プラナリアで瞳の再生を研究するための外科切除アッセイ

プラナリアは、成体幹細胞媒介再生を研究するための強力なモデル生物です。これらの非寄生淡水扁形動物は、その中枢神経系および脳¹を含む任意およびすべての不足している組織を、再生する能力を有しています。 （ インサイチュハイブリダイゼーション 、免疫組織化学、RNA干渉（RNAi）、およびトランスクリプトでは 、このような配列決定ゲノムなど）にまでさかのぼる過去10〜15年間プラナリア分野において1700年代^2、技術の進歩などの検討は、この歴史的なモデル生物を更新しました。具体的には、プラナリアは最近、目の研究の³のための新たなモデルとして人気を得ています。

プラナリアは2つだけの組織タイプ、感光体の神経細胞と色素細胞との原型の目を持っています。これは、その目の幹細胞集団の特性を有効にし、同じ遺伝子の多くは、脊椎動物の眼ドを規制することを示しましたvelopmentはプラナリア^4,5に保存されています。光学カップは視交叉を介して脳を背側に位置する感光体ニューロン及び半月黒色素細胞の白、無着色の樹状突起で構成され、目の神経支配されています。再生プロセス^6を解明するためのモデルであることに加えて、プラナリア眼は光に対して視覚的機構^7、行動反応の進化を研究に適している^8、及び行動⁹の神経学的基礎（プラナリアは、負の走光性を表示します）。

断頭^4、10以下のヘッド再生の一部として、ちょうど眼組織¹¹の切除に続いて^、12：プラナリアにおける眼の再生は、主に二つの主要な文脈で検討されています）15の後ろに切断術を行っているがこれまでで最も一般的なプラナリア眼の切除方法は、細かいガラス毛細管^13、14とパンチ穴を経由してきました。しかし、これらの方法の全ては、潜在的に結果の解釈を複雑に、（例えば、脳、腸、およびnephridiaなど）だけで、目以外の多くの組織の喪失を伴います。ここに提示眼アブレーションプロトコルは、眼に対してより特異的であるデータが得られた（具体的には脳を除く）眼組織への切除を制限します。また、給紙を開始するために7~14日かかる断頭ワームとは異なり、眼アブレーションワームperformeする（RNAiは食物を介して送達される）RNAi実験を可能にする、切除¹²の24時間以内に送ります同時にdは。

目のアブレーションが正常に断頭よりも実行することは技術的に難しいですが、目の切除を含む現在の研究では、その手順の詳細な手順を含めていません。このビデオの記事の目標は、一貫して基本的な脳組織を乱すし、できるだけ少ない他の組織を除去することなく、プラナリアの光学カップを削除するために、研究者を有効にすることです。この方法は、単一及び二重の両方の目の切除のために使用され、研究の広い範囲に適用可能であることができます。最も再生アッセイのような、眼の切除は、薬理学的および遺伝的（のRNAi）スクリーニング、ならびに行動研究の両方との組合せに適しています。ここでは、プラナリアコロニー、および眼のアブレーション技術自体を維持し、ワームの取り扱い方法について説明します。

1.動物文化と取り扱い

注：このプロトコルは、一般的に再生研究のために使用されているSchmidteaメディ 、配列決定されたゲノム¹⁶と二倍体プラナリア種^、17を使用しています。しかし、このアッセイは、Girardia tigrina及び（市販されている）Girardia dorotocephalaなどの他の種と同等に成功しています。

1. 超高純度（又は濾過脱イオン）中、0.5g / Lの海の塩から作られた「ワームの水」は、水にワームを維持します。ワームの水を保持するために、滅菌ポリプロピレンまたはガラス容器を使用します。参照してください。 補足ファイル1ワーム水の準備の詳細については、を。
   注：石鹸などの容器（または他の消耗品）をきれいに石鹸を使用しないでくださいは、虫に対して毒性です。代わりに70％エタノールで拭いて空気乾燥させ。 <オール>
2. 汚染から守るためにプラナリアと協力しながら、手袋を着用してください。
   注：ワームは、石鹸、漂白剤、シャンプー、コンディショナー、ハンドローションを含め、環境有害物質や化学物質に非常に敏感です。

