成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

サマリー

ラット心臓から様々な心臓細胞型を単離するためのいくつかのプロトコールが開発され、記載されている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にし、実験コストを削減する最適化プロトコルが記載されている。

要約

ラットは、心臓血管研究で使用される重要な動物モデルであり、心臓肥大、線維症、およびアテローム性動脈硬化症のような心臓血管疾患進行の分子メカニズムのインビトロ分析のためにラットの心臓細胞が日常的に使用される。これらの細胞機構を理解するために、循環系から不死化細胞株を開発するために様々な試みがなされてきたが、初代細胞は、そのような研究のためにより自然かつ近似したin vivo環境を提供する。したがって、特定の細胞型に取り組んでいる異なる研究室では、目的のラット心臓細胞の個々の型を単離するためのプロトコールが開発されている。しかし、複数の細胞タイプの分離を可能にするプロトコルは欠けている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にする最適化されたプロトコールが記載されており、細胞分析に使用する。これにより、利用可能なリソースを最も効率的に使用することができ、時間を節約し、研究費を削減することができます。

概要

げっ歯類のモデルは、健康や病気の心血管生理学の理解を広げるためのツールとして長い間使われてきました。これらの動物モデルは、臓器レベルで疾患の病態生理を理解し、心血管疾患の治療に使用される様々な薬理学的薬剤の薬物動態および薬力学を分析することを可能にするが、心血管疾患発症の分子メカニズムの理解および細胞型は、 インビトロ細胞培養モデルの使用を必要とする。この目的のために、心臓血管系からの異なる不死化細胞株が開発された。しかしながら、新たに単離された初代細胞は、生理学的および機能的に生きた組織および生物に関連している。

心臓は、心臓血管のあらゆる主要なタイプの細胞を含む汎用性のある臓器であるラット心臓は依然として心臓血管生理学の理解のために一般的に使用されているモデルである。ここ数十年の間に、個々の細胞型を心臓組織から単離するための異なる方法が記載されている。しかし、これらの方法は、ある特定の細胞型の単離にのみ焦点を当て、細胞分析のためにもはや使用することができない他の型の細胞を喪失させる。ここでは、主要な細胞タイプの心臓組織、すなわち心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時かつ高品質の単離を可能にする最適化されたプロトコールが記載されている。これらの細胞型はすべて、異なる実験設定^8,9,10および同じ動物の細胞 - 細胞相互作用の分析に使用することができる。

プロトコル

この調査は、米国国立衛生研究所（NIH Publication No. 85-23 1985）に掲載された実験動物の管理と使用のガイドラインに準拠し、Giessen大学の地域倫理委員会によって承認された。この研究では体重200〜250gの成体雄Wistar系ラットを用いた。

1.オートクレーブ

1. 処置を行う前の少なくとも1日は、すべての手術器具、ピペットチップ、パスツールピペットを121℃で30分間、オートクレーブ処理する。

2.メディアとソリューションの準備

注：手順2.1~2.4の溶液は、単離の1週間前まで調製し、4℃で保存することができますが、単離の日に2.5~2.8の段階で溶液を調製してください。緩衝液および培地の完全なレシピを表1に示す 。すべての培地と溶液を37°Cに加温します。準備を開始する前に水浴。

