方法論記事

ひと血清における心筋バイオ マーカーを定量化する臨時の光伝送を使用してください。

DOI：

10.3791/55597

⸱

2017年12月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NUS Nanoscience and Nanotechnology Initiative, National University of Singapore, 2Cardiovascular Research Institute, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Department of Electrical and Computer Engineering, National University of Singapore, 4Institute of Materials Research Engineering, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業では、異常な光透過の原理で動作する高品質センシング アレイを作製するナノイン プリント リソグラフィ法について説明します。バイオ センサーが低コスト、堅牢で、使いやすいと心筋トロポニンを検出することができます私は臨床的に関連性の高い濃度 (99thパーセン タイル カットオフ ∼10 400 pg/mL、アッセイによって) 血清で。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ポイント ・ オブ ・ ケア (POC) 設定の臨床的意義を持っているバイオセンシング プラットフォーム、アッセイの感度、再現性、およびひと血清の背景に検体を確実に監視する機能が重要です。

ナノイン プリント (NIL) リソグラフィは、センシン 1.5 mm × 1.5 mm ほど低コストで作製する使用されました。ナノホール各約 140 nm2の領域の忠実度の高い配列のセンサー面をしました。NIL の偉大な再現性では、チップに変化が少なく、12 の個別に製造面 1 チップ、1 測定戦略を採用することが可能。これらのナノイン プリントの局在表面プラズモン共鳴 (LSPR) チップが確実にこのケースでは、人間の血清の流体の複雑な背景中 75 ng/mL に 2.5 から様々 な濃度で bioanalyte を測定する能力を広範囲にわたってテスト。NIL 可能このバイオ センサーは一般に利用できる実験室光源に簡単にインターフェイスできるので、順番、顕微鏡の必要性を排除する大きなセンシング分野の世代の高忠実性。これらのバイオ センサーを検出できます心筋トロポニン血清中 0.55 ng/ml 検出 (LOD) の制限で、感度の高い臨床的に適切であります。彼らはまた低いチップ ・ ツー ・ チップの差異 (作製プロセスの高品質) を示します。結果が広く使われている酵素免疫測定法 (ELISA) とけた違い-基づいた試金が LSPR ベース センシングプラット フォーム (すなわち、こうして小型化、多重化、それを作るの利点を保持する技術現実的な POC アプリケーション)。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ナノホール アレイを用いた化学センサー異常な光透過 (EOT) の最初のレポートは Ebbesenら1998年1によって出版されたので多くの捜査の対象とされています。サブ波長サイズのナノホール構造体の周期的な配列に光が入射する、特定の波長の高度な転送が発生します。これには、ブロッホ波表面ポラリトン (BW SPP) および/または局所励起表面プラズモン (LSP)2と入射光のカップルとが発生します。

悪用された場合、このような周期配列を用いた、単純な基になる物理的な原則。または金属製界面近傍の分子の吸着は、ターンではスペクトルの透過帯の場所をシフト、金属との接触媒質の誘電を変更します。スペクトル自体は、ナノ工学、形状、サイズ、および分離距離3,4,5で調整できます。仕様では、EOT に基づくセンサー分子結合イベントの調査の間に特定の割り当て6,7、8を促進するスペクトルに特徴的なバンドがあります。これ市販の表面プラズモン共鳴 (SPR) プラットフォーム上の重要な利点です。

通常 EOT を利用したセンサーには、光源が平行光がセンサー面に入射するように光学的配置が含まれます。共重合体のテンプレートと干渉やナノ粒子リソグラフィーなどの大きなナノホール サーフェスを生成する技術は、再現性に乏しく9を持っています。正確に EOT 現象を示す大きな面を加工でこれらの制限により光学顕微鏡光源と検出器を適切に配置する必要があります。技術、ナノイン プリント高品質・ リソグラフィーを簡素化するには、(NIL)10が採用されました。これはチップにセンサー面を顕微鏡の必要性を削除する大規模なセンサー表面領域11 (mm スケール) の生産が可能。代わりに、このセンサーは、簡単に標準的な光ファイバケーブルと接続する可能性があります。

このナノホール アレイの伝送のピークは、可視近赤外領域 (NIR) に含まれている、ので、生体分子の水溶液環境のバインド イベントを検出に最適です。ナノホール アレイの光動作をシミュレートしました。結果は、標準屈折 (RI) の液体の研究を通じて確認されました。この配列は、心筋トロポニンの濃度を測定する使用された私 (cTnI) ひと血清の複雑背景下で。cTnI は急性心筋梗塞の診断のための臨床のゴールド スタンダードです。