2.準備

1. 実験前に少なくとも1週間ワームを送り停止します。
   1. ≥1週間飼育し、長さが少なくとも5〜7ミリメートルですされていないされているワームを選択します。ウォーム水の完全なペトリ皿2/3にワームを転送し、そして皿の下に定規をスライドさせてウォームの長さを確認します。 wを測定オームズ完全に拡張し、移動しながら。
      注：その後の免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーション分析において 、より大きなワーム（8〜10 mm）を行うと作業が容易であるときに小さく（5~7 mm）の線虫が良く機能するが-特にときに切除するために学びます。
   2. ワームは、全体損傷していない、と最近再生されないことを確認してください。
      注：再生成ワームは、通常、ワームに比べてはるかに軽い（または全くない）ヘッド中の顔料及び/又はテール領域があります。
   3. ワームに対するRNAiまたは薬理学的治療を行った場合は、この時点で行ってください。ワームは、治療（RNAiのためのような）の一部として供給した場合、2.2のステップに続行する前に少なくとも7日間の最後の給餌後に待ちます。
2. 作業スペースをきれいにし、70％エタノールで顕微鏡基盤を解剖し、それが完全に乾燥させます。スコープの左側に選択されたワームの皿を置き。スコープの右に、5/16インチのインスリン針1と＃5鉗子のペア、31 Gを配置mLシリンジ、およびクリーンなトランスファーピペット。
   1. 楽器は（汚染物質を導入する可能性）ベンチに触れてから保管されていることを確認してください。クリーン鉗子、針、およびピペットを保つために（たとえば、箸置きなど）は、剛性のアイテムを使用してください。また、新鮮な茶（無漂白）ペーパータオルの上に場所の楽器。
      注：彼らは右利きの人に関係するとして、これらと後続の命令が書かれています。左利きの人は、左/右の方向を逆にする必要があります。
3. 次のワークスペースに、リントフリーのティッシュワイプのボックス、新鮮なワームの水の供給源、および（ベンチトップから保護）いくつかの余分な転送ピペットを配置します。調剤を容易にするためにプラスチック製の洗浄瓶に入れワーム水。また、切除された動物を収集するためのスコープの右側に標識された12ウェルプレート（または100 ム・ペトリ皿）を置きます。
4. ワームを固定するためにカスタムメイドペルチェプレートを使用する場合、Tの凹部にペルチェプレートを位置決め彼解剖顕微鏡のベースとペルチェプレートの作用面が十分に冷却されるまで、DC電源に出力を調整（典型的には約5 V）.Alternatively 1/2水と完全に100 ム・ペトリ皿を充填しコールドプレートを作ります少なくとも24時間凍結。蓋を捨て、解剖範囲のベースの上に100mmの皿の底に置き、次いで氷（図1A）の表面に直接逆さまに60 ム・ペトリ皿の蓋を置きます。
   1. 水が100 mmディッシュ中で凍結した後、氷の「火山」は、プレートの中央に表示されます。この問題が発生した場合、表面から任意の凹凸を取り除くために、氷のフラットをこすりするカミソリの刃を使用します。
      注：手術中に氷がアブレーションがはるかに困難に、溶けてしまいます。事前にいくつかの氷の皿を準備し、そして、すぐに60ミリメートル皿のふたが浮い始まりとしてアッセイ中のものを溶融するため、冷凍ものを交換してください。
5. 作ります手術表面。プラスチックパラフィンフィルム5cmのX 10cmの片に切断（4 cm ^2であればシャーレコールドプレートを使用）、固定装置の中心に置きます。リントフリーのティッシュを折っ平方およそ^2cm角にワイプやフィルムの上に置きます。白い濾紙1.5-2センチ²の部分をカットし、ワイプの上に置きます。図1B-1Eを参照してください。
   1. 折りたたまれたホールド手袋をはめた指で所定の位置に拭き、軽くそれが折り畳まれたままであることを保証するためにワイプ減衰させるためにワームの水を使用しています。フラットワイプロールホールピペットの側面を使用してください。
      注：冷たい温度が動くからワームを維持するのに役立ちます。作業する「乾燥」も固定化するのに役立ちます。組織は、（致死である）ワームは完全に乾燥させることなく、手術中に湿ったワームを保ち、濾紙を通して水を吸い上げるように作用するワイプ。