1. 表1に示す化学物質を4.5LのH ₂ Oに室温（RT）で溶解することにより、Powell培地を調製する。 2.0N NaOHでpHを7.4に調整し、容量を5.0Lにする。溶液を滅菌濾過し、4℃で保存する。
2. M199粉末培地を4.5 LのH ₂ Oに溶解することにより、クレアチン、L-カルニチンおよびタウリン（CCT）培地を調製する。表に記載のHEPES粉末を培地に添加し、15分間混合する。 表1に従って、クレアチン、カルニチン、タウリン、およびアラCを添加する。よく混合し、2.0N NaOHでpHメーターでpHを7.4に調整し、容量を5.0Lにする。滅菌フィルターを4℃で保存する。
3. 10％ウシ胎仔血清（FCS）と2％ペニシリン/ストレプトマイシン（Pen / Strep）を培地M199に添加することにより、線維芽細胞の細胞培養培地を調製する。 DMEMはM199と同様に適しており、線維芽細胞培養にも使用することができる。
4. MV2細胞培養を準備する補助培地の全内容物を製造者の指示に従って基底MV2培地に添加することにより、内皮細胞用の培地を調製する。 5 mLのアリコートをとり、水浴中で37℃に温めます。
5. ウシ血清アルブミン（BSA）0.05gをハンクス平衡塩類溶液（HBSS）50mLに溶解し、200mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液0.5mLを加えて内皮細胞単離バッファーを調製する。これを滅菌濾過し、4℃で保存する。
6. 200 mL〜9.9 mLのPBS 0.1 mLを加えて内皮細胞洗浄バッファーを調製し、4℃で保存する。
7. 5mgのPowell培地に27mgのコラゲナーゼを溶解し、12.5μLの100mM CaCl ₂溶液を加えて、コラゲナーゼ溶液を調製する。水浴中で37℃に温める。
8. 12.5μL、25μL、および120μLの100mM CaCl ₂ solutを添加することにより、心筋細胞の増分Ca ²⁺修復溶液1,2および3を調製する。6mL、6mLおよび12mLのPowell培地にそれぞれ添加した。
9. 各35mm細胞培養皿にラミニンを含有する1mLのプレコーティング培地を添加することにより、単離の1日前に心筋細胞の細胞培養皿を予めコートする。 37℃で一晩細胞培養インキュベーター内でそれらをインキュベートする。

3.磁性ビーズの調製

1. 内皮細胞単離緩衝液0.5mLを氷上の1.5mLサンプルチューブに入れる。
2. 5μL（2×10 ⁶ ）のパンマウスIgG磁気ビーズを添加し、よく混合する。
3. チューブを磁気ラックに1分間置きます。ビーズは磁石の方へチューブの壁に付着する。慎重に1 mLのピペットで上清を除去する。
4. さらに2回洗浄を繰り返し、最終的にビーズを50μL内皮細胞分離バッファーに再懸濁し、使用するまで4℃で保存します。

4.ランゲンドルフ灌流システムの準備

1. クリーンt2Lの蒸留水で潅流することにより、彼はLangendorffシステムを使用した。
2. 5分間50mLのパウエル培地を循環させ、培地を捨てる。
3. 新しいパウエル培地80mLを加える。ガスシリンダーからのガラスパスツールピペットでバブリングすることにより、「カルボゲン」でそれを連続的に灌流する。媒体がシステム内を再循環するようにする。システムは、心臓を灌流する準備が整いました（ 図1A ）。

5.ラットの解剖

1. ラットをヒュームフード下の5Lデシケーターに置き、空気ベントを通して1.5mLの4〜5％イソフルランを加え、ふたを閉める。
   注：液体イソフルランと動物の直接接触を避けるために、動物をデシケータの内側の高い多孔板に置きます。
2. ラットが蓋の反射を失うまで（通常約5分）待ってから、ラットをデシケータから取り出します。頚部脱臼によってラットを安楽死させる。
3. 腹部の皮膚とその下の筋肉を切る真ん中には鋭いはさみを使用しています。その後、ラットの胸骨に垂直に筋肉を切断し、胸郭を開きます。肺と一緒に心臓を取り除き、直ちに氷冷した0.9％NaCl溶液に臓器を置きます。
4. はさみの助けを借りて肺を取り除き、それらを捨てる。結合組織の心臓をきれいにし、腕頭幹の枝で尾状に大動脈を切断する。

