単純なホモジナイゼーションを用いて、神経成長因子を封入するための新規な高密度リポタンパク質模倣ナノ粒子を調製した。課題、ナノ粒子の調製、 インビトロの特性評価、およびインビボ研究の詳細なプロトコールがこの記事で説明されています。
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この記事について
サマリー
要約
この記事の目的は、神経成長因子（NGF）負荷、高密度、リポタンパク質（HDL）模倣性ナノ粒子（NP）の調製および特徴付け方法を紹介することである。 HDLは内因性NPであり、治療剤の送達のための媒体として研究されている。 HDL模倣NPを調製するための様々な方法が開発されている。しかしながら、それらは一般に複雑で時間がかかり、工業規模では困難である。この研究では、一段階ホモジナイゼーションを用いて賦形剤を混合し、プロトタイプNPを形成した。 NGFは26kDaの水溶性タンパク質である。 HDL模倣NPの脂質環境へのNGFの封入を容易にするために、プロタミンUSPを用いてNGFとイオン対複合体を形成し、NGF表面の電荷を中和した。次いで、NGF /プロタミン複合体をプロトタイプNPに導入した。アポリポタンパク質AIを最終的にNPの表面上に被覆した。 NGF HDL模倣NPは、長期間に好ましい特性を示した粒度分布、捕捉効率、 インビトロ放出、生物活性、および生体内分布が含まれる。 HDL模倣NPにおけるホモジナイゼーションの注意深い設計と探索により、手順は大幅に単純化され、NPはスケーラブルに作られました。さらに、NPから無負荷NGFを分離し、 in vitro放出試験を確実に行い、NPの生物活性を測定するなどの様々な課題が克服された。
概要
タンパク質、ペプチド、および核酸などの高分子は有望な投薬として出現しており、過去数十年間でかなりの注目を集めています1,2 。彼らの高い有効性と特定の行動様式のために、彼らは癌、免疫疾患、HIV、および関連する病気の治療のための大きな治療可能性を示す3,4。しかしながら、それらの大きな分子サイズ、三次元構造、表面電荷、および親水性のような物理化学的性質は、これらの高分子のin vivo送達を非常に困難にする。これは彼らの臨床的使用を著しく妨げる4 。マイクロ粒子、ポリマーナノ粒子（NP）、リポソーム、および脂質NPなどの薬物送達システムにおける最近の進歩は、これらの課題を克服し、巨大分子のin vivo送達を有意に改善した。ホこれらの送達貨物に関するいくつかの欠点が明らかにされており、薬物負荷能力が低く、捕捉効率が低く、半減期が短く、生物活性が低下し、望ましくない副作用があることが明らかにされている5,6,7,8。有効なキャリアシステムは依然として研究の関心領域である。さらに、薬物を含むNPを特徴付ける分析方法の開発は、小分子よりも巨大分子にとってより困難である。
高密度リポタンパク質（HDL）は、アポリポタンパク質およびリン脂質単分子膜で被覆された脂質コアからなる天然NPである。内在性HDLは、SR-BI、ABCAI、およびABCG1などの標的受容体とのその相互作用を介して、脂質、タンパク質および核酸の輸送において重要な役割を果たす。それは、異なる治療剤の送達のための媒体として探求されている9、 10,11,12 。 HDL模倣NPを調製するための様々な方法が開発されている。透析は一般的なアプローチです。この方法において、NPは、コール酸ナトリウム溶液を用いて脂質膜を水和させることによって形成される。次に、塩を3つの緩衝液で2日間透析することにより除去する（ 13） 。超音波処理法は、加熱条件下で脂質混合物を60分間超音波処理することによりNPを製造する。 NPはゲルクロマトグラフィーによりさらに精製される14 。マイクロフルイディクスは、マイクロ流体デバイスを介してNPを生成し、マイクロ流体デバイスは、リン脂質およびアポリポタンパク質AI（Apo AI）溶液を、集束パターンで微小渦を生成することによって混合する。明らかに、これらの方法は、工業規模でのスケールアップには時間がかかり、厳しく、困難な場合があります。