3.外科切除

1. 上に置くために、転送ピペットを使用してください濾紙上に電子ワームの背側アップ。上の光源の電源を入れ、光がワームに焦点を当てているように、グースネックを指示。目がはっきり見えるように（全体のワームは、ビュー内にある必要はありません）解剖スコープの焦点と倍率を調整します。 5X倍率は良い出発点です。ヘッドは、（顕微鏡の正面に向かって）研究者に向かって指摘されるように、右に、角度付き30-40度をパラフィンフィルムを回転させてウォームを方向付けます。
   1. 過剰ワームの動きを防ぐために、明るい光の使用は避けてください。プラナリアは、負の走光性を表示し、明るい光を回避しようとします。
   2. ワームは（咽頭可視開口を有する）上向き腹側に位置する場合、緩やか（目可視で）ワームの背側を再配置する鉗子の鈍い面を使用。動物を再配置する際に軟組織を通じて引き裂くの可能性を最小限にするために鉗子の鋭い先端を動物に近づいて避けてください。
2. それは（親指と人差し指の間）のペンであるかのように右手で新鮮な針/注射器を保持します。ペルチェプレート（またはペトリ皿コールドプレート）に対する左手の親指を支える、シリンジの底部が載るれるに支点（図2A）のように左手の親指を使用します。顕微鏡を通して見て、針のベベルが表示されていることを確認してください。
   注：針は非常に鋭いです。それらを取り扱う際は注意してください。ラテックスまたはニトリル手袋を身に着けていることは、いくつかの保護を提供することができます。
   1. 手順を通して針/シリンジ安定を保持し、握手を避けるために左手の親指を使用してください。
   2. 手術の表面安定を保持するのを助けるために左手の親指と（手術表面上の人差し指で）左の人差し指で約40°の角度をなします。
3. とともに（スプーンのように）上向き針のベベルは、眼（図2B）に直角に針を配置します。穏やかに右から左にすくい、眼の眼杯（白、無着色領域）を覆う組織の薄い層を貫通する針の先端を使用します。非常にゆっくりと底に穴をあけたり、光学カップの境界を破壊しないように注意しながら、光学カップ内に配置された任意の着色された組織を除去します。
   1. ワームは手続き中の任意の時点で> 1-2分間ろ紙にされている場合は、ワームを再水和するためにワームの水の一滴を追加します。
      注：脱水は怪我をリッピングするワームの感受性を増加します。
4. 繰り返し黒色着色組織（色素細胞）の全てまでステップ3.3、ならびに光学カップ（光受容細胞の樹状突起）の白色組織の全てが除去されます。丁寧に拭くティッシュで拭いて針の端部に付着し、切除した組織を削除します。二重の目ABLAた場合ンは、所望この時点で第2の眼を切除されています。
   注：けがを避けるために、針はきれいなティッシュで針をつかんで洗浄することができ、その後、親指と人差し指から拭き取るを通じて針を引っ張るためにもう一方の手を使って、親指と人差し指で開催されたワイプ。あるいは、針は、ワイプウェットティッシュの表面上に拭い、清潔のために調べることができます。
5. 完了したら、新鮮なワームの水を含有する標識された皿にワームを移動する移送ピペットを使用。グループのデータを分析した場合、単一の100ム・ペトリに20のワームまで置きます。時間をかけて同じ個体で再生を追跡する場合は、12ウェルプレートの各ウェルに1つのワームを置きます。すべてのワームが転送されると、皿/ウェルから全てのワーム水を除去し、より新鮮ウォーム水で置換することによりワームをすすぎます。
   1. フィルタからワームを除去するために、ウォーム少量の水を有するピペットをバックロードし、ワームに水を放出します。これは、トンを持ち上げる必要がありますろ紙オフ彼ワームは、すぐに転送用のピペット内に吸引されます。
6. 光から保護〜20°C（室温）での実験をインキュベートし、再生プロセスに従ってください。
   注：ワームは、一定の温度を維持するために温度制御インキュベーター内に保存することができるが、これは厳密には必要ではありません。ほとんどの部屋の温度が再生成するワームの能力には影響しません5℃の、によってのみ異なります。
7. 所望される場合、および/またはin situハイブリダイゼーション （ 図3-4を参照）、免疫組織化学のためにワームを固定する遺伝子発現の解析。異なる固定方法は、プラナリア、免疫組織化学^18、19、20及びin situハイブリダイゼーション ^{21、22、23の}プロトコルに存在します。
8. 実験が締結され、sacrifiCEは皿からワーム水を除去し、70％エタノールで置き換えることにより、ワームを生きます。灰色がかっを溶解し、オンにするワームをチェックし、3-5分間ワームをインキュベートします。
9. 一度殺し通常の廃棄物の流れにおける非処理ワームを置きます。環境、特に非在来種へのライブワームを導入することは避けてください。