コラゲナーゼによる心臓の灌流および消化

1. Langendorff灌流システム（セクション4）の大動脈を介して2組の薄い湾曲した鉗子を用いて心臓をマウントする。心筋が逆行的に灌流されることを確実にするために、第1大動脈枝と大動脈弁との間に灌流システムのカニューレの端部を配置する。クロコダイルクランプを用いて大動脈を固定する。
2. 外科縫合で心臓を固定し、ワニクランプを外す（ 図1B ）。
3. 灌流培地（35mL）を心臓を滴下して（60滴/分; 5mL /分）、残りの血液を洗い流すために、カニューレの弁を開く。この段階で流出物を捨てる。
   注：灌流のどの段階でも気泡が形成されないようにしてください。消化が不完全になり、細胞単離手順が失敗します。
4. ぶら下がっている心臓を収集漏斗（心臓室; 図1B ）に置き、蠕動ポンプを始動させ、灌流培地を収集漏斗から貯蔵器に再循環させる（ 図1A ）。
5. コラーゲナーゼ溶液（ステップ2.8から）を灌流培地に加える。再循環コラゲナーゼ溶液で心臓を30分間灌流する。
   注：このステップは、細胞収率を最適化するために非常に重要です。灌流時間は、コラゲナーゼの活性に依存し、これはバッチに依存して変化し得る。 3〜4バッチのコラゲナーゼを試験してoptiを有するものを見つけるmal活動;再現性のある結果を得るためには少なくとも1年間は十分な、大量の最適なバッチを購入することができます。
6. 消化時間の終わりに、灌流を停止し、はさみのペアを使用してLangendorffシステムから心臓を取り出し、ガラスペトリ皿に置きます。
7. 両方の心房を切り捨て、残りの脂肪組織を除去する。上皮細胞の汚染を避けるために、2対の鉗子の助けを借りて心膜を注意深く剥がす。
   注：必要に応じて、心膜をさらにコラゲナーゼで消化して純粋な心臓上皮細胞を得ることができます。詳細なプロトコールは、本プロトコールの範囲を超えているので、本研究では示されていない。
8. ハサミで心臓を切り、組織チョッパーに入れてください。心臓を2〜3回麻酔し、Langendorff灌流からの消化緩衝液12mL中の細かい組織を再懸濁する。
   注：hをチョップしないでくださいこれは、死んでいる心筋細胞の割合がより高くなるため、過剰な耳である。
9. 細かく切った組織をコラゲナーゼ含有解離培地15mLに移し、5mLの使い捨てプラスチックピペットを用いて再懸濁させることにより時折混合しながら5〜10分間水浴中で消化させる。
10. 消化期間の終わりに、細胞懸濁液を100μmのふるいに通す。組織の破片や消化していない物質は廃棄してください。
11. Langendorff灌流の終わりに、最低1Lの蒸留水で直ちに灌流システムを洗い流す。 100mLの0.1N NaOHを30分間再循環させて系を灌流し、最後に2〜3Lの蒸留水で系を洗い流す。空気を流してシステムを乾燥させ、開口部をパラフィルムで覆う。

