このプロトコルは、一貫して、周囲の組織を乱すことなく、プラナリア目（光学カップ）を切除する方法を示しています。インスリン注射針と注射器を使用して、一方または両方の目のどちらかは、目の再生、視覚的な再生の進化、および光誘起行動の神経基盤を調節するメカニズムの調査を容易にするために、アブレーションさせることができます。
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方法論記事
プラナリアで瞳の再生を研究するための外科切除アッセイ
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
成体幹細胞と再生機構の研究では、プラナリア扁形動物は、in vivoモデル系の主食です。これは彼らの豊富な多能性幹細胞集団と、ほとんどの動物のために壊滅的だろう怪我した後、すべての細胞や組織の種類を再生する能力に大きな部分的に起因します。最近、プラナリアは、目の再生のためのモデルとして人気を得ています。 （2つの組織タイプから成る：色素細胞及び光受容体）全体の目を再生する能力は、視覚系の再生を制御する機構の切開を可能にします。眼アブレーションは、再生だけで眼の組織に大きく制限されていることが最も重要なものの眼特異的経路およびメカニズムを調べるため（例えば断頭又は穴パンチのような）他の技術を超えるいくつかの利点を有します。このビデオの記事の目的は、確実に脳を乱すまたは組織を囲むことなく、プラナリアの光学カップを削除する方法を実証することです。ワームや確立コロニーのメンテナンスの取り扱いも記載されています。この技術は、外科的にコールドプレート上に固定化されたプラナリアの眼杯をかき出すために31 G 5/16インチのインスリン針を使用します。この方法は、アプリケーションの広い範囲を可能にする、目が1〜2週間以内に再生すると、単一及び二重の両方の目の切除を包含する。特に、このアブレーション技術は、容易に再生機構とその進化、目の幹細胞およびそれらの維持、及びphototaxic行動反応とその神経基盤のより良い理解のために、薬理学的および遺伝的（RNA干渉）スクリーンと組み合わせることができます。
概要
プラナリアは、成体幹細胞媒介再生を研究するための強力なモデル生物です。これらの非寄生淡水扁形動物は、その中枢神経系および脳1を含む任意およびすべての不足している組織を、再生する能力を有しています。 （ インサイチュハイブリダイゼーション 、免疫組織化学、RNA干渉（RNAi）、およびトランスクリプトでは 、このような配列決定ゲノムなど）にまでさかのぼる過去10〜15年間プラナリア分野において1700年代2、技術の進歩などの検討は、この歴史的なモデル生物を更新しました。具体的には、プラナリアは最近、目の研究の3のための新たなモデルとして人気を得ています。
プラナリアは2つだけの組織タイプ、感光体の神経細胞と色素細胞との原型の目を持っています。これは、その目の幹細胞集団の特性を有効にし、同じ遺伝子の多くは、脊椎動物の眼ドを規制することを示しましたvelopmentはプラナリア4,5に保存されています。光学カップは視交叉を介して脳を背側に位置する感光体ニューロン及び半月黒色素細胞の白、無着色の樹状突起で構成され、目の神経支配されています。再生プロセス
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プロトコル
1.動物文化と取り扱い
注：このプロトコルは、一般的に再生研究のために使用されているSchmidteaメディ 、配列決定されたゲノム16と二倍体プラナリア種、17を使用しています。しかし、このアッセイは、Girardia tigrina及び（市販されている）Girardia dorotocephalaなどの他の種と同等に成功しています。
- 超高純度（又は濾過脱イオン）中、0.5g / Lの海の塩から作られた「ワームの水」は、水にワームを維持します。ワームの水を保持するために、滅菌ポリプロピレンまたはガラス容器を使用します。参照してください。 補足ファイル1ワーム水の準備の詳細については、を。
注：石鹸などの容器（または他の消耗品）をきれいに石鹸を使用しないでくださいは、虫に対して毒性です。代わりに70％エタノールで拭いて空気乾燥させ。 <オール> - 汚染から守るためにプラナリアと協力しながら、手袋を着用してください。
注....
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結果
最初の1-2時間後に手術のために、動物は、無傷のワーム（彼らはまだ移動するが）に比べて減少運動を示すことができます。所望であれば、ワーム（例えば、RNAiの供給のための）手術の24時間以内に食べるようになります。時間をかけて同じ個体では、目の再生を以下の場合は、手術前（未使用）にし、1時間後アブレーション（HPA）の両方で各ワームの写真を撮るようにしてください。 4日後に切除（DPA）によって再生色素細胞が表示され、そして14全体の目が完全に再生されているであろうDPA（ 図3A-B）でなければなりません。これは、光受容体ニューロンおよび脳（ 図3C）、ならびに視覚システム（ 図4A-C）の機能回復への神経支配を含みます。成功したアブレーションは、脳（ 図4D-E）の下にある組織を乱す、また動物（ 図5A）に他の傷害を紹介しません。失敗したアブレーション有する動物を含む：両眼（ 図5B）を.......