この記事では、神経のための新規なHDL模倣NPの調製および特徴付けを紹介する成長因子（NGF）カプセル化。 NGFは、2つの13.6kDaポリペプチドモノマーを含むジスルフィド結合ポリペプチドホモダイマーである。ホモジナイゼーションによってNPを調製し、続いてNGFをNPにカプセル化する新規手順を開発した。 NGF HDL模倣NPは、粒子サイズ、サイズ分布、ゼータ電位、およびインビトロ放出に関して特徴付けられた 。それらの生物活性を、PC12細胞における神経突起伸長について評価した。マウスの静脈内注射後のNGF HDL模倣NPの体内分布を遊離NGFの体内分布と比較した。
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プロトコル
注：すべての手順に含まれている動物試験は、ノーステキサス保健科学センターの施設動物実験および使用委員会の承認を受けています。
1.NGF HDL模倣ナノ粒子の調製
- 賦形剤、ホスファチジルコリン（PC）、スフィンゴミエリン（SM）、ホスファチジルセリン（PS）、オレイン酸コレステリル（CO）およびD-α-トコフェリルポリエチレングリコールサクシネート（TPGS）をエタノールに溶解して1mg / mLの原液を調製する。
注：ストック溶液を等分し、-20℃で保存した。オレイン酸コレステリルは暗いボトルに貯蔵した。 PC、SM、PS、およびCOストック溶液は、それぞれ-20℃で6,13,12および12ヶ月間安定であった。 TPGS溶液は、-20℃で少なくとも12ヶ月間安定であった。 - NGF（水中1mg / mL）10μLをプロタミンUSP（水中1mg / mL）10μLと1.5mLマイクロ遠心チューブで混合し、室温で10分間放置する複合体を形成する。
注：NGFおよびプロタミン原液を等分し、-20℃で保存した。繰返し凍結および解凍はNGFストックには推奨されません。 - ガラスバイアルに、59μLのPC、11μLのSM、4μLのPS、15μLのCO、および45μLのTPGSをガラスバイアルに加える。エタノールを穏やかな窒素気流下で約5分間混合し、蒸発させる。すべての賦形剤は、ガラスバイアルの底部に油状の薄いフィルムを形成すべきである。
- バイアルに1 mLの超純水（1型）を加え、室温で5分間9,500 rpm（8,600 xg）でホモジナイズしてプロトタイプNPを形成する。
- ステップ1.2で調製した複合体をプロトタイプNPに添加し、ガラスバイアル中の小さな撹拌棒を用いて撹拌しながら37℃で30分間インキュベートする。
- 室温でさらに30分間撹拌することによりNPを冷却する。これが冷えた後、106μLのApo AI（1.49mg / mL）を添加し、室温で一晩撹拌して最終NGF HDLを模倣したNP。
2.NGF HDL模倣ナノ粒子のキャラクタリゼーション
- 製造元の指示に従って、粒子分析器（材料表を参照）を使用して、粒子サイズおよびゼータ電位を測定する。
- 架橋アガロースゲルろ過クロマトグラフィーカラムを使用して、非負荷NGFをNGF HDL模倣NPから分離し、NGFの封入効率を決定する。
- カラム調製のために、セファロース4B-CL懸濁液15mLを50mLビーカーに移す。ガラス棒を用いてビーズ懸濁液を撹拌し、カラム（30cm長さ×直径1cm、ガラスフリットを底にして）にいくらかを注ぐ。穏やかにカラムをタップして気泡を取り除く。溶媒を排出させ、ビーズを数分間静置する。
- 残りのサスペンションを追加し続けます。カラムの内壁をすすいでビーズを洗浄します。溶媒レベルがわずかにaになるまで溶媒を排出する固定相の上部に位置する。 1×リン酸緩衝化生理食塩水（PBS、137mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na 2 HPO 4 、および2mM KH 2 PO 4を含有するPBS）20mLでカラムを洗浄し、調整する。
- 無負荷NGFを含む画分を決定するために、200μLのNGF溶液（10μg/ mL）をゲル濾過カラム（長さ25cm×直径1cm）に負荷し、1×PBSで溶出する。
- 合計12の画分（各画分につき1mL）を集め、NGFについてのサンドイッチELISAキットを用いて各画分中のNGFの濃度を測定する。
