補充 (SR)Gibco10828–028
L-グルタミン (2 mM)Gibco25030-024 
0.1 mM 非必須アミノ酸 Gibco11140-050
ペニシリン (100 U/mL)Gibco15140-122 
ストレプトマイシン(100 µg/mL)ギブコ15140-122 
&β;-メルカプトエタノール(0.1 mM) シグマ・アルドリッチM 3148 
2,000 U/mL 組換えマウス LIF  (IRC/VIB Protein Service facility)
FBS ベースの mESC 培地 (SR ベースの mESC 培地と同様)4°Cで保存;C;37°Cで30分間温めます。C 使用前の
C ノックアウト DMEMGibco10829-018 
15% FBSHycloneSH30070.03E
Differention Medium°C;37°Cで30分間温めます。C
IscoveのModified Dulbecco's Medium(IMDM)Gibco21980-032 
15% FBSHycloneSH30070.03E
5% CD ハイブリドーマ ミディアム(1x) リキッド  ギブコ11279-023 
2 mM L-グルタミンGibco25030-024 
0.4 mM 1-チオグリセロールSigma-AldrichM-6145
50 μg/mL アスコルビン酸Sigma-AldrichA-4544 
ペニシリン (100 U/mL)Gibco15140-122 
ストレプトマイシン(100 µg/mL)ギブコ15140-122 
2i
1 μM Erk阻害剤 PD0325901 軸索 MedchemAxon 1408
3 μM Gsk3阻害剤 CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
マウス の一般公開 (http://bccm.belspo.be) 製ーズ 、へのアクセスへのアクセスへのアクセス4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F.

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