このセンサーを使用して、検出し、臨床的に適切である 0.55 ng/ml 検出 (LOD) の制限でひと血清中 cTnI を定量化することが可能です。検出は、酵素免疫測定法 (ELISA) は、このドメインで最も一般的に使用される技術よりも速いです。さらに、センサー面が簡単に再生され、そのため再利用します。したがって、この作業は複雑な生体内バイオセンシングのための現実的なポイント ・ オブ ・ ケア (POC) 技術としてナノホール アレイの約束を示しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 作製センサーとデータの取得

  1. ニッケル鋳型の作製
    1. 負の電子ビームの 220 nm 厚層のコートにシリコンウエハ 4 で 600 μ m 厚に抵抗します。電子ビーム露光システムを用いたウェーハ用に設計されたナノホール配列を記述します。
      1. フィールド サイズを 300 μ m ごとに 20 k の低 dotmap (N) とパターンの書き方を書いて電子ビームを加速する (A) (すなわち、そこ 4 億ドット各 300 μ m2の領域にマップされている、そしてかどうかは、電子ビームによって各ドットが公開か、パターン設計によって)。110 μ cm− 2レジストの eb レジスト被曝線量を設定および 800 の電流 (I) で書き込みペンシルバニア州
        注記: 電子ビーム書面によって計算されたドット (Tドット) ごとに露出時間によって制御されます被曝線量 (D) figure-protocol-1 。各露出のドットに電子ビーム住居時間は、110 μ cm− 2で被曝線量、0.5 μ s12です。配列をキャプチャ 1.8 mm2の面積は、300 μ m2分野フォーム 1 つ大きな、ゴールドのナノホール アレイに一緒にステッチの 36 パッチの合計があります。
    2. 10 開発者向けに 4 インチのシリコンウェハーを浸すことによってレジストを開発 s とウェーハの空気で乾燥させます。
    3. シリコン基板上、金属は、ニッケル、銅、アルミニウムなどのシード層を入金します。
    4. ニッケル スルファミン酸ニッケル浴のめっきシステムでウェハを電気メッキします。2 つの手順でめっきを行います。最初の手順では、永続的な 95 分で 0.7 A dm− 2; の電流密度を使用して、これは完全にニッケル 28awd-4 を塗りつぶします。2 番目の手順では、125 分を持続させる最終的なニッケル金型厚さ 300 μ m に到達する 12 A dm− 2を使用 (20 nm)。PH 値は 3.5 3.8、52-54 ° C の温度であることを確認します。
    5. 穏やかな機械的な力を適用することによって、シリコン基板からニッケル金型を区切ります。ポジ型フォトレジスト除去試薬一晩電子線レジスト残渣を洗い流すための約 100 mL でニッケル金型を浸します。
    6. 3 h の 100 ° C でオーブンと乾燥、ニッケル鋳型をフィード ・ プラズマ エッチング システム 10 sccm で O2ガスと 100 W 3 分でそれをきれいに。
  2. 金ナノ構造の作製
    1. コートでニッケル鋳型上の観察 1,1,2,2 偏光トリクロロシラン (FDT) の 150 μ L、80 ° C の自己組織化単分子膜 (SAM) コーティング マシン
      注: これはナノイン プリントのステップの完了後 (「離」) フォトレジストから金型の分離を可能にする付着防止層を形成します。蒸発時間が 180 にする必要があります s、および反応時間は 900 をする必要があります s。
    2. 28awd-4 の 4-10 バールの圧力、温度 40 ° C で 10 分間ナノ インプリンターを使用して光硬化性 NIL 300 nm 厚層を塗布したガラス基板に抵抗を捺印します。
    3. 紫外線硬化システムおよび 75 mW cm-2 30 の紫外線露出に photocure ガラス基板上、フォトレジスト、金型を転送 s。
      注: すべての手順に正しく従っている場合ニッケル型する必要があります簡単にする demolded フォトレジストから。
    4. 反応性イオン エッチング (RIE) 装置 2 の 50 W の 10 sccm の O2ガス流れと、ガラス基板上のフォトレジストの空白 etch を実行 s インデント領域にガラスを公開します。
    5. 電子ビーム蒸着機でガラス基板上にクロム (Cr) 金属接着用の 5 nm 厚層とプラズモン センサーのための金 (Au) の 100 nm 層を入金します。1 成膜速度を使用して、Cr の 2 Å の s− 1 Å s− 1 au。
    6. 3 分 15 秒音声化ステップ アセトンで続いて用エッチング O2プラズマによるフォトレジストのリフトオフを実行します。
    7. サンプルを 5 mm × 5 mm チップにサイコロします。ナノホール アレイは、中央 2 mm × 2 mm のチップを占有します。
  3. データの取得
    1. 白色光送信機の光ファイバーの終了を終了のビーム平行光がセンサーの表面 (ナノホール アレイ) に 90 ° で入射、光の測定を行う装置を設定します。
      注: 光は全体ナノホール配列を介して送信されます。
    2. 受信機光ファイバーの伝送信号を収集し、紫外可視分光計 300 に 1,000 の範囲内で動作を記録 nm。
    3. 測定のノイズが低減する最終的なスペクトルを取得する 20 さん平均 100 フレームにフレームごとに集録時間を設定します。
    4. 印刷ソフトウェアを使って、以前に識別された伝送のピーク (ローレンツ ベースのメソッドを使用して) に基づくデータを分析します。