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ディスカッション
この眼アブレーション技術は、脳組織を除くと眼組織に主に切除を制限することによって（例えば、ホールパンチなど）現行の方法を改善します。練習では、この技術は、経験の浅いが、良心的な学部の学生にmicrosurgeriesに経験した技術者から、ほとんどの人によって行うことができます。なお、この技術は、前免疫組織化学によって、または眼のマーカー（S）4、5、13のためのin situハイブリダイゼーションのすべての眼組織の完全な除去の（可能な）確認を含む、実験にアブレーションを使用して何度も実施することが推奨されます。このプロトコルの中で最も重要なステップは、組織のうちすくいです。多すぎても少なすぎても組織のいずれかを削除しないことが重要です。これはワームの腹側に貫通を避けるために、針で深くすくっていないことで回避できます。旧姓の先端DLEは深さ約0.4ミリメートルを挿入しなければならない、と針のベベル部分が目を介してすべて.......
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開示事項
著者は、開示することは何もありません。
謝辞
著者らは、ペルチェプレートについては、この抗アレスチン抗体のための機能的アッセイの支援のために眼アブレーション技術、テイラー・バークホルツ、マイケル・レビン、及び淳二Morokumaを完成するためのミッチェル・デオッカンド感謝したいです。この作品は、WSBにウェスタンミシガン大学からSFSAの助成金によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| インスタントオーシャンシーソルト | スペクトラムブランド | SS15-10 | "10ガロン"ボックス (正味重量3ポンド) |
| Kimwipes EX-L 糸くずの出ないティッシュペーパー | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 x 8.5 in |
| Whatman #2 濾紙 | Sigma | WHA1002125 | 円、直径125 mm、白色 |
| のイージータッチインスリン注射器(針付き) | ペットヘルスマーケット | 17175-04 | U-100 1 ccシリンジ、31 G 5/16 針 |
| 100 mm ペトリ皿 | VWR | 25384-342 | 100 mm x 15 mm |
| 60 mm ペトリ皿 | VWR | 25384-092 | 60 mm x 15 mm |
| デュモン #5 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11254-20 | イノックス、ストレートチップ、11 cm |
| トランスファーピペット | サムコサイエンティフィック | 225 | 目盛り付き、大型電球、7.5 mL、非滅菌 |
| パラフィルムMパラフィンフィルム | ブランド | 701606 | 4 in x 125 ft ロール |
| 12 ウェル未処理組織培養プレート | VWR | 15705-059 | 未処理、平底、滅菌、ファルコン ブランド |
| プラスチック食品容器 (コロニー用) | ジップロック | ラージレクタングル | 2.25 qt(2.12 L)、10 "x 6 -3 / 4" x 3 -3 / 16" |
| Planaria (Girardia tigrina) | Carolina Biological | 132954 | 「Brown」Planariaとして販売されています。ほとんどの場合、G. tigrina (aka Dugesia tigrina)ですが、G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); どちらでも機能します。 |
| プラナリア(Schmidtea mediterranea) | n/a | n/a | S. mediterraneaは市販されていません。現時点では、動物はそれらを使用し、追加の動物を飼っている研究所からのみ入手できます。 |
| 茶色のペーパータオル | グレインジャー | 2U229 | 9-3/16 x 9-3/8" 1 層マルチフォールドペーパータオル、無漂白ウォ |
| ッシュボトル(ワーム水用)、オプションの | VWR | 16650-275 | ウォッシュボトル、低密度ポリエチレン、広口、500 mL |
| 抗シナプシン抗体、オプション | の開発研究 ハイブリドーマバンク | 3C11 | 上清 |
| 抗アレスチン抗体、オプション | 該当なし | 市販されていません。マイケル・レビン、タフツ大学 | |
| ナルゲン・ローボーイ・カーボーイ、スピゴット付き(ワーム水の貯蔵用)、オプションの | ナルゲ・ヌンク・インターナショナル・コーポレーション | 2324-0015 | 15 L、 ポリプロピレン、ロープロファイルはプラスチックコロニーコンテナの充填を容易にします |
| カスタムペルチェプレート、オプションの | ウィリアムズマシン、フォックスボロ、マサチューセッツ州 | n/a | デザインの詳細は、タフツ大学の諸熊淳二氏による提供: ペルチェプレートは、標準的な熱電ヒートポンプ(例えば、All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2)で構成されています。正方形のヒートポンプは薄い鏡面で覆われ、円形のプレキシガラス形状(直径<~50mm)の30mmsup>2の正方形の穴の中に配置されます。この形状はヒートポンプと同様の厚さで、丸いヒートシンク(直径~115mm)の中央に設けられたウェルに平らに収まります。フォーム/ヒートポンプは シリコンベースのヒートシンクコンパウンドでシンクに「固定」されています。リード線は、フォームとヒートシンクの両方に開けられた穴に通されています。ヒートシンクの下半分は、顕微鏡のベースプレートの開口部に収まる「足」に工具で固定されています。 |
| DC電源(ペルチェプレート用)、オプションの | B&K Precision | 1665 | 安定化低電圧DC電源、1-18 V(DC)、1-10アンペア。 |
| その他の一般的な消耗品 | |||
| 手袋 | |||
| カミソリの刃 | |||
| はさみ | |||
| ースネック照明 | |||
| チョップスティックレスト、オプション |
参考文献
- Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration. Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).
- Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. Th....
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