7.ラット心臓細胞の単離

1. 心筋細胞の単離と培養
   1. 細胞懸濁液を25xgで1分間遠心分離する（brなしakes）を用いて心筋細胞をペレット化する。心筋細胞は、遠心分離なしに室温で10分間静置することもできる。
   2. 慎重に、内皮細胞および線維芽細胞を含む上清を、新しい50mLチューブ中の使い捨てプラスチックピペットの助けを借りて除去する。
   3. 心筋細胞ペレットをCa ²⁺ 6 mL溶液1（ステップ2.9）に再懸濁する。細胞が低Ca ^2+濃度環境に調整するように1分間おき、細胞懸濁液を25xgで1分間（ブレーキなしで）再び遠心する。
   4. 上清を捨て、細胞ペレットを6mLのCa ²⁺溶液2（ステップ2.9）に再懸濁する。細胞を1分間Ca ^2+の中間濃度に調整し、最後に12mLのCa ²⁺溶液3（ステップ2.9）を細胞に加える。使い捨てプラスチックピペットの助けを借りて混ぜる。
   5. 細胞懸濁液を25xgで1分間遠心分離する。
   6. 上清を捨て、細胞を20mL前に再懸濁する温めたCCT培地。細胞懸濁液1mLを、ラミニン（ステップ2.9）で予め被覆した20個の滅菌35mm細胞培養皿の各々に加え、細胞をCO _2を含まない細胞培養インキュベーター中で2時間付着させる。
      注：心筋細胞は、CO ₂環境下で培養することもできる。しかしながら、この場合、重炭酸塩緩衝系を有する培地を使用すべきである。
   7. 2時間後、培地を新しい2mLのCCT培地と交換して、死んだ細胞を除去する。
      注：細胞は計画された実験の準備ができており、生存細胞の有意な損失なしに典型的な細胞培養インキュベーター（CO _2を含まない）で3日間培養することができます。典型的な健康な棒状の心筋細胞を図2Aに示す 。
2. 内皮細胞および線維芽細胞の単離
   1. 内皮細胞および線維芽細胞を含む上清（ステップ7.1.2から）を250xgで10分間遠心分離する。
   2. 猿を捨てる2mLのサンプルチューブ内の1.5mLの内皮細胞単離バッファーに細胞ペレットを再懸濁する。
   3. マウス抗ラットCD31抗体3μg（1：500）を細胞懸濁液に添加し、4℃で30分間エンドツーエンドの回転でインキュベートする。
      注：最適希釈のための抗体の滴定が推奨されます。この工程は、室温で4℃で実施すべきであり、内皮細胞による抗体の迅速なインターナリゼーションは、低い収量をもたらすであろう。
   4. 先に調製した（セクション3）パン抗マウスIgGビーズを細胞懸濁液に添加し、エンドツーエンド回転で4℃で20分間インキュベートする。
      注：あるいは、マウス抗ラットCD31抗体を磁性ビーズに予め結合させ、次いで細胞懸濁液に添加することができる。しかしながら、これは、細胞懸濁液とのビーズのインキュベーション時間を増加させ、非内皮細胞の非特異的結合の増加をもたらし、したがって他の細胞型のより高い汚染をもたらす可能性がある。
   5. A抗体インキュベーション時間の終わりに、細胞懸濁液を入れたチューブを磁気ラックに置き、内皮細胞に付着した磁気ビーズをチューブの側面に沈殿させるために2分間おきます。
   6. 慎重に1mLピペットを使用して細胞懸濁液（主に繊維芽細胞を含む）の残りを削除し、10mLの線維芽細胞培養培地（ステップ2.3）を含む10cm細胞培養皿に加える。それを5％CO _2を含有する典型的な細胞培養インキュベーターに入れる。手順はステップ7.3に続く。
   7. 内皮細胞を含む磁気ビーズで1mLの洗浄緩衝液をチューブに加える。
   8. チューブにキャップをして磁気ラックから取り出し、慎重に4〜5回上下に静かに振とうしてビーズを再懸濁する。チューブを再び磁気ラックに置き、ビーズをチューブの壁に1分間置くようにし、慎重に洗浄バッファーを除去する。
   9. 洗浄ステップを5〜7回繰り返して、汚染しているnを取り除きます内皮細胞上に存在する。
   10. ビーズに付着した内皮細胞を1mLのMV2内皮細胞培地に再懸濁し、12ウェルプレートの単一ウェルに加え、CO ₂細胞培養インキュベーターでインキュベートする。
   11. 細胞を一晩付着させ、細胞が準コンフルエントになるまで（通常5〜7日）、翌日に培地を交換し、次に2〜3日ごとに交換する。
       注：3〜4日後の典型的な非コンフルエント内皮細胞および単離の7〜10日後のコンフルエントな内皮細胞をそれぞれ図3Aおよび3Bに示す 。次いで、細胞をトリプシン処理し（セクション7.4）、T25細胞培養フラスコに播種することができる。
3. 線維芽細胞の洗浄および培養（工程7.2.6から継続する）
   1. インキュベーションの1時間後、培地を吸引し、予め温めたPBSの適切な容量を加えて細胞培養皿に付着した線維芽細胞を洗浄する。 PBSを吸引し、sを繰り返す最後に予熱した新鮮な線維芽細胞培養培地を加える。
   2. 事前に加温したPBS（前のステップのように）で次の日に付着した細胞を再度洗浄し、予熱した新鮮な培地を加える。 2〜3日おきに培地を交換する。単離の2日目における線維芽細胞の典型的な表現型を図4Aに示す 。
      注：線維芽細胞は通常5-7日以内に準コンフルエントになり、トリプシン処理される準備ができており（セクション7.4）、計画された実験に使用されます。この手順では、通常、純粋な線維芽細胞を95〜99％得る。単離の7日目の線維芽細胞の典型的な表現型を図4Bに示す 。
4. 内皮細胞および線維芽細胞のトリプシン処理
   1. 細胞培養皿から培地を吸引し、細胞を覆うのに十分な予め加温したPBSを加える。
   2. PBSを吸引し、十分なトリプシン-EDTA溶液（それぞれ0.05％および0.02％）を加えて細胞を覆い、th37℃インキュベーターで5分間インキュベートする。
   3. 1mLのピペットの助けを借りて細胞を上下にピペットして細胞を再懸濁し、10％FCSを添加してトリプシン作用を停止する。
   4. 室温で10分間、250×gでの遠心分離により細胞懸濁液をペレット化する。
   5. 適切な量​​の予め温めた細胞培養培地に細胞を再懸濁する。