2. センサー一括感度テスト

  1. 1.39 に 1.31 からさまざまな RI の液晶セルに標準の RI 液体を入金します。
  2. 標準の RI 液体センサー チップを浸し、白色光のビームに合わせます。透過スペクトルを得る。
  3. 界面活性洗浄試薬と各データ測定後センサー チップをきれいにし窒素ガスで乾燥します。

3. センサー表面改質

  1. 前の任意の化学修正連続脱イオン水、アセトン、イソプロパノール浸漬によってセンサー チップをきれい。乾燥窒素ガスのストリームで常温乾燥。
  2. 0.4 mM 10-カルボキシ-1-複数と 1.6 mM 1-オクタンチ オール室温で 12 h のエタノール溶液にセンサー チップを孵化させなさい。
    注: これは形成アミン反応性自己組織化単分子膜 (SAM)。
  3. 徹底的に洗浄し、室温で乾燥エタノールを使用します。
  4. 75 mM スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド (スルホ-NHS) と 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) の混合物を作る。15 分のこの混合物のチップを浸します。
    注: これは SAM のカルボキシルをアクティブになります。
  5. センサー表面に pH 4.5 酢酸緩衝液で 200 μ g/mL 抗トロポニン抗体溶液 50 μ L をスポットし、30 分間インキュベートします。
  6. 1 M エタノールアミン HCl 溶液中 15 分間でセンサー チップを浸すことによって未反応のエステルを非アクティブ化します。
  7. 室温で乾燥窒素ガスのストリームで乾燥して脱イオン水でチップをすすいでください。

4. cTnI アッセイ

  1. 表面に 1% ウシ血清アルブミン (BSA) 溶液 100 μ L スポッティングして任意の非特異的結合をブロックします。
15 分間インキュベートします。
  • リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 液に 3 回センサー チップをすすぐ。透過スペクトルを記録する測定セルにチップを挿入します。
    注: これは参照スペクトルです。
  • CTnI チップ表面に標準の 50 μ L をスポットし、30 分間、湿った環境で孵化させなさい。
  • センサー チップ 3 回 PBS 溶液中をすすいで透過スペクトルを記録する測定セルに挿入します。
    注: これはアフター結合スペクトルです。
  • 50 mM グリシン塩酸の (pH 2) 1 分のチップが水没し、すすぎ PBS 溶液中 3 回チップ表面を再生成します。再生のステップの成功を確認する PBS の透過スペクトルを測定します。

    • 5. 表面プラズモン共鳴 (SPR) 測定

    1. PBS T バッファーを用いた SPR に多重の SPR センサー チップを実行します。
      注: PBS T バッファーの組成は 0.05%、150 mM の NaCl、20 mM リン酸 Na トゥイーン 20。PH は 7.4 です。
    2. 手順 4 の説明に従って cTnI 標準と、抗体を使用します。
    3. EDC (0.2 M) とスルホ-NHS 5 分 50 μ g/mL の抗体 560 の 5 分の注入を実行 (0.05 M) の混合物との 1 M エタノールアミン HCl 溶液 5 分注入 6 使用可能なチャネルのうち 3 をアクティブにします。
    4. センサー チップを 90 ° 回転し、異なる濃度で cTnI 基準を注入 (75、30、7.5 2.5 ng/mL)。
    5. SPR 読み出しを介してリアルタイムでチップ上の相互作用のスポットで抗体の共役を観察します。
    6. 1 分 50 mM グリシン塩酸 (pH 2) を注入することによりチップを再生成します。