- サンドイッチELISAキットを使用して、画分6〜10からNGFを検出する。カラムに負荷されていないNGFのクロマトグラムを取得する。 20mLのPBSでカラムを洗浄する。
- NGF HDL模倣NPを含有する画分を決定するために、200μLのNPをカラムに負荷し、1×PBSで溶出する。合計12の画分（各画分につき1mL）を集め、各画分の粒子の強度を測定する。粒度分析器を呼び出す。画分2から4までのNGF NPを検出する。
注：強度は、粒子分析装置によって測定されるパラメータであり、試験溶液中にいくつのナノ粒子が存在し得るかを示す。溶液中に存在するNPが多いほど強度は高くなります。このアプローチによって、本発明者らは、カラムが無負荷NGFからNGF NPを分離できることを確認することができる。 - NGFの捕捉効率を測定するために、200μLのNGF HDL模倣NPをカラムに負荷し、1×PBSで溶出する。合計12の画分を集める（各画分につき1 mL）。
- サンドイッチELISAキットを使用して、画分6〜10から無負荷NGF濃度を測定する。
- 画分6〜10から測定したNGF量を無負荷NGFとして加え、次の式を用いてNGFの捕捉効率を計算する。
％EE =（1-無負荷NGF / NPに添加された総NGF）×100％式（1）
3.NGF HDLのインビトロ放出- ナノ粒子を真似る
- NGF（水中10μg/ mL; n = 4）およびNGF HDL-模倣NP（10μg/ mL; n = 4）を並行して調べる。
- 製造者の指示に従って、8つの透析チューブ（分子量カットオフ：300kDa）を前処理する。
- 放出培地としてPBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）を調製する。 30 mLの放出培地を50 mLの遠心チューブに加え、振とう速度が135 rpmのシェーカーで37℃まで温めます。交換のためにシェーカーに放出培地をさらに50mL入れる。
- 400μLの放出培地を透析チューブに加え、迅速に200μLの試験サンプルを加えて、透析に十分な容量を作ります。
- チューブを閉じ、迅速に透析チューブをリリース培地（遠心チューブ）に入れます。即座に、時間0のサンプルとして、外部透析チューブから放出培地100μLを抜き取る。後で分析するためにサンプルを直ちに-20℃に置く。新鮮な100μLを加える遠心分離管に培地をリースして取り出されたサンプルを交換する。タイマーを開始します。
- 1,2,4,6,8,24,48および72時間で、100μLの放出培地を回収し、100μLの新鮮な培地と交換する。後で分析するために取り出したサンプルを直ちに-20℃に置く。
- 72時間後、すべてのサンプルを-20℃から取り出し、室温で解凍する。サンドイッチELISAキットを用いて放出サンプルのNGF濃度を測定する。
4. NGF HDL模倣ナノ粒子の生理活性（神経突起伸長試験）
- 10％熱不活性化ウマ血清、5％ウシ胎児血清、100μg/ mLストレプトマイシンおよび100単位/ mLペニシリンを補充したRPMI-1640培地中の培養PC12細胞。加湿インキュベーター内で37℃、5％CO 2で細胞を維持する。
- 細胞が約70〜80％コンフルエンスに達すると、培養培地を除去し、細胞を1×PBS（10cm 2あたり約2mL）で洗浄し、2つの培養表面積）。洗浄液を除去する。 0.25％トリプシン-EDTA溶液（0.25％トリプシンおよび1mM EDTA;培養表面積10cm 2あたり0.5mL）をフラスコに添加し、37℃でインキュベートしてほとんどの細胞が剥がれるまで細胞をトリプシン処理します。
- 2倍量の培地を添加し、5分間180xgでスピンダウンする。上清を除去し、5mLの培地で細胞ペレットを再懸濁する。細胞クラスターを破壊するために、22G、1/2インチの針を通して細胞をろ過する。
- 新しい細胞培養フラスコに1：3の比率で細胞を分割する。一晩インキュベートした後、結合していないPC12細胞を除去する。付着した細胞をさらなる成長のために残す。
- この手順を3回繰り返すことにより、強い接着性を有するPC12の継代培養を選択する。 6ウェルプレートに800μL/ウェルのラット尾コラーゲンI型（100μg/ mL）を予めコートする。