8.内皮細胞の特徴付け

注：内皮細胞の純度は、Dil-Ac-LDL摂取およびフォンビルブラント因子（vWF）の免疫染色によって決定される。細胞は、蛍光または共焦点顕微鏡によって視覚化される（ 図 3C〜3E）。

1. 内皮細胞によるDil-Ac-LDL摂取
   1. 内皮細胞をトリプシン処理し（ステップ7.4）、12ウェルプレート（約10×10 ⁴細胞/ cm ² ）のガラスカバースリップ上で一晩培養する。
   2. 培地を吸引し、細胞を1mLのpre-wでリンスする武装したHBSS。
   3. HBSSを吸引し、10μg/ mLのDil-Ac-LDLを含む1mLの内皮細胞培地を加え、細胞を37℃のインキュベーターに4時間放置する。
   4. 培地を吸引し、あらかじめ加温したPBSで細胞を3回すすぎ、4％パラホルムアルデヒド（PFA; PBSに溶解）1 mLで固定します。 37℃で20分間、PFAでインキュベートする。
      注：PFAは腐食性があります。 PFA溶液を取り扱う際は常に耐酸性手袋を使用してください。
   5. PFAを吸引し、1mLのPBSで12ウェルプレートのカバースリップ上の細胞をすすぎ、RTで1時間核染色溶液TO-PRO（10μM）と共にそれらをインキュベートする。
      注：適切なフィルターが顕微鏡に利用可能な場合は、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI;1μg/ mL）も使用できます。この場合、インキュベーション時間は10分に減らす必要があります。
   6. 1mLのPBSを含む12ウェルプレートのカバースリップ上の細胞をすすぎ、PBSを吸引し、3回ステップを繰り返す。
   7. Cを取る12ウェルプレートからオーバースリップし、ガラススライド上に1滴のマウント媒体でマウントする。細胞は、蛍光/共焦点顕微鏡下で視覚化する準備が整う。 Dil-Ac-LDLには530-560 nm、TO-PROには640 nm、DAPIには340-380 nmの励起フィルターを使用してください。
2. フォンビルブラント（vWF）染色
   1. ステップ8.1.1で説明したように内皮細胞を培養する。
   2. 培地を吸引し、細胞を予め温めたHBSS1mLですすぐ。その後、ステップ8.1.4で説明したように4％PFAで固定する。
   3. PFAを吸引し、1mLのPBSを含む12ウェルプレートのカバースリップ上の細胞を2回すすぎ、RTで20分間0.1％Triton X-100（PBS中）1mLで細胞を透過性にする。
   4. 透過性溶液を吸引し、ブロッキング溶液（PBS中5％BSA / 5％FCS）で細胞をインキュベートする。
   5. 細胞をウサギ抗vWF抗体（1：100）と4℃で一晩加湿チャンバー内でインキュベートする。 thなしでカバースリップを1つ追加するe一次抗体を陰性対照として用いた。
   6. 1mLのPBSで12ウェルプレートにカバースリップ上の細胞を3回洗浄し、ロバ抗ウサギAlexa Fluor-488抗体（1：500）および核染色溶液TO-PRO（10μM）で1時間インキュベートする。 RTで。
   7. 1mLのPBSを含む12ウェルプレートのカバースリップ上の細胞をすすぎ、PBSを吸引し、3回ステップを繰り返す。
   8. カバースリップを12ウェルプレートから取り出し、ガラススライド上に1滴のマウンティング培地でマウントします。細胞は、蛍光/共焦点顕微鏡下で視覚化する準備が整う。 vWFには490 nm、核染色には640 nmの励起フィルターを使用します。