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    結果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    図 1 aに測定の光のセットアップを示します。実際ナノホール配列のイメージは図 1 bで与えられます。検出プロセスを運転の物理学を理解するため COMSOL シミュレーション ソフトウェアは水溶液環境のプラズモニック フィールド分布をシミュレートするために使用されました。シミュレーションの結果から、実際の測定に関連していた。以前に発行された研究には、仮定しシミュレーション11,13で使用するパラメーターの詳細が含まれています。ナノホール配列は次のように、プラズモニック フィールドをシミュレートするために使用される物理的な寸法: p = 400 nm、D = 150 nm、および T = 100 nm。透過スペクトルを計算するとき、吸収と散乱効果はアカウント14にも取られます。シミュレートされ...

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    ディスカッション

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    入射光とナノ構造の相互作用をシミュレートすると、試料の濃度の関数としてのシフトを記録できる (透過スペクトル) の適切なピークを識別することが可能になります。センサーの構造に関してバンドのローカリゼーションは試料を意味するそのシフトを追跡ことができます右のバンドを選択することが重要に注意してくださいすることが重要です。シミュレーションにより可視化を実現できます。これはまた analytes のバイオセンシングを可能にする最適構造の設計に重要です。ご覧のとおり、バンド I と III ゴールド ガラス インターフェイスのローカライズされ、したがって、バイオセンシングのため有用ではないです。著名な LSPR コンポーネントはバンド II 内部で観察できます。短いディケイの長さを示し、ナノホールの縁にローカライズされます。など、これは濃度の検出に使用されているにも適しています。全体の配列を介して作製したナノ構造体の品質が収集したスペクトルの質にも欠かせません。非一様構造は、工芸品をご紹介いたします。

    散乱とやむを得ない吸収水性測定で工芸品を作成します。全体の信号雑音比も、水性媒体の存在に...

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    開示事項

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    著者は競合する金融興味を持ってないです。

    謝辞

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    AP には、教授 T Venkatesan、ディレクター、NUS ナノサイエンス ・ ナノテクノロジー ・ イニシアティブ副大統領 (シンガポールの国民大学) (R-398-000-084-646) のオフィスのサポートが認めています。CLD は、サポートのシンガポール省の保健医療研究評議その臨床医科学者資金調達スキームの下でナノ材研/CSA/035/2012, とシンガポール国立大学を認めています。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    電子ビームリソグラフィーセットアップElionix ELS 700
    o-XyleneSigma Aldrich95662
    EBレジスト住友商事NEB-22A2
    現像試薬Shipley CompanyMicroposit MF 321
    電気めっき機Technotrans AG RD 50
    フォトレジスト剥離剤 ローム&ハース電子材料 LLCマイクロポジットリムーバー1165
    エッチングシステムトリオンファントム
    ヘプタデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロデシル)トリクロロシラン Gelest(ペンシルベニア州、米国)78560-44-8
    SAMコーター 株式会社ソロナAVC 150M
    光硬化型NILレジストマイクロレジストテクノロジーGmbHmr-UVCur21-300nm
    光硬化システムDymax 2000年型フラッド
    電子ビーム蒸着装置デントンエクスプローラー
    紫外可視分光器 Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    標準屈折率液 Cargill Inc (Cedar Grove, USA)18032
    プロットソフトウェアOriginOrigin Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol 同人堂研究所(日本)C385-10
    1-オクタンチオール Sigma-Aldrich, MO, USA471386
    スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドおよび1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド BioRad (CA, USA)1762410
    Anti-troponin antibody 560Hytest (Finland)4T21
    Ethanolamine-HCl solutionBioRad (CA, USA)1762450
    Surface Plasmon Resonance setupBioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR chipBioRadGLC
    Human cTnI standardPhoenixPharmaceuticalsEK -311-05
    Glycine-HClBioRad (CA, USA)1762221

    参考文献

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391 (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200 (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10 (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89 (12), 121106(2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452 (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4 (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5 (5), 818(2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29 (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19 (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13 (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29 (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10 (3), 0120974(2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85 (20), 9564-9571 (2013).

    アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

    再版と許可

    このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

    許可をリクエスト

    タグ

    関連記事