- ステップ4.2で説明したように、選択したPC12細胞をトリプシン処理し、22 G、1/2インチ針で細胞クラスターを破壊する。血球計数器で細胞を数える。細胞をプレートに付着させるために、ステップ4.5のプレコートされた6ウェルプレートに10,000細胞/ウェルの密度で細胞を一晩シードする。
- 0.5,1,5,10,50、および100 ng / mLの濃度を調製するために、培地（手順4.1に記載）で遊離NGF（10μg/ mL）およびNGF HDL模倣NP（10μg/ mL）を希釈する。各ウェルから2mLの培地を除去し、2mLの希釈した遊離NGFまたはNGF HDL模倣NPと交換する。 4日間培養する。
- 4日目に、対応する処置を含む新鮮な培地（ステップ4.1に記載）に培地を交換し、さらに3日間処置を続ける。
- 7日目に、倒立光学顕微鏡で細胞を視覚化し、各ウェルを10倍の倍率でランダムスポットで画像化する。
5.NGF HDL模倣ナノ粒子の生体内分布
- 大人のBALB / cマウス（雄、25〜30 g）を用いてNGF NPの組織分布を推定する。グループあたり3匹のマウスからなる3つのグループに無作為にマウスを分ける。マウスを拘束し、尾部をエタノールで拭いて血管拡張および静脈の可視性を促進するために、円錐形のプラスチック拘束具（ 例えば、デカプリコーン）を使用する。
- 100μLの生理食塩水、遊離NGF、またはNGF HDL模倣NPをマウスの各群（3群）に尾静脈を通して40μg/ kgのNGFの用量で注射する。 1 mLシリンジに付属の30 1/2 G針を使用してください。
- 注射30分後に、3％吸入イソフルラン（2L /分の流速で酸素中）を用いてマウスを麻酔する。麻酔の深さを決定するために尾とつまみを実行します。心臓穿刺によって血液を採取する。
- 心臓から約1mLの血液を抜き取る。頸部脱臼によって各マウスを安楽死させる。
- 背臥位にマウス屠体を置きます。外科用はさみを使用して腹部を開き、脂肪と腸を別に移動する肝臓、脾臓、および腎臓を暴露するために綿棒を使用する。これらの組織を採取し、血液をきれいにするために1×PBSですすいでください。
- 直ちに3,400 xgと4℃で5分間血液サンプルを遠心分離して血漿を得る。分析まで血漿および組織を-80℃で保存する。
- 組織サンプルを分析するには、サンプルを-80℃から4℃に移動させ、10倍量の抽出緩衝液（0.05M酢酸ナトリウム、1.0M塩化ナトリウム、1％トリトンX-100、 1％BSA、0.2mMフェニルメタンスルホニルフルオライド、および0.2mM塩化ベンゼトニウム）。 10,000 rpmおよび4℃で5分間ホモジナイズする。
- 手順5.3および5.4に記載されているように、未処置の2匹のマウスを犠牲にして、空の血漿および組織を収集する。空の血漿またはブランク組織ホモジェネートを用いてNGF標準溶液を調製する。
- 上記のように、サンドイッチELISAキットを使用して、血漿および組織ホモジェネート中のNGFの濃度を決定する。
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結果
イオン対戦略によって調製されたHDL模倣、α-トコフェロール被覆NGF NPの工学的スキームを図1に示す 。 NGFの表面電荷を中和するために、プロタミンUSPをイオン対剤として用いてNGFと複合体を形成させた。生物活性を保護するために、プロトタイプのHDL模倣NPを、最初にホモジナイゼーションを用いて操作した。次いで、NGF /プロタミン複合体をプロトタイプNPに封入した。均質化は十分なエネルギーを提供し、賦形剤の混合を首尾よく促進した。 3分間の均質化の後、プロトタイプのNPについて一定の粒径（約170nm）が得られた（ 図2 ）。 Apo AIをプロトタイプNPと異なる条件下でインキュベートした。室温で2時間撹拌した。室温で4時間撹拌し;室温で4時間撹拌し、続いて4℃で一晩インキュベートした。室温で攪拌した。夜。室温で一晩撹拌した場合、Apo AIの26％以上がNPに組み込まれた。 NGF-プロタミン複合体を添加するために、複合体をプロトタイプNPとともに37℃で30分間インキュベートし、Apo A...