結果

単離手順は、計画された実験のために使用することができる70〜80％の生存可能な棒状の線条体心筋細胞（ 図2Aおよび2C ）の収率をもたらす。私たちの研究室では、心筋細胞はCa ²⁺シグナル伝達の解析に日常的に使用されています。 図5Aは、Fura-AM（5μM）を負荷した心筋細胞における虚血/再灌流に応答する細胞内カルシウム[Ca ²⁺ ] _i振動を示す。 図5Bは、ATP（100μM）添加後の内皮細胞および線維芽細胞における[Ca ²⁺ ] _iの変化を示す。種々の心臓細胞型における[Ca ²⁺ ] _iの変化を以前に記載されたように分析した。 ^6,11,12

ディスカッション

この記事では、心筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞の単離および培養のための再現可能なプロトコールが記載されている。このプロトコルは、ただ1つの細胞型ではなく、心臓組織、 すなわち心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の主要な細胞型の同時かつ高品質の単離を記載する。単離手順の重要なステップは、心臓組織の適切な消化である。消化が不完全であれば、多数の筋細胞が依然として得られるかもしれませんが、その品質は非常に悪く、大部分は収縮が大きく丸められており（ 図2B ）、実験では価値がありません。さらに、内皮細胞および線維芽細胞の収率も低下する。この問題は消化時間を制御することで解決できます。灌流システムから心臓を取り外す前に、鉗子と指先の助けを借りて心臓の柔らかさをチェックすることができます。組織が依然として目立たない場合心臓はさらに5〜10分間灌流することができる。健康な心筋細胞単離における第2の重要なステップは、単離緩衝液中のCa ²⁺の徐々の回復である。培地中の高濃度のCa ^2+の急速な回復は、丸い心筋細胞を生じる。緩衝液の調製に使用される水の品質は...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
反vWF	サンタクルーズバイオテクノロジー。	SC-14014
塩化カルシウム	メルク	102378
カルニチン	Sigma-Aldrich	C0283
コラゲナーゼII型	Worthington	LS004176
Creatin	Sigma-Aldrich	C0780
D-Glucose	Merck	108342
Dil-Ac-LDL	Thermo Scientific	L3484
EDTA溶液 (0.2 M)	Biochrome AG	L2113
包埋液	Citiflour	AF1-25
内皮細胞培地 MV2	PromoCell	C-22022
子牛胎児血清 (FCS)	Biochrome AG	S0615
Gentamicin	Serva Chemicals	47991
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
イソフルラン	アボット	TU 061219
ラミニン	Roche/Sigma	11243217001
M199 medium	Thermo Scientific	11150059
M199 medium (Powder)	Biochrome AG	T061
Magnesium sulphate	Sigma-Aldrich	63138
Mouse anti-rat CD31 antibody (TLD-3A12)	Thermo Scientific	MA1-81051
NaCl solution (0.9%), Sterile	B. Braun
Pan mouse IgG ビーズ (Dynabeads)	Thermo Scientific	11041
パラホルムアルデヒド (PFA) 4% 溶液	Santa Cruz Biotech.	sc-281692
ペニシリン-ストレプトマイシン	Thermo Scientific	15070-063
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1x	PAN-Biotech	P04-36500
プラスチック消耗品	Greiner Bio-One
塩化カリウム	Merck	4933
リン酸二水素カリウム	Merck	7873
塩化ナトリウム	Merck	6404
水酸化ナトリウム溶液 (2 N)	Merck	109136
滅菌済み濾過システム	Thermo Scientific	5660020
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691
TO-PRO	Thermo Scientific	T3605
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma-Aldrich	T4174
Water, Sterile	B. Braun