最初の1-2時間後に手術のために、動物は、無傷のワーム（彼らはまだ移動するが）に比べて減少運動を示すことができます。所望であれば、ワーム（例えば、RNAiの供給のための）手術の24時間以内に食べるようになります。時間をかけて同じ個体では、目の再生を以下の場合は、手術前（未使用）にし、1時間後アブレーション（HPA）の両方で各ワームの写真を撮るようにしてください。 4日後に切除（DPA）によって再生色素細胞が表示され、そして14全体の目が完全に再生されているであろうDPA（ 図3A-B）でなければなりません。これは、光受容体ニューロンおよび脳（ 図3C）、ならびに視覚システム（ 図4A-C）の機能回復への神経支配を含みます。成功したアブレーションは、脳（ 図4D-E）の下にある組織を乱す、また動物（ 図5A）に他の傷害を紹介しません。失敗したアブレーション有する動物を含む：両眼（ 図5B）を接続過度に大きな切除を、動物の側方マージン（ 図5C）に涙、及び/又は腹側表皮（ 図5D）を介して突く創傷部位。また、失敗したアブレーションは、白色無着色組織および黒色色素細胞（ 図5E-F）の両方からなる全光学カップの不完全な除去を含みます。

図1：手術の準備。 （A）コールドプレート構造の概略図、（氷で満たされた）100ム・ペトリ皿の底と（氷面上に逆さまに配置）60ム・ペトリ皿の蓋を使用。 （上から下へ）を白色濾紙、湿った折り畳まれたティッシュ、ワイプ、及びパラフィンフィルム片の積層体から製造された（B）手術面図。（C）（右利き用）を設定手術。 ：解剖スコープ、B：グースネック照明、C：手術面、D：ペルチェプレート、E：アブレーションの準備5〜7ミリメートルワームの皿、F：ウォーム水の洗浄ボトル、G：箸置きクリーン移送ピペットを保持し、 H：箸置き保持針/注射器、I：箸置き鉗子を保持し、J：余分な転送ピペットのコンテナ。 （D）カスタムペルチェプレート構造。 （E）ペトリ皿コールドプレート構造。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：手の位置とアブレーション時の針/注射器。 （右利き用）手の（A）の配置。左の親指が注射器をサポートするために使用されていることに注意してください（開催右手に）動きを最小限に抑えます。ワームの目に関連して、針の（B）の配置。針の斜面が上向きに面することに留意されたいです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：アブレーションされたプラナリアの目が再生します。 Schmidteaメディテラネアの形態 （A）二重目の切除及び（B）は、単一の眼アブレーション以下目を再成長プラナリア。 （C）免疫組織化学は、単一の眼アブレーション下記感光体ニューロン（抗アレスチン）の再生を示します。無傷のワームは、手術の前に示されており、再生成は、日4および切除後の14で示されています。単一の目の切除のために、左目でしたblatedと右目は内部（非損傷）対照としての役割を果たす。赤矢印：アブレーションされた目。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：切除後の視覚系の機能回復。 （A - C）プラナリア羞明を試験するための機能アッセイ。 （A）は無傷のワームは、緑色レーザーポインタからスポットとして光の領域を通って走行避けます。 （B）24時間後に切除で、「ブラインド」二重目切除ワームは、光スポットを通って移動します。 （C）7日後の切除では、二重目切除ワーム光回避を回復するために十分に彼らの視覚系を再生しています。黄色の矢印：異常行動アル応答。 （D - E）目のアブレーションは、光学カップの組織に限定され、基礎となる脳組織を妨げません。 （D）脳のアーキテクチャを示す免疫組織化学（抗シナプシン）1時間後に切除する切除前と変わりません。損傷を示す横断面における1時間後アブレーションで（E）、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は、主にアブレーションされた光学カップの部位に制限されます。 （黒色素細胞を有する）右眼は内部対照として役立ちます。赤矢印：アブレーションされた目。スケールバー=（AC）1ミリメートル1ミリメートル、100ミクロン（DE）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：成功と失敗切除の特徴。 ）trong>（A）が成功単一及び二重目の切除は、元の光学カップのサイズに概ね類似している傷を持っています。 （B - E）失敗切除：（B）が多すぎる組織を取り除いたり傷が両眼、（C）創傷部位の涙を接続し、余白に拡張され、傷が深すぎると、（D）から突き抜け腹側に背側（D）（D」）側、及び（E - F）は光学カップ組織の全てが除去され、両方の形態学的に（E）と感光体ニューロン（F）の抗アレスチン染色によって可視化しました。黄色の矢印：異常な切除。黄色の丸：アブレーション部位。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者は、開示することは何もありません。