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ディスカッション
この研究では、NGFカプセル化のためにHDL模倣NPを調製する簡単な方法を実証する。様々なNP送達系がタンパク質を送達するために研究されている。現在、多くのNP調製物は、透析、溶媒沈殿、および膜水和を含む。これらのプロセスは一般に複雑であり、スケールアップには困難が伴う。このNP発達の間、脂質は容器のガラス壁に強い接着性を有し、薄膜を水和させ、賦形剤を効率的に混合することが困難になることが判明した。天然のHDL NP中の複数の成分を考慮すると、混合はHDL模倣NPの調製に非常に困難かつ重要なものとなった。結果によると、温度および混合時間の増加は、NP形成を助けなかった。ホモジナイザーは、工業的製造における一般的な器具であり、混合のために高いエネルギーおよびせん断力を提供する。この装置をNP調製物に適用することにより、aを有する単分散NP適切なサイズが3分以内に生成され（ 図2および図3 ）、製造時間が大幅に短縮され、調製手順が単純化された。
巨大分子を治療投与に適用する大きな課題は、送達だけでなく処方でもある。...
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
この研究は、Dong、X.に対するNIH R03 NS087322-01によって支持された。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 組換えヒトβ-NGF | クリエイティブバイオマート | NGF-05H | |
| L-&α;-ホスファチジルコリン(PC) | アバンティ | 131601P | 95%、卵、鶏 |
| スフィンゴミエリン(SM) | アバンティ | 860062P | 脳、ブタ |
| ホスファチジルセリン(PS) | アバンティ | 840032P | 脳、ブタ |
| オレイン酸コレステリル(CO) | シグマ | C9253 | |
| D-&α;-トコフェロールポリエチレングリコールコハク酸(TPGS) | BASF | 9002-96-4 | ビタミンEポリエチレングリコールサクシネート |
| プロタミン硫酸塩 | シグマ | P3369 | はUSPテスト仕様を満たしています |
| アポリポタンパク質A1、ヒト血漿 | アテネ研究& | テクノロジー16-16-120101 | 1 mg in 671 & micro;L 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| セファロース 4B-CL | Sigma | CL4B200 | 架橋アガロース, ゲルろ過クロマトグラフィーカラム充填剤 |
| サンドイッチ ELISA NGF | R&Dシステム | DY008 | |
| ウシ血清 アルブミン | Σ | A2153 | |
| RPMI-1640 中 | GE ヘルスケア ライフサイエンス | SH30096.02 | |
| 馬血清 | GE ヘルスケア ライフサイエンス | SH30074.03 | |
| ウシ胎児血清 | ギブコ | 10082147 | |
| PC12細胞 | ATCC | CRL-1721 | |
| ラットテールI型コラーゲン | Σ | C3867 | |
| 酢酸ナトリウム | Σ | S2889 | |
| 塩化ナトリウム | Σ | 31414 | |
| トリトン X-100 | σ | T8787 | |
| フェニルメタンスルホニルフッ化物(PMSF) | σP7626 | ||
| 塩化ベンゼトニウム | Σ | B8879 | |
| 名前< | strong>会社 | カタログ番号 | コメント |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC粒子分析装置 | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2透析装置 | スペクトラムラボ | G235036 | 分子カットオフ 300 kDa |
| 遠心分離機 | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron ホモジナイザー | キネマティカ | PT 1200C | |
| DecapiCone | ブレインツリー・サイエンティフィック社 | DC-M200 |
参